ИКГН — иммунокомплексный гломерулонефрит

ИРИ — иммунорегуляторный индекс

КО — коэффициент отклонения

МКАТ — моноклональные антитела

ПУ — протеинурия

СКФ — скорость клубочковой фильтрации

ТФР-β — трансформирующий β-фактор роста

ХБП — хроническая болезнь почек

ХПН — хроническая почечная недостаточность

α-ИФН — α-интерферон

α-ФНО — α-фактор некроза опухоли

γ-ИФН — γ-интерферон

Связанное с ВИЧ-инфекцией острое или хроническое повреждение почек может быть обусловлено разными патогенетическими звеньями, ведущими к широкому спектру клинических проявлений заболеваний [1—3]. Интерес к проблеме поражения почек при ВИЧ-инфекции растет во всем мире. Это обусловлено тем, что различные варианты вовлечения почек при ВИЧ-инфекции независимо от ее стадии характеризуются прогрессирующим течением с развитием тяжелых осложнений [4—6]. В связи с продолжающимся ростом числа ВИЧ-инфицированных в мире такое положение чревато увеличением среди них числа больных с конечной стадией хронической болезни почек (ХБП) — терминальной стадией хронической почечной недостаточности (ХПН), обусловливающей необходимость терапии, замещающей функцию почек (диализ или трансплантация почки) [7, 8].

Это определяет необходимость раннего обнаружения признаков дисфункции почек, немалое значение при этом имеет изучение влияния вирусной нагрузки, особенностей клеточного состава лимфоцитов, состава цитокинов и других иммунологических показателей на развитие и прогрессирование патологии почек, что является актуальным и практически важным [9].

Несмотря на достижения в изучении иммунопатогенеза ВИЧ-инфекции, остаются нерешенными вопросы диагностики особенностей состава цитокинов у ВИЧ-инфицированных пациентов с ХБП. Исследования в этом направлении создадут предпосылки для более полного понимания механизмов повреждения почек при ВИЧ-инфекции.

Цель работы — определить значение иммунных факторов в патогенезе поражений почек при ВИЧ-инфекции на основе изучения клеточного и цитокинового звеньев иммунного ответа.

Изучены показатели типовой иммунограммы и цитокинового статуса у 30 ВИЧ-инфицированных пациентов с ХБП в возрасте от 26 до 46 лет (средний возраст 31,7±6,2 года, 60% мужчины). ХБП (независимо от ее природы) констатировали во всех случаях, когда в течение ≥3 мес выявлялись признаки поражения почек: персистирующая протеинурия (ПУ), изменения в осадке мочи, нарушения функции почек. Функциональное состояние почек оценивали по скорости клубочковой фильтрации (СКФ) с использованием формул расчета MDRD (Modification of Diet in Renal Disease Study) и CKD-EPI (Chronic Kidney Desease Epidemiology Collaboration) [10].

Группу сравнения составили 10 пациентов с ВИЧ-инфекцией без признаков поражения почек, сопоставимые по полу и возрасту с изучаемым контингентом пациентов с патологией почек. В контрольную группу, сопоставимую по полу и возрасту с ВИЧ-инфицированными пациентами, включены 24 здоровые человека для анализа иммунного статуса и 15 человек для оценки нормальных показателей состава цитокинов. Требования к включению в группу контроля: информированное согласие на обследование; отсутствие в анамнезе сведений, позволяющих причислить обследуемых к категории часто и длительно болеющих лиц, лиц с хроническими заболеваниями, с патологией почек, признаками инфекционно-воспалительных, аллергических, аутоиммунных, иммунодефицитных состояний.

Материалом для исследования являлась венозная кровь. Образцы крови брали у пациентов утром натощак по 5 мл в пробирки Vacuum Tube EDTA. K3 (цельная кровь). Исследование крови осуществляли в течение 2 ч после забора.

Определение клеточного состава лимфоцитов типовой иммунограммы выполнено на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II («Becton Dickinson», США) с помощью станции автоматической пробоподготовки BD FACS Sample Prep Assistant II («Becton Dickinson», США) в соответствии с инструкцией по применению приборов и моноклональных антител.

