Проблема идентификации костных останков в судебно-медицинской практике остается актуальной до настоящего времени. Основным из наиболее достоверных методов идентификации является молекулярно-генетическая экспертиза, однако при ее проведении возникают сложности, связанные в первую очередь с получением ДНК в достаточной степени сохранности и пригодной для дальнейших исследований.

Известно, что степень сохранности ДНК в различных костях скелета человека существенно различается. На сохранность ДНК влияет множество факторов эндогенного и экзогенного характера: активность ДНКаз, влажность, характер почвы, воздействие высоких температур [1—5]. Кроме того, в распоряжение экспертов-генетиков поступают не все кости скелета, нередко это только фрагменты каких-либо костей. При осмотре места захоронения (обнаружения) скелетированные останки в силу различных причин могут извлекаться не полностью, и выбор источника для выделения ДНК в таких случаях весьма ограничен. Таким образом, существует острая необходимость в поиске новых источников получения пригодной для идентификации ДНК из костных останков.

Цель работы — определение пригодности использования фрагментов скелета из захоронений давностью более 50 лет для ДНК-идентификационного анализа.

В лабораторию Республиканского бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ РТ были доставлены костные останки, представленные фрагментами плечевой и височной костей, ключицей, II шейным позвонком (рис. 1 на цв. вклейке) и тремя молярами. После соответствующей подготовки из каждого фрагмента получили костный порошок в количестве около 300—400 мг для последующего выделения ДНК.

Для экстракции ДНК использовали набор реагентов PrepFiler Forensic DNA Extraction Kit («Applied Biosystems», США) согласно стандартному протоколу для выделения ДНК из костей. Материал предварительно инкубировали 18 ч при температуре 56 °С в буфере PrepFiler BTA^™ Lysis Buffer (Applied Biosystems, США) с добавлением DTT и протеиназы К. Анализ матричной активности препаратов проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием количественной энзиматической амплификации ДНК Quantifiler Human DNA Quantification Kit («Applied Biosystems», США). Для типирования полиморфных STR-локусов применяли панели AmpFLSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit и AmpFlSTR Yfiler^™ PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США).

Особенностью данного исследования явилось то, что материал был получен в том числе из II шейного позвонка. Из практики известно, что в позвонках ДНК практически не сохраняется. Тем не менее была предпринята попытка выделить ДНК из указанного объекта. Использовали не весь позвонок, а только зуб, поскольку при осмотре визуально установлена более высокая степень его сохранности по сравнению с телом позвонка.

В результате в препаратах ДНК, полученных из двух моляров, а также из зуба II шейного позвонка, установлена достаточная для дальнейшего анализа концентрация ДНК: 0,020, 0,035 и 0,096 нг/мкл соответственно. В препаратах ДНК, полученных из зуба (моляра) № 3, фрагмента плечевой кости, ключицы и фрагмента височной кости, концентрация ДНК оказалась ниже предельного порога чувствительности используемого метода типирования.

При типировании полиморфных STR-локусов в препаратах ДНК, полученных из моляров №1 и № 2, установили индивидуальный генетический профиль (рис. 2, а, на цв. вклейке). Идентичный профиль получен в препарате ДНК из зуба II шейного позвонка (рис. 2, б, на цв. вклейке). Кроме того, из указанных объектов получили профили ДНК Y-хромосомы, аналогичные друг другу (рис. 3 на цв. вклейке).

Далее предприняли попытку установить условия, способствующие такой высокой степени сохранности ДНК в зубе II шейного позвонка.

В литературе не нашли сведений об использовании позвонков человеческого скелета в качестве источника для извлечения ДНК. Тем не менее существуют анатомические и структурные предпосылки, чтобы использовать II шейный позвонок в качестве исходного материала для выделения ДНК [6].

Два первых шейных позвонка считаются отдельными «единицами» с уникальным строением, которое отличает их от всех последующих позвонков. Первый (I) позвонок — атлант состоит из двух дуг, соединенных костными утолщениями (латеральные массы), и представляет собой кольцо с суставными впадинами, контактирующими с поверхностью соседнего позвонка.

Второй (II) шейный позвонок — осевой — имеет крупный костный шип — зуб. Соединение зуба и кольца атланта, зафиксированное мощным связочным аппаратом, позволяет черепу совершать движения с максимальной свободой в двух плоскостях.

Предположили, что в зубе II шейного позвонка костная ткань сохраняется лучше, чем в теле, благодаря его особому строению. Для подтверждения этого факта провели гистологическое исследование костной ткани зуба и тела II шейного позвонка.

Предварительно зуб и тело позвонка подвергали декальцинации (декальцинирующий раствор электролитный; производитель — ООО «Первая лабораторная компания», Санкт-Петербург), после чего заключали в парафин. Гистологические срезы изготавливали на ротационном микротоме LEICA RM 2235. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Полученные препараты изучали на микроскопе Axio Lab A1. Использовали световую микроскопию при увеличении 200.

Установили, что в гистологических препаратах поперечных срезов зуба II шейного позвонка хорошо различимы остеоны с гаверсовыми каналами (каналы остеона), сохранены и четко контурируются пластинчатые структуры костных балок. Лакуны остеоцитов имеют четкие контуры, остеоциты отсутствуют (рис. 4, а, на цв. вклейке). В гистологических препаратах тела II позвонка различимы остеоны с гаверсовыми каналами, однако контуры костных пластинок нечеткие, имеются многочисленные полости и радиальные трещины. Лакуны остеоцитов контурированы слабо. Между остеонами — многочисленные полости и трещины (рис. 4, б, на цв. вклейке). Таким образом, признаки разрушения костной ткани в зубе II шейного позвонка выражены слабо, а в теле этого позвонка значительны.

Заключение

Результаты проведенного исследования позволяют рекомендовать использовать зуб II шейного позвонка в качестве исходного материала при проведении ДНК-идентификационного анализа. По-видимому, особенности анатомического строения срединного и латеральных атлантоосевых суставов обеспечивают высокую степень сохранности эндогенной ДНК.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.