АГ — артериальная гипертония
АД — артериальное давление
БМИ — болезнь минимальных изменений
БМК — базальная мембрана клубочков
БТШ-27 — 27-й белок теплового шока
ГН — гломерулонефрит
ГС — гломерулосклероз
ДП — дисфункция подоцитов
МН — мембранозная нефропатия
МС — мочевой синдром
НС — нефротический синдром
НУ — нефринурия
ОНС — остронефритический синдром
ПД — подоциты
ПУ — протеинурия
ПЦУ — подоцитурия
СКФ — скорость клубочковой фильтрации
ФСГС — фокальный сегментарный гломерулосклероз
ХГН — хронический гломерулонефрит
VEGF — фактор роста эндотелия сосудов
WT-1 — антиген опухоли Вильмса
α-ФНО — α-фактор некроза опухоли
В последние годы в экспериментальных моделях хронического гломерулонефрита (ХГН), а также в клинических исследованиях показано, что повреждение подоцита (ПД) — ключевого компонента клубочкового фильтрационного барьера — является универсальным механизмом развития протеинурии (ПУ) и формирования гломерулосклероза (ГС) независимо от морфологического варианта нефрита [1]. ПД формируют щелевидную мембрану, участвуют в регуляции внутриклубочкового гидростатического давления, поддерживают структуру и функцию соседних клеток и базальной мембраны клубочков (БМК). Типичными изменениями ПД, а при повреждении являются сглаживание его ножек с распластыванием цитоплазмы вдоль БМК, отщепление отдельных структурных белков [2]. При более длительном воздействии на ПД повреждающих факторов активируются механизмы апоптоза, наблюдается отслоение подоцитов от БМК с их экскрецией в мочевое пространство (подоцитурия — ПЦУ), образуются дефекты фильтрационного барьера, что лежит в основе развития ПУ и нефротического синдрома (НС) [3]. В связи с ограниченной способностью ПД к пролиферации их потеря более 20% (подоцитопения) способствует формированию синехий между капиллярными петлями и капсулой клубочка и в конечном счете ведет к развитию ГС и ухудшению функции почек [4].
В свете общепринятой концепции повреждения ПД как детерминанты развития ПУ и прогрессирующего повреждения клубочков особое значение приобретают методы неинвазивной оценки дисфункции ПД с использованием мочевых тестов.
Цель исследования: у больных с различными вариантами ХГН оценить выраженность повреждения ПД по уровню подоцитарных маркеров в моче и определить значение этих показателей как критериев активности и прогноза заболевания.
Материалы и методы
Обследовали 75 больных с различными формами ХГН: 37 (49%) женщин и 38 (51%) мужчин в возрасте от 18 до 74 лет, средний возраст 41,6 (27; 55) года. Контрольную группу составили 10 здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными пациентами. Морфологически диагноз подтвержден у 48 больных: у 14 выявлен мезангиопролиферативный ГН, у 5 — мезангиокапиллярный ГН, у 10 — мембранозная нефропатия (МН), у 5 — болезнь минимальных изменений (БМИ), у 5 — фокальный сегментарный ГС (ФСГС), у 9 — нефросклероз.
Результаты исследования молекулярных медиаторов сравнивали в 3 группах больных, различающихся по степени активности ХГН и выраженности нарушений функции почек.
В 1-ю группу вошли 20 пациентов с неактивным течением заболевания: 15 с латентным ХГН, 5 с полной ремиссией ХГН после успешной иммуносупрессивной терапии. У больных этой группы выявлялась ПУ около 1 (0,76 (0,27; 1,1)) г/сут, у 10 из них изолированная, а у остальных — в сочетании с умеренной эритроцитурией. Функция почек у 13 больных оставалась сохранной, у 7 отмечалось стойкое снижение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) до 62 (55; 71) мл/мин и повышение концентрации креатинина в сыворотке крови до 1,4 (1,3; 1,89) мг/дл. Артериальная гипертония (АГ) при артериальном давлении (АД) от 150/100 до 220/120 мм рт.ст. наблюдалась у 6 пациентов.
Во 2-ю группу включены 23 пациента с выраженным мочевым синдромом (МС): 18 больных, у которых ХГН изначально протекал с МС и персистировал в течение 2 (1; 7) мес, а также 5 больных, у которых МС был результатом неполной ремиссии Н.С. Клинически 2-я группа больных ХГН характеризовалась ПУ 1—3 (2,0 (1,74; 3,0) г/сут; у 11 больных выявлялась изолированная ПУ субнефротического уровня, у 12 — ПУ сочеталась с умеренной эритроцитурией. Функция почек у 13 больных была в пределах нормы, у 10 отмечалось стойкое нарушение функции почек — СКФ 44,5 (36; 76) мл/мин, креатинин 1,72 (1,34; 2,13) мг/дл. АГ при АД от 150/90 до 180/100 мм рт.ст. выявлялась у 10 больных.
В 3-ю группу вошли 30 больных с НС, включая 16 с умеренным НС (ПУ 7,51 (4,8; 9,16) г/сут) и 7 с тяжелым НС: анасарка, гипоальбуминемия менее 20 г/л, ПУ 11,6 (8,35; 18,6) г/сут; у 7 пациентов НС сочетался с остронефритическим синдромом (ОНС): АГ, эритроцитурия, преходящее нарушение функции почек — креатинин от 1,27 до 3,22 (1,71 (1,35; 1,99)) мг/дл. У 8 больных 3-й группы наряду с сохраняющейся активностью ХГН — ПУ 7,52 (4; 12,0) г/сут — отмечалась стойкая дисфункция почек — СКФ 43 (35; 67) мл/мин, креатинин 1,8 (1,41; 2,44) мг/дл, а также высокая АГ (АД максимально до 220/100 мм рт.ст.).
Наряду с общеклиническим обследованием методом непрямого иммуноферментного анализа (ELISA) проведена оценка уровней в моче следующих показателей: нефрина (основного структурно-функционального белка подоцитов), интерлейкина-6 (ИЛ-6; ведущего провоспалительного цитокина), белка теплового шока-27 (БТШ-27; защитного белка-шаперона клеточного происхождения), каспазы-9 (маркера апоптоза), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), регулирующего проницаемость клубочкового фильтра, а также выживаемость ПД.
Помимо того, исследована ПЦУ методом цитофлоуметрии осадка мочи с подсчетом количества ПД (целых клеток и их фрагментов), меченных антителами к подокаликсину (Pdx).
Исследуемые показатели экскреции стандартизованы по концентрации креатинина в утренней порции мочи.
В ткани почки с использованием иммуногистохимического метода оценили выраженность подоцитопении, проведя подсчет ПД, меченных антителами к их ядерному маркеру — антигену опухоли Вильмса (WT-1). В качестве контроля использованы образцы ткани почек, удаленных в связи с урологическими причинами, при исследовании которых не выявлено патологии клубочков.
Статистический анализ данных проводили с применением стандартных методик с помощью программы Statistica 6,0. Для сравнения 2 групп использовали непараметрический критерий Манна—Уитни. Корреляционный анализ проводили методом ранговой корреляции Спирмена.
Результаты
Мы изучили экскрецию с мочой основных маркеров ДП, в частности структурно-функционального белка нефрина. Уровень нефринурии (НУ) в группах больных c активными протеинурическими формами ХГН (2-я и 3-я группы) оказался выше, чем у больных с неактивным течением заболевания и у здоровых лиц, — 14,2 (9,45;22,5), 7,9 (1,7; 9,5) и 7,25 (5,4; 9,8) нг/мл соответственно (p<0,05). У больных с НС (3-я группа) НУ была значительно выше, чем у пациентов с субнефротической ПУ (2-я группа) (табл. 1). Установлена достоверная прямая корреляция (Rs=0,27; p<0,05) между НУ и суточной ПУ у больных ХГН 2-й и 3-й групп. По нашим данным, у больных с активным течением ХГН при наличии АГ величина НУ достоверно выше, чем у пациентов с нормальным АД, — 16,1 (12,5; 27,8) и 10 (8,4; 14,6) нг/мл соответственно (p<0,01). Выявлена прямая корреляция между НУ и средним АД (2-я и 3-я группы Rs=0,3; p=0,032).
Наряду с уровнем в моче нефрина — специфического для ПД белка мы изучили экскрецию с мочой самих П.Д. Подобно Н.У. у больных с ХГН и НС (3-я группа) этот показатель достоверно превышал таковой у пациентов с субнефротической ПУ (2-я группа) (см. табл. 1). Наиболее высокие уровни ПУ отмечены у больных с тяжелым НС — 16 (3,2; 38,3) кл/мкл против 6,8 (1,5; 14,5) кл/мкл у пациентов с умеренным НС (p<0,05).