Оценивали следующие показатели типовой иммунограммы: абсолютное и относительное число клеток CD3⁺; абсолютное и относительное число клеток СD3⁺/CD4⁺/CD8⁺; абсолютное и относительное число клеток СD3⁺/CD4⁺; абсолютное и относительное число клеток СD3⁺/CD8⁺; иммунорегуляторный индекс (ИРИ); абсолютное и относительное число клеток CD3⁺/CD56⁺; абсолютное и относительное число клеток CD19⁺; абсолютное и относительное число клеток CD3^–/CD56⁺.

Для определения перечисленных показателей использовали стандартизованный комплект моноклональных антител (МКАТ) BD Multitest 6-Color TBNK Reagent (BD Biosciences), содержащий меченные PerCP-Cy5.5 anti-CD45 МКАТ, FITC anti-CD3 МКАТ, PE-Cy7 anti-CD4 МКАТ, APC-Cy7 anti-CD8 МКАТ, APC anti-CD19 МКАТ, PE anti-CD16/anti-CD56 МКАТ.

Для расчета абсолютных величин показателей использовали следующую формулу

Число клеток (10⁹/л)=(% клеток от общего числа лимфоцитов ∙ число лимфоцитов (10⁹/л))/100%.

Расчет ИРИ осуществляли по формуле:

число CD3⁺/CD4⁺ клеток

ИРИ= .

число CD3⁺/CD8⁺ клеток

Для расчета коэффициентов отклонения (КО) показателей типовой иммунограммы от контрольных значений здоровых лиц использовали следующую формулу:

показатель больного – показатель здорового

КО =100% + ∙100%.

показатель здорового

Концентрацию цитокинов в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа на многоканальном фотометре Infinite F50 («Austria GmbH» компании «Tecan») при помощи коммерческих диагностических тест-систем (γ-интерферон — γ-ИФН, α-интерферон — α-ИФН фирмы «гамма-ИНТЕРФЕРОН-ИФА-БЕСТ», Новосибирск; α-фактор некроза опухоли (α-ФНО) — «альфа-ИНТЕРФЕРОН-ИФА-БЕСТ»; трансформирующий β-фактор роста (ТФР-β), интерлейкины (ИЛ) 10, 12, 13 — Platinum ELISA, «Bioscience», Австрия).

Статистическая обработка результатов выполнена с использованием программы SPSS 17.0 (допустимая ошибка Е=5%).

Анализ типового иммунологического исследования клеточного состава лимфоцитов показал, что для ВИЧ-инфицированных пациентов с наличием маркеров повреждения почек (ПУ, снижение СКФ) и без таковых в сопоставлении с показателями здоровых характерно снижение в крови содержания Т-лимфоцитов (CD3⁺) за счет Т-хелперов (CD3⁺/CD4⁺) при увеличении числа цитотоксических Т-клеток (CD3⁺/CD8⁺). При этом у больных ВИЧ-инфекцией с поражением почек достоверно снижены абсолютное (0,2·10⁹ и 0,4·10⁹/л соответственно; р=0,015), относительное (14,75 и 22% соответственно; р=0,005) числа клеток CD3⁺/CD4⁺ и ИРИ (0,2 и 0,4 соответственно; р=0,014) по сравнению с таковыми у ВИЧ-инфицированных пациентов без патологии почек (р≤0,05). С целью повышения сопоставимости данные представлены не собственно значениями показателей при наличии или в отсутствие маркеров повреждения почек у пациентов с ВИЧ-инфекцией, а КО от контрольных значений здоровых лиц (рис. 1).

Кроме того, реакция иммунной системы у пациентов с ВИЧ-инфекцией и маркерами повреждения почек по сравнению со здоровыми лицами проявилась достоверным снижением процентного (р=0,039) и абсолютного (р=0,027) содержания в крови В-лимфоцитов (CD19⁺). Статистически значимых различий в группе пациентов без поражения почек и в контрольной группе здоровых лиц не выявлено. По содержанию естественных киллеров (CD3^–/CD56⁺) в крови при ВИЧ-инфекции независимо от патологии почек отмечено статистически значимое снижение по относительным и абсолютным величинам по сравнению с контролем (6,85 и 15% соответственно; р=0,003); 0,1·10⁹ и 0,25·10⁹/л соответственно, (р<0,001), что типично для хронической вирусной инфекции [11].

По результатам определения цитокинового статуса в крови больных с ВИЧ-инфекцией с маркерами повреждения почек и в отсутствие таковых в сопоставