Судебно-химическое исследование амлодипина

Читать метаданные

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка методики определения амлодипина в тканях органов и крови, применимой в практике судебно-химического анализа. В качестве методов анализа рассмотрены ТСХ, колоночная хроматография обычного давления, ВЭЖХ и ГХ-МС. Амлодипин изолировали из биоматериала, настаивая двукратно с ацетоном по 30 мин при соотношении масс-изолирующего агента и биоматрицы 2:1. Очистку извлеченного аналита проводили в колонке (150×10 мм) сорбента «Силасорб С-18» 30 мкм, элюируя смесью растворителей ацетон-вода (8:2). Предварительную идентификацию осуществляли в тонком слое сорбента на пластинах «Сорбфил», подтверждающую — методами ВЭЖХ и ГХ-МС. Определение методом ГХ-МС проводили в колонке с неподвижной фазой 5% фенил-95% диметилполисилоксан. Способ фрагментации молекул — электронный удар с энергией 70 эВ. Разработаны методики определения амлодипина с использованием ГХ-МС в биоматрицах, которые соответствует критериям линейности, селективности, правильности, прецизионности и стабильности. Пределы обнаружения и количественного определения амлодипина в тканях органа (печень) составляют 0,14 и 0,24 мкг/г, в крови — 0,12 и 0,20 мкг/г соответственно. Методики применены при экспертизе случая отравления амлодипином и позволили определить аналит в ряде органов и крови трупа.

Ключевые слова:

амлодипин

изолирование

идентификация и определение

экспертный материал

Авторы:

Квачахия Л.Л.

Курский государственный медицинский университет

Шорманов В.К.

ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России

ORCID: 0000-0001-8872-0691

Банчукова Е.А.

Бюро судебно-медицинской экспертизы Курской области

Дата поступления:

14.02.2020

Дата принятия в печать:

25.03.2020

Список литературы:

Angeli F, Trapasso M, Signorotti S, Verdecchia P, Reboldi G. Amlodipine and celecoxib for treatment of hypertension and osteoarthritis pain. Expert review of clinical pharmacology. 2018;11(11):1073-1084. https://doi.org/10.1080/17512433.2018.1540299
Tiwaskar M, Langote A, Kashyap R, Toppo A. Amlodipine in the Era of New Generation Calcium Channel Blockers. J Association of Physicians of India. 2018;66(3):59-64.
Bernard S, Mathew M, Senthilkumar KL. Spectrophotometric method of estimation of Amlodipine besylate using hydrotropic solubilization. J Applied Pharmaceutical Science. 2011;1(9):177-180.
Flynn JT, Smoyer WE, Bunchman TE. Treatment of hypertensive children with amlodipine. Am J Hypertension. 2000;13(10):1061-1066. https://doi.org/10.1016/s0895-7061(00)00278-8
Ahsan SF, Khan MF. Physicochemical properties and pharmacology of amlodipine besylate: a brief review. Baqai J Health Sciences. 2017;20(2):27-31.
Rollinger J, Burger A. Physico-chemical characterization of hydrated and anhydrous crystal forms of amlodipine besylate. J Thermal Analysis and Calorimetry. 2002;68(2):361-372.
Amlodipine besylate: sc-203511. Accessed January 20. 2020. https://datasheets.scbt.com/sc-203511.pdf
Шорманов В.К., Квачахия Л.Л. Распределение амлодипина в организме теплокровных животных. Судебно-медицинская экспертиза. 2017;60(1):23-28. https://doi.org/10.17116/sudmed201760123-28
Harris NS. Case 24-2006: a 40-year-old woman with hypotension after an overdose of amlodipine. New Engl J Medicine. 2006;355(6):602-611. https://doi.org/10.1056/NEJMcpc069016
Azendour H, Belyamani L, Atmani M, Balkhi H, Haimeur C. Severe amlodipine intoxication treated by hyperinsulinemia euglycemia therapy. J Emergency Medicine. 2010;38(1):33-35. https://doi.org/10.1016/j.jemermed.2007.11.077
Benson BE, Spyker DA, Troutman WG, Watson WA, Bakhireva LN. Amlodipine toxicity in children less than 6 years of age: a dose-response analysis using national poison data system data. J Emergency Med. 2010;39(2):186-193. https://doi.org/10.1016/j.jemermed.2009.02.016
Gupta B, Kerai S. Amlodipine toxicity complicated by concurrent medications. Korean journal of anesthesiology. 2018;71(6):489-490. https://doi.org/10.4097/kja.d.17.00071
Johansen SS, Genner J. A fatal case of amlodipine poisoning. J Clin Forensic Med. 2003;10(3):169-172. https://doi.org/10.1016/S1353-1131(03)00043-9
Sklerov JH, Levine B, Ingwersen KM, Aronica-Pollack PA, Fowler D. Two cases of fatal amlodipine overdose. J Analytical Toxicology. 2006;30(5):346-350.
Poggenborg RP, Videbæk L, Jacobsen IA. A Case of Amlodipine Overdose. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 2006;99(3):209-212. https://doi.org/10.1111/j.1742-7843.2006.pto_318.x
Cosbey SH, Carson DJL. A fatal case of amlodipine poisoning. J Analyt Toxicol. 1997;21(3):221-222. https://doi.org/10.1093/jat/21.3.221
Шорманов В.К., Квачахия Л.Л., Ртищев К.П. Определение верапамила в плазме крови. Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». 2014;2:107-113.
Шорманов В. К., Квачахия Л. Л., Митрохина А. В., Мяснянкина Е. А. Особенности определения амлодипина в биологическом материале. Судебно-медицинская экспертиза. 2019;62(4):47-54. https://doi.org/10.17116/sudmed20196204147