Помимо общепринятых маркеров повреждения ПД мы изучили экскрецию с мочой БТШ-27 — одного из основных внутриклеточных защитных белков. Его синтез индуцируется в клетках, в том числе в ПД, в ответ на повреждение, отражая степень клеточного «стресса». Уровень БТШ-27 в моче больных ХГН увеличивался от 1-й к 3-й группе (см. табл. 1). У больных с тяжелым НС уровень мочевой экскреции БТШ-27 достоверно выше, чем у пациентов с умеренным НС, — 1,35 (0,93; 4,02) и 0,84 (0,71; 1,81) нг/мл соответственно (p<0,05). Установлена достоверная прямая корреляция между уровнем БТШ-27 в моче больных с НС и суточной ПУ (Rs=0,40; p<0,05) и обратная — между уровнем в моче БТШ-27 и альбумином в сыворотке крови (Rs=–0,36; p<0,05).
Различия между морфологическими формами ХГН по НУ и ПЦУ, а также экскреции БТШ-27 с мочой недостоверны, решающую роль играла выраженность НС.
Между изученными нами показателями (ПЦУ, НУ, уровень в моче БТШ-27) выявлены достоверные корреляции, наиболее сильные у больных с НС, что свидетельствует в пользу их значения как патогенетически связанных маркеров ДП (табл. 2).
Помимо маркеров повреждения ПД мы оценили экскрецию с мочой одного из основных провоспалительных цитокинов — ИЛ-6. У пациентов с НС (3-я группа) уровень экскреции ИЛ-6 с мочой оказался достоверно выше, чем у пациентов 2-й группы без НС, — 9,97 (1,95; 25,6) и 5,44 (1,3; 12,8) нг/мл соответственно (p<0,05). При этом нами установлены достоверные прямые корреляции между величиной ПЦУ, мочевыми показателями БТШ-27 и ИЛ-6 (Rs=0,39; p<0,05 и Rs=0,2; p<0,05 соответственно). Наиболее сильные связи между этими маркерами отмечены в группе больных ХГН с НС (Rs=0,61; p<0,01 и Rs=0,44; p<0,05 соответственно), что указывает на сопряженное развитие ДП и иммунного воспаления в клубочках почек и подчеркивает роль этих процессов в формировании НС у больных ХГН.
В эксперименте на различных моделях протеинурических нефропатий подтверждено большое значение апоптоза в механизмах потери ПД в клубочках почек и в развитии подоцитопении. Мы изучили экскрецию с мочой маркера апоптоза каспазы-9. У больных ХГН с НС экскреция каспазы-9 с мочой достоверно выше, чем у пациентов без НС, и именно в группе с НС выявлялись самые высокие уровни НУ и ПЦУ (см. табл. 1).
В сопоставлении с НУ мы изучили уровень экскреции с мочой ангиогенного фактора VEGF, оказывающего антиапоптотическое действие в эндотелиальных клетках и ПД. В нашем исследовании по мере нарастания НУ у больных с НС отмечалось повышение экскреции с мочой VEGF, в то время как у больных с прогрессирующим течением заболевания, характеризующимся высокой ПУ и нарушением функции почек, уровень VEGF в моче резко снижался (рис. 1).
При иммуногистохимическом исследовании биоптатов ткани почек больных ХГН мы выявили уменьшение количества меченных WT1 ПД в клубочке у больных ХГН 2-й и 3-й групп, особенно выраженное (>50% от нормы) у пациентов с торпидным течением Н.С. Это отражает наиболее значительную потерю ПД в клубочках почек у больных данной категории. Выявлена достоверная обратная корреляция между числом меченных WT1 ПД в клубочке и выраженностью ПЦУ (Rs=–0,39; p<0,01) (рис. 2).
Для оценки прогностического значения изученных биомаркеров повреждения ПД мы проанализировали ответ на иммуносупрессивную терапию у 55 больных с ХГН и НС в зависимости от исходного уровня НУ и ПЦУ. По нашим данным, купирование НС и достижение ремиссии нефрита в течение ближайших 6 мес наблюдались у больных с меньшими показателями ПЦУ (<20 клеток/мкл) и НУ (<17 нг/мл). В то же время у 70% больных с высокими исходными уровнями ПЦУ (>20 клеток/мкл) и НУ (>17 нг/мл) НС характеризовался торпидным течением, несмотря на применение рекомендованных схем иммуносупрессивной терапии в течение длительного срока (от 9 мес до 3 лет) (рис. 3).
