алло-ТГСК — аллогенная трансплантация стволовых кроветворных клеток

КМ — костный мозг

КОЕф — колониеобразующие единицы фибробластов

ММСК — мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки

МСК — мезенхимальные стволовые клетки

СМ — стромальное микроокружение

Во взрослом костном мозге (КМ) кроветворение поддерживается стромальным микроокружением (СМ), образующимся из мезенхимальных стволовых клеток (МСК), их потомков колониеобразующих единиц фибробластов (КОЕф), предшественников промежуточной степени зрелости и специализированных дифференцированных клеток. Стромальная система КМ включает эндотелиальные клетки, адипоциты, гладкие мышечные клетки, ретикулярные клетки и остеобласты [1, 2]. МСК образуют отдел стволовых клеток, способных дифференцироваться во все элементы СМ [3]. Более зрелые потомки МСК — КОЕф могут поддерживать кроветворение и дифференцироваться в остеогенном и адипогенном направлениях [4, 5]. СМ обладает более высокой, чем кроветворная ткань, радио- и химиорезистентностью, что, возможно, связано с низкой интенсивностью его самообновления [6].

У больных с гематологическими заболеваниями повреждается СМ [7, 8]. Лечение таких больных, включающее высокие дозы цитотоксических препаратов, также влияет на стромальные клетки-предшественники [9, 10]. Изменения в СМ могут быть одной из причин ухудшения кроветворения у больных после аллогенной трансплантации стволовых кроветворных клеток (алло-ТГСК) [11—13].

Данное исследование посвящено изучению элементов отдела МСК — мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) [14] и КОЕф у больных после алло-ТГСК.

Образцы КМ. Проанализированы образцы КМ 25 доноров (14 мужчин и 11 женщин) в возрасте от 12 до 56 лет (медиана 32 года). Все образцы КМ получены во время эксфузии донорского КМ для аллогенной трансплантации в отделении высокодозной химиотерапии гемобластозов и трансплантации КМ ГНЦ МЗ РФ после подписания донорами информированного согласия.

В исследование включили 36 больных в возрасте от 17 до 60 лет (медиана 33,5 года), из них 4 — хроническим миелолейкозом (ХМЛ), 11 — острым миелобластным лейкозом, 10 — острым лимфобластным лейкозом, 3 — апластической анемией и 8 больных с другими гематологическими заболеваниями. КМ получали в момент плановой диагностической пункции после подписания информированного согласия пациента. Плановые диагностические пункции проводили до начала кондиционирования и через 30, 60, 90, 120, 180, 360 дней, 1,5 и 2 года после алло-ТГСК.

Культивирование ММСК. Ядросодержащие клетки из суспензии клеток КМ выделяли в среде альфа-МЕМ («ICN», США) с 0,1% раствором метилцеллюлозы («Sigma», США) и культивировали по 2,5—3·10⁶ клеток на флакон с дном площадью 25 см² в среде альфа-MEM с 10% раствором эмбриональной телячьей сыворотки («Hyclone», США), 2 мМ L-глутамина (ICN, США), 100 ед/мл пенициллина («Ферейн», Россия), 50 мкг/мл стрептомицина («Ферейн», Россия). После формирования конфлуентного монослоя клетки снимали 0,25% раствором трипсина, приготовленного на 0,02% EDTA («ICN», США) в физиологическом растворе («Sigma», США), и рассаживали из расчета 4·10³ клеток на 1 см² поверхности дна флакона. Культуру ММСК вели до 5-го пассажа.

Анализ КОЕф. Ядросодержащие клетки КМ культивировали по 1·10⁶, 5·10⁵ и 2,5·10⁵ на флакон с дном площадью 25 см² в среде альфа-MEM с 20% эмбриональной телячьей сывороткой («Hyclone», США), 2 мМ L-глутамина («ICN», США), 100 ед/мл пенициллина («Ферейн», Россия), 50 мкг/мл стрептомицина («Ферейн», Россия) в течение 14 дней. Подсчет колоний проводили под бинокулярной лупой («Opton», Германия) после окрашивания в 1% кристаллвиолете на 20% метаноле.

Анализ поверхностного фенотипа ММСК. Фенотипирование ММСК доноров и больных проводили на 0—4-м пассаже культуры методом проточной цитофлуориметрии.