Закрыть метаданные

Амлодипин (2-[(2-Аминоэтокси)метил]-4-(2-хлорфенил)-1,4-дигидро-6-метил-3,5-пиридин дикарбоновой кислоты 3-этил 5-метиловый эфир) относится к блокаторам кальциевых каналов третьего поколения, широко применяется в медицинской практике в качестве антиангинального и гипотензивного лекарственного средства [1—4]. Это белый кристаллический порошок с температурой плавления 199—201 °C, малорастворимый в воде, легко растворим в диметилсульфоксиде и метаноле, умеренно растворим в этаноле [5, 6].

Амлодипин и ряд других блокаторов кальциевых каналов токсичны для теплокровных животных и могут являться причиной отравлений различной степени тяжести. LD₅₀амлодипина бесилата для крыс составляет 393 мг/кг (самцы) и 686 мг/кг (самки) при пероральном введении, 42 мг/кг при внутрибрюшинном, 678 мг/кг при подкожном, для мышей соответственно 37, 31 и 36 мг/кг. LD₁₀₀ амлодипина бесилата для собак составляет 10 мг/кг. Значения TDL₀ (минимальная опубликованная токсичная доза) при внутривенном введении вещества крысам — 0,1 мг/кг, при пероральном употреблении людьми — 1 или 1,425 мг/кг [7, 8].

Описаны случаи многочисленных отравлений амлодипином людей при ошибочном приеме, завышении дозы с целью лечения, а также при суицидальных попытках [9—12], причем ряд попыток закончился летальным исходом [13—16].

Активное применение амлодипина в медицинской практике в качестве антигипертензивного средства, его токсические свойства и наличие многочисленных случаев летального исхода при отравлениях этим веществом обусловили его важное судебно-химическое значение.

Известны методики определения амлодипина в плазме крови, основанные на изолировании амлодипина этилацетатом, ацетонитрилом или смесями растворителей, а также с использованием твердофазной экстракции [8, 17, 18]. Эти методики характеризуются недостаточно высокой степенью извлечения амлодипина из биоматериала, не всегда позволяют достичь необходимого уровня очистки от эндогенных компонентов биоматриц.

Амлодипин имеет важное судебно-химическое значение, но изолирование из тканей органов и крови, очистка и определение данного соединения в извлечениях остаются недостаточно изученными. В связи с этим необходимы дальнейшие исследования в обозначенных научных направлениях.

Цель исследования — разработка методики определения амлодипина в тканях органов и крови, применимой в практике судебно-химического анализа.

Материал и методы

Исследовали амлодипин с содержанием основного вещества более 97% (ФС 42-0214-07). Из биологического материала амлодипин изолировали путем двукратного настаивания биологического объекта с ацетоном при отношении масс-изолирующего агента биоматериала 2:1 и продолжительности отдельного настаивания 30 мин [8, 18].

Для моделирования схемы сорбционной очистки аналита от эндогенных веществ биологического материала изучали особенности хроматографического поведения амлодипина в полупрепаративной (150×10 мм) колонке сорбента «Силасорб С-18» 30 мкм. В качестве элюентов рассматривали полярные одно- и двухкомпонентные системы растворителей, включающие воду и органический модификатор (ацетонитрил, диоксан, ацетон). Фракции элюата (объем каждой фракции 2 мл) собирали в отдельные градуированные пробирки вместимостью 10 мл. Присутствие аналита в той или иной фракции определяли методом ТСХ, нанося на пластину 5—10 мкл и хроматографируя на пластинах «Сорбфил» ПТСХ-АФ-В-УФ с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1).