Обсуждение
Установлено, что изменение структуры и функции ПД (подоцитопатия), ранее считавшееся специфическим признаком болезни БМИ, встречается при различных формах гломерулонефрита (ГН) и других нефропатиях [5]. Выполняя важную роль в поддержании структуры и функции почечного клубочка в норме, ПД имеют первостепенное значение при повреждении клубочка и прогрессировании заболевания почек. В эксперименте показано, что появление и нарастание в моче маркеров повреждения ПД служит более чувствительным, чем ПУ, показателем активности болезни [6].
Своеобразной «платформой» передачи сигналов, необходимых для поддержания функций ПД (правильной организации цитоскелета, поляризации, эндоцитоза, дифференцировки, ограничения пролиферации и жизнеспособности клетки в целом), служит межподоцитарная щелевая диафрагма [7]. Стереотипной реакцией ПД на разнообразные повреждающие факторы (иммунные, гемодинамические, метаболические) является снижение экспрессии структурных белков щелевой диафрагмы и интегринов, что приводит к изменениям цитоскелета, формы ножек ПД, нарушению адгезии к БМК со слущиванием ПД в мочевое пространство, в результате чего нарушается барьерная функция ПД, развивается ПУ [8]. В моче пациентов с различными формами ГН обнаруживаются специфические для ПД белки, а также сами П.Д. Часть П.Д., выявляемых в моче, еще сохраняют жизнеспособность, что подтверждено возможностью их выращивания при помещении в культуральную среду, а часть ПД, экскретируемых с мочой, находятся в состоянии апоптоза [9].
В проведенном нами исследовании показатели НУ и ПЦУ изменялись однонаправлено и были достоверно выше у больных с активным течением ГН, коррелируя с выраженностью П.У. Наиболее высокие уровни маркеров ДП мы выявили у больных с прогрессирующим течением нефрита — сочетанием НС и ОНС, быстропрогрессирующей почечной недостаточностью, т. е. яркими клиническими проявлениями активного иммунного воспаления, приводящего к распространенному повреждению ПД.
Мы показали, что уровни ПЦУ и НУ сопоставимы при различных морфологических формах нефрита, и это позволяет рассматривать изученные показатели как универсальные маркеры повреждения П.Д. Выявленные нами закономерности изменения НУ согласуются с данными литературы об уменьшении экспрессии нефрина в ткани почки при активных нефропатиях независимо от их морфологической формы (болезнь БМИ, ФСГС, МН, мезангиальные формы ГН, волчаночный нефрит, диабетическая нефропатия) [8].
В настоящее время среди маркеров повреждения богатых актином клеток, в том числе ПД, рассматривают БТШ-27 [1]. В физиологических условиях этот белок, располагаясь внутриклеточно, не связан с волокнами актина. Под влиянием повреждающих факторов олигомеры БТШ-27 объединяются в ПД с актиновыми микрофиламентами и способствуют их стабилизации, чтобы противостоять стрессовому изменению клеточного цитосклета [10]. Показано, что наибольшей защитной активностью обладают нефосфорилированные олигомеры БТШ-27. Фосфорилирование БТШ-27 с помощью р38-МАР-киназы влечет потерю связи с актиновыми микрофиламентами, ремоделирование актиновой сети, агрегацию и перераспределение микроволокон в клетке и распластыванию ножек ПД, что рассматривают как патофизиологическую основу нарушения проницаемости клубочков [11].
В нашем исследовании уровень защитного БТШ-27 в моче был выше у пациентов с НС, особенно при тяжелом его течении, и прямо коррелировал с выраженностью ПУ, что находит объяснение в свете современных представлений об участии этого белка в регулировании формы ножек ПД — одного из ключевых звеньев развития нефротической П.У. Об этом свидетельствует и выявленная нами прямая корреляция мочевого уровня БТШ-27 с выраженностью повреждения ПД, в частности с ПЦУ.
Поскольку БТШ-27 является внутриклеточным протективным фактором, его выход из клеток и высокая экскреция с мочой у больных с тяжелым течением ХГН могут рассматриваться как свидетельство напряженности и несостоятельности внутриклеточной самозащиты на территории П.Д. Это также подтверждает выявленное нами у больных активным ХГН (особенно с НС) повышение уровней в моче провоспалительного ИЛ-6 и защитного БТШ-27, коррелирующие с выраженностью ПЦУ.
Наши данные согласуются с результатами проведенных ранее экспериментальных работ, продемонстрировавших роль провоспалительных медиаторов, продуцируемых клетками клубочка, в том числе ИЛ-6 и α-фактора некроза опухоли (α-ФНО), в развитии повреждения ПД при протеинурических формах ХГН [12].