Клетки инкубировали с моноклональными мышиными антителами против антигена CD10⁵ («BD Pharmingen», США), FSP (Fibroblast Surface Protein, «Sigma», США) в течение 30 мин при температуре 40 °С, отмывали 2 раза фосфатным буфером, а затем окрашивали вторыми антителами, конъюгированными с флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) (goat-anti-mouse-FITC conjugated IgG/IgM, «BD Pharmingen», США) в течение 30 мин при температуре 40 °С и также отмывали 2 раза фосфатным буфером. Кроме того, клетки напрямую окрашивали FITC или PE (фикоэритрин) — конъюгированными антителами против антигенов HLA-DR (DACO), CD45 («Sigma»), CD146 (MCAM), CD10⁵ (Endoglin, SH2), CD59 (протектин), CD73 (SH3, SH4), CD90 (Thy-1), CD31 (PECAM-1), NGFR, CD34 и CD14 («BD Pharmingen»). Уровень неспецифического связывания антител учитывали с помощью изотипического контроля, для чего клетки инкубировали с мышиными иммуноглобулинами класса G1 («BD Pharmingen», США). Для оценки жизнеспособности анализируемых клеток использовали 7-аминоактиномицин Д (7-AAD, «Sigma», США).

Анализ интенсивности флюоресценции выполняли на приборе FACSСanto II («BD Biosciences», США), полученные результаты обработаны в программе BD FACSDiva software 6.1.3.

Анализ принадлежности ММСК. Молекулярно-генетическое определение химеризма проводили при помощи анализа микросателлитных повторов (STR) в генах печеночного цитохрома CYP19A1 (CYAR) и фибриногена альфа (FGA), используя пары праймеров CYARD: GCAGGTACTTAGTTAGCTAC, CYARR: TTACAGTGAGCCAAGGTCGT и FIBRAD: GCCCCATAG GTTTTGAACTCA, FIBRAR: TGATTTGTCTGTAATTGCCAGC.

Полимеразную цепную реакцию проводили в стандартной реакционной смеси в режиме: 94 °С — 1 мин, 60 °С — 1 мин, 72 °С — 1 мин; 30 циклов. Продукты реакции анализировали при помощи электрофореза в 6% полиакриламидном геле или методом фрагментного анализа с флюоресцентной меткой на приборе ABI Prism 3100 Avant (США).

Статистический анализ проводили по критерию t Стьюдента

Реципиентское происхождение ММСК после алло-ТГСК. У 7 больных исследовано происхождение ММСК до и через 60 и 180 дней после алло-ТГСК с помощью 2 стандартных маркеров — микросателлитных повторов в генах печеночного цитохрома и α-фибриногена. Установлено, что после алло-ТГСК ММСК у всех пациентов сохраняется генотип реципиента. Ни в одном случае не обнаружено ММСК с генотипом донора.

Изучение иммунофенотипа ММСК. ММСК больных иммунофенотипированы до алло-ТГСК и через 120—180 дней после алло-ТГСК. В таблице

По иммунофенотипу изученные клетки соответствуют стандарту, принятому для ММСК [15]. Не выявлено существенных различий по экспрессии поверхностных маркеров на ММСК до и после алло-ТГСК. Таким образом, можно утверждать, что в работе изучали аналогичные популяции клеток до и после алло-ТГСК. Очевидно, что интенсивная полихимиотерапия не влияет на экспрессию поверхностных маркеров стромальными клетками-предшественниками.

Параметры роста ММСК. Ростовые характеристики ММСК больных после алло-ТГСК изучали в течение 5 пассажей и сравнивали с теми же характеристиками у здоровых доноров КМ. Определяли суммарную продукцию ММСК за 5 пассажей (рис. 1).

У доноров-женщин суммарная продукция клеток коррелирует с возрастом (коэффициент корреляции –0,7), т.е. чем старше донор-женщина, тем меньше суммарная продукция клеток. У доноров-мужчин такой четкой связи не наблюдается (коэффициент корреляции –0,4). Подобная закономерность полностью отсутствует у больных.