Для предварительной идентификации амлодипина использовали нормальнофазную ТСХ на пластинах «Сорбфил» ПТСХ-АФ-В-УФ с применением подвижной фазы бутанол-ацетон (5:5).

Для подтверждающей идентификации амлодипина изучали особенности применения ВЭЖХ и хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС), причем ГХ-МС рассматривали также как возможный метод оценки количественного содержания аналита.

Исследования методом ГХ-МС проводили на газовом хроматографе фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 7890В GC System с масс-селективным детектором модели 5977А.

Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Обнаружение проводили в режиме регистрации по полному ионному току с задержкой на растворитель в 2,9 мин. Диапазон сканирования 40—600 m/z; ток детектора 1500.

При проведении определений методом ВЭЖХ применяли жидкостный хроматограф «Маэстро» производства ООО «Интерлаб» (Россия) с диодно-матричным детектором.

Результаты и обсуждение

Результаты изучения хроматографической подвижности амлодипина представлены в табл. 1.

Таблица 1. Параметры хроматографирования амлодипина методом полупрепаративной обращенно-фазовой хроматографии обычного давления

Подвижная фаза	V_уд.	ω	k׳	N	H
Ацетонитрил	10	3,0	0,67	177	0,852
Ацетонитрил-вода (9:1)	11,2	2,5	0,87	321	0,467
Ацетонитрил-вода (8:2)	13,4	2,2	1,23	593	0,253
Диоксан	11,4	2,2	0,90	429	0,350
Диоксан-вода (9:1)	21	2,9	2,50	839	0,179
Диоксан-вода (8:2)	27	2,8	3,50	1481	0,101
Ацетон	8,2	2,6	0,37	159	0,940
Ацетон-вода (9:1)	16,2	3,7	1,70	306	0,490
Ацетон-вода (8:2)	21	2,3	2,50	1329	0,113

Как свидетельствуют полученные данные, оптимальной для хроматографирования амлодипина в полупрепаративной колонке сорбента «Силасорб С-18» можно считать подвижную фазу ацетон-вода (8:2 по объему). В этих условиях вещество присутствует во фракциях элюата №9—13 (17—26 мл).

Оптимальные условия хроматографирования методом ГХ-МС достигались с использованием кварцевой капиллярной колонки НР-5 ms Ultra inert длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной слоя неподвижной фазы 0,25 мкм. Неподвижная фаза — 5%фенил-95%диметилполисилоксан. Начальная температура термостата колонки составляла 70 °C, она поддерживалась в течение 2 мин, затем осуществляли нагрев до 290 °C со скоростью 12,5 °C в минуту. Выдерживали при конечной температуре 2 мин. Температура инжектора составляла 250 °C, интерфейса детектора 290 °C, квадруполя 150 °C.

В качестве газа-носителя использовали гелий. Подачу газа-носителя производили со скоростью 1 мл/мин.

Время удерживания (t_R) амлодипина в используемой капиллярной колонке составляло 11,266 мин. Значения коэффициента емкости (k׳) и числа теоретических тарелок (N) были соответственно 6,664 и 1 515 923.

Масс-спектр амлодипина включал набор характерных для структуры данного соединения осколков (положительно заряженные частицы) с массами 44, 77, 120, 148, 165, 208, 236, 254, и 297, 347, 377 m/z. Основным являлся ион 297 m/z.

Метод ГХ-МС позволяет надежно идентифицировать амлодипин по времени удерживания вещества в капиллярной колонке и набору сигналов характерных осколков в его масс-спектре. Предел обнаружения амлодипина в хроматографируемой пробе составил 8,0·10^–1¹ г.

Оптимальные условия хроматографирования методом ВЭЖХ достигались с использованием колонки (150×4,6 мм) ZORBAX Eclipse Plus C18 endcapped 5 мкм. Подвижной фазой являлась смесь ацетонитрил-фосфатный буферный раствор pH 9,0 (5:5 по объему). Температура колонки составляла 20 °C, скорость подачи элюента 1000 мкл/мин, длина волны, при которой проводили измерения оптической плотности, — 250 нм.

Время удерживания (t_R) амлодипина в используемой колонке обращеннофазового сорбента составляло 10,846 мин, значения коэффициента емкости (k׳) и числа теоретических тарелок (N) — соответственно 8,684 и 5228.

Метод ВЭЖХ позволяет идентифицировать амлодипин по характерному времени удерживания вещества в колонке сорбента. Предел обнаружения амлодипина в хроматографируемой пробе составил 6,0·10^–1⁰ г.

Методика определения амлодипина в биологическом материале

Изолирование из ткани трупного органа. 25 г мелкоизмельченной (максимальный размер частиц не более 0,5 см) биоматрицы настаивали дважды по 30 мин с порциями ацетона массой 50 г каждая при перемешивании. Ацетоновые извлечения объединяли, пропускали через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного натрия сульфата толщиной 1,5—2,0 см, слой сульфата натрия промывали 20 г ацетона. Фильтрат и промывную жидкость объединяли и испаряли растворитель в токе воздуха при температуре 18—22 °C.

Изолирование из крови. 25 г крови настаивали дважды по 30 мин с порциями ацетона массой 50 г каждая при перемешивании. Ацетоновые извлечения отделяли фильтрованием через бумажный фильтр, объединяли, пропускали через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного натрия сульфата толщиной 1,5—2,0 см, слой сульфата натрия промывали 20 г ацетона. Фильтрат и промывную жидкость объединяли и испаряли растворитель в токе воздуха при температуре 18—22 °C.

Очистка. Остаток, полученный по завершении стадии изолирования, неоднократно (трижды по 3 мин) обрабатывали порциями ацетона по 15 мл, извлечения отделяли, объединяли. Объединенное ацетоновое извлечение упаривали в токе воздуха при температуре 18—22 °C до полного удаления растворителя. Затем остаток растворяли в 4 мл ацетона и доводили до 5 мл водой; 2 мл полученного раствора вводили в колонку (490×11 мм) сорбента «Силасорб С-18» 30 мкм.

Элюировали смесью ацетон—вода (8:2). Элюат собирали фракциями по 2 мл. Фракции 9—13 объединяли, элюат удаляли в токе воздуха при температуре 20—22 °C. Остаток растворяли в 10 мл ацетона. В фарфоровые чашки (№1—3) помещали соответственно 0,1—2,0; 5,0 и 1,0—2,5 мл полученного раствора и испаряли растворитель.

Предварительная идентификация. Остаток в чашке №1 растворяли в 0,4—0,6 мл ацетона и наносили на линию старта пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-В-УФ. Хроматографировали, используя подвижную фазу бутанол-ацетон (5:5), в присутствии свидетеля. Хроматограммы проявляли, облучая их УФ-лучами (λ=254 нм) и идентифицировали аналит по величине Rf (0,51±0,03).

Подтверждающая идентификация методом ВЭЖХ. Остаток в чашке №2 растворяли в 5 мл ацетонитрила, переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили содержимое колбы фосфатным буферным раствором pH 9,0 до метки. Далее 4 мкл полученного раствора вводили в хроматограф. Хроматографировали, используя подвижную фазу ацетонитрил — фосфатный буфер pH 9,0 (5:5), по приведенной ранее схеме.

Идентификацию амлодипина осуществляли по значению времени его удерживания в аналитической колонке. Обнаружили совпадение времени удерживания анализируемого вещества методом ВЭЖХ с соответствующим параметром вещества-стандарта.

Подтверждающая идентификация методом ГХ-МС. Остаток в чашке №3 растворяли в 4 мл хлороформа. Затем 2 мкл раствора вводили в хроматограф «Agilent Technologies» (США) модели 7890В GC System с масс-селективным детектором модели 5977А и проводили определение по описанной ранее схеме.

Идентификацию амлодипина осуществляли по времени удерживания вещества и специфическому набору сигналов положительно заряженных частиц в масс-спектре.

Полученные данные свидетельствуют о совпадении масс-спектров исследуемого и стандартного веществ более чем на 86%.

Количественное определение. Содержание амлодипина оценивали методом ГХ-МС по площади хроматографического пика с использованием уравнения градуировочного графика.

Результаты количественного определения амлодипина в тканях внутреннего органа (печень) и крови разработанными методиками представлены в табл. 2.