Основной источник ИЛ-6 в моче больных ХГН в настоящее время остается предметом изучения. Клетки мезангия, а также макрофаги, лимфоциты и эндотелиальные клетки могут секретировать ИЛ-6 в ответ на воздействие факторов воспаления [13]. Однако в биоптатах почек пациентов со значительной мочевой экскрецией ИЛ-6 не находят мононуклеарных и лимфоцитарных инфильтратов, что предполагает наличие и другого источника этого фактора [14]. Полагают, что таким источником ИЛ-6 могут быть П.Д. Так, в работе К. Lai и соавт. [15] на культуре клеток показано, что ПД имеют рецепторы к основным провоспалительным цитокинам и при активации сами могут продуцировать ИЛ-6 и α-ФНО, являясь не только объектом повреждения, но и активным участником воспаления в клубочках почек.
У обследованных пациентов мы оценили уровень в моче каспазы-9 — маркера, отражающего интенсивность процесса апоптоза клеток почки, и сопоставили его с показателем повреждения ПД — Н.У. Отмечено одновременное увеличение экскреции с мочой этих биомаркеров по мере нарастания активности нефрита, что указывает на сопряженность процессов апоптоза и повреждения ПД, участвующих в развитии ПУ.
Мы также сопоставили уровень НУ и экскреции с мочой VEGF, оказывающего антиапоптотическое действие. По данным эксперимента, он продуцируется ПД, поддерживает структуру и функцию эндотелиального монослоя и самих ПД, способствуя, таким образом, сохранению целостности фильтрационного барьера [16]. У больных с прогрессирующим течением нефрита с нарушением функции почек мы отметили резкое снижение экскреции с мочой VEGF при неуклонно нарастающей НУ. В экспериментальных работах показано, что нарушение фосфорилирования нефрина в условиях дефицита VEGF ослабляет связывание нефрина с ПД, в результате чего внеклеточная часть молекулы нефрина отщепляется от мембраны ПД и экскретируется с мочой [16]. Так, A. Hara и соавт. [17] продемонстрировали, что дефицит VEGF у здоровых крыс приводит к развитию артериальной гипертонии и умеренной ПУ, а при анти-БМК-нефрите — к более тяжелому его течению с массивной ПУ вследствие повреждения П.Д. Усиление процессов повреждения ПД и истощение продукции VEGF у больных с прогрессирующими формами ХГН в нашем исследовании можно рассматривать как отражение дисбаланса механизмов апоптоза и выживаемости ПД с последующей прогрессирующей их потерей и развитием подоцитопении.
По данным многочисленных экспериментальных и клинических исследований, число ПД в клубочках служит основной детерминантой развития ГС [4, 18]. Так как ПД являются высокодифференцированными клетками с ограниченным пролиферативным потенциалом, уменьшение их числа приводит к необратимому дефекту клубочкового фильтра, способствует формированию синехий между капиллярными петлями и капсулой клубочка почки и является пусковым механизмом для начала склерозирования клубочков. В нашем исследовании с помощью иммуногистохимического метода мы подтвердили прогрессирующую потерю ПД (по степени экспрессии WT-1) в клубочках почек у пациентов с НС, особенно при торпидном его течении. Эти изменения сопровождались высокой экскрецией с мочой маркеров повреждения ПД (НУ, ПЦУ, БТШ-27). Это обосновывает возможность применения подоцитарных маркеров для мониторирования течения активных протеинурических форм ХГН, оценки риска прогрессирования, прогнозирования ответа на лечение. Так, мы установили, что у большинства больных с высоким уровнем маркеров повреждения ПД (ПЦУ и НУ) в течение ближайших 6 мес не удавалось купировать НС и достичь ремиссии нефрита, несмотря на проведение рекомендованной для этих видов нефрита иммуносупрессивной терапии.
Заключение
Таким образом, процессы повреждения и самозащиты, обусловленные общностью клеточно-молекулярных взаимодействий, протекают одновременно на территории структурно-функциональной единицы клубочка — П.Д. Повреждение П.Д. вследствие дисбаланса этих противодействующих систем является универсальным механизмом развития протеинурии и формирования ГС независимо от формы Г.Н. Повышение маркеров ДП наряду со снижением показателей самозащиты ПД отражают риск дальнейшего прогрессирования заболевания и являются факторами неблагоприятного прогноза.