В совокупности можно утверждать, что ростовые свойства ММСК, их пролиферативный потенциал и способность к обновлению сильно нарушаются после процедуры алло-ТГСК. Очевидно, эта категория стромальных предшественников повреждается в результате собственно заболевания, а лечение еще больше усугубляет возникшие изменения.

Концентрация КОЕф. Более зрелые, чем ММСК, клетки-предшественники (КОЕф) также повреждены у больных с гематологическими заболеваниями. Концентрация КОЕф в КМ у больных до трансплантации достоверно снижена (р=0,01) по сравнению с таковой у доноров (рис. 4).

В работе охарактеризованы 2 категории клеток-предшественников СМ — ММСК и КОЕф в КМ больных с гематологическими заболеваниями до и после алло-ТГСК. Показано, что ММСК, полученные из КМ больных после алло-ТГСК, имеют генотип реципиента. Собственное происхождение ММСК у больных после алло-ТГСК подтверждает данные других исследователей [16, 17]. На мышиной модели показано, что стромальные клетки-предшественники не способны формировать полноценное микроокружение после трансплантации в виде одноклеточной взвеси [18], однако по поводу судьбы ММСК человека данные литературы противоречивы. Существует мнение, что ММСК могут быть котрансплантированы совместно со стволовыми кроветворными клетками при аллогенной трансплантации КМ и в этом случае улучшать приживление донорских стволовых клеток [19, 20]. Однако наши данные и результаты других исследований показывают, что ММСК принадлежат пациенту. Это свидетельствует о том, что при внутривенном введении клеток КМ стромальные клетки не способны к приживлению. Кроме того, эти данные позволяют утверждать, что в работе изучены стромальные клетки-предшественники именно больных.

Стандартный иммунофенотип исследованных ММСК является доказательством того, что в работе изучали именно стромальные клетки-предшественники КМ, и это соответствует данным других авторов [21, 22].

Культивирование ММСК дает возможность более глубоко изучить свойства этих стромальных предшественников. Показано, что заболевание само повреждает ММСК, а лечение усугубляет возникшие изменения. К этим изменениям относятся уменьшение суммарной продукции клеток, увеличение времени культивирования и снижение пролиферативного потенциала (способности к прохождению 5 пассажей) ММСК. Данные изменения являются необратимыми, по меньшей мере в течение 2 лет после алло-ТГСК. Таким образом, полученные данные согласуются с данными других авторов о том, что ММСК повреждаются у больных с гематологическими заболеваниями, что связано как с самим заболеванием [7], [8], так и с химиотерапией [23].

На мышиной модели показано, что МСК не чувствительны к воздействию химиотерапевтических препаратов [10]. Известно, что стволовые кроветворные клетки не подвержены воздействию проникающих в клетку агентов благодаря очень высокому уровню экспрессии генов множественной лекарственной устойчивости [24]. Можно предполагать, что МСК используют аналогичный механизм защиты. В работе изучали ММСК, которые с очевидностью повреждаются при алло-ТГСК; это указывает на то, что ММСК не являются истинно стволовыми клетками. Восстановление СМ происходит очень медленно, двух лет оказывается недостаточно для его полной регенерации после алло-ТГСК. Полученные результаты подтверждают данные о том, что популяция ММСК гетерогенна [25, 26] и не содержит или содержит очень небольшое количество истинно МСК.

КОЕф — более зрелые, чем ММСК, клетки-предшественники, отвечающие за построение кроветворного микроокружения [27], сильнее повреждаются у больных после алло-ТГСК. Концентрация КОЕф в КМ не восстанавливается в течение двух лет после алло-ТГСК. Эти данные свидетельствуют, что повреждения затрагивают предшественников КОЕф. Иерархическая структура стромальных предшественников человека не описана. Полученные результаты позволяют предположить, что КОЕф являются потомками ММСК.

Впервые проведено исследование СМ у больных с гематологическими заболеваниями до и после алло-ТГСК, затрагивающее 2 категории мезенхимальных клеток-предшественников. Данные, полученные в работе, являются основой для дальнейшего углубленного изучения роли СМ в регуляции кроветворения.

Благодарности

Работа поддержана грантом РФФИ 12-04-00457 а. Авторы выражают глубокую благодарность всем сотрудникам отделения высокодозной химиотерапии и трансплантации костного мозга ГНЦ МЗ РФ.