Таблица 2. Количественное определение амлодипина в ткани печени методом ГХ-МС после очистки в колонке сорбента

Внесено вещества, мг в 25 г биоматрицы	Найдено, % (n=5; p=0,95)
Внесено вещества, мг в 25 г биоматрицы	X	S	S_r	S X	∆x	ε
Печень
25,0	83,44	2,664	3,193	1,19	3,31	3,97
12,5	83,21	3,300	3,965	1,48	4,10	4,93
5,0	83,05	3,948	4,754	1,77	4,91	5,91
2,5	82,64	4,533	5,485	2,03	5,64	6,82
0,625	82,32	5,608	6,813	2,51	6,97	8,47
Кровь
25,0	87,15	2,671	3,064	1,19	3,32	3,81
12,5	86,89	3,040	3,499	1,36	3,78	4,35
5,0	86,73	3,760	4,335	1,68	4,67	5,39
2,5	86,51	4,002	4,627	1,79	4,97	5,74
0,625	86,06	5,343	6,209	2,39	6,64	7,72

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании аналита в биоматрице 0,0025—0,1% предлагаемые методики позволяют определить в тканях органа (печень) (82,32—83,44)±(3,31—6,97)%, а в крови — (86,06—87,15)±(3,32—6,64)% анализируемого вещества.

Разработанные методики определения амлодипина в тканях органов и крови с помощью ГХ-МС валидированы по линейности, селективности, прецизионности и правильности. Значения пределов обнаружения и определения для тканей органа (печень) составляют 0,14 и 0,24 мкг/г, для крови — 0,12 и 0,20 мкг/г соответственно.

Методики применили для идентификации и количественного определения амлодипина при проведении судебно-химической экспертизы случая отравления данным соединением.

Труп гр-ки А. 1954 года рождения нашли в собственной квартире. Рядом находилась пустая упаковка от таблеток амлодипина по 10 мг. При вскрытии в полости желудка и двенадцатиперстной кишки обнаружили мутноватую жидкость без выраженного запаха. Внутренние органы не имели признаков морфологических изменений. Для судебно-химического исследования доставили печень, почки, желудок с содержимым, двенадцатиперстную кишку с содержимым и кровь.

Провели исследование в соответствии с предлагаемыми методиками. Взяли 25 г мелкоизмельченного (дисперсность 0,2—0,5 см) плотного биологического объекта или крови, обработали порцией ацетона, количество которого по массе (50 г) в 2 раза превышало количество исследуемой биоматрицы. Далее изолирование, очистку в колонке сорбента, идентификацию и количественное определение методом ГХ-МС осуществляли по приведенной ранее схеме.

В результате исследования в указанных органах трупа и крови обнаружили и идентифицировали амлодипин.

На рис. 1 и 2 представлены хроматограммы и масс-спектры стандарта амлодипина и амлодипина, выделенного из трупного материала (ткань печени и кровь).

Рис. 1. Хроматограммы амлодипина (ГХ-МС).

а — стандартный образец; б — вещество, изолированное из крови; в — вещество, изолированное из желудка с содержимым.

Рис. 2. Масс-спектры амлодипина.

Как свидетельствуют полученные данные, масс-спектры анализированных и стандартных веществ совпали на 88—94%.

Количественная оценка содержания амлодипина в трупном материале приведена в табл. 3.

Таблица 3. Определение амлодипина в экспертном материале

Биологический объект (трупный орган или биожидкость)	Навеска биологического объекта, г	Найдено амлодипина, мг
Биологический объект (трупный орган или биожидкость)	Навеска биологического объекта, г	в исследуемой навеске	в 100 г биологического объекта
Печень	25	0,28	1,12
Почки	25	0,043	0,172
Желудок с содержимым	25	18,26	73,04
Двенадцатиперстная кишка с содержимым	25	0,32	1,28
Кровь	20	0,068	0,34

Как видно из данных табл. 3, наибольшее количество вещества находилось в желудке с содержимым, двенадцатиперстной кишке с содержимым и крови, в меньшей степени — в печени и почках.

Таким образом, разработанная методика может быть использована при экспертизе случаев отравления амлодипином.

Выводы

1. Для изолирования амлодипина из биологического материала предложен ацетон.

2. Обоснована целесообразность применения для очистки амлодипина, изолированного из биологических матриц, полупрепаративной колоночной хроматографии с использованием сорбента «Силасорб С-18» 30 мкм и подвижной фазы ацетон-вода (8:2).

3. Для идентификации и количественного определения аналита в биоматрицах предложены ТСХ, ВЭЖХ и ГХ-МС. Разработаны и валидированы методики судебно-химического исследования амлодипина.

4. Значения пределов обнаружения и определения аналита данными методиками составили соответственно в ткани печени 0,14 и 0,24 мкг/г, в крови — 0,12 и 0,20 мкг/г. Показана возможность применения разработанных методик для исследования экспертного материала.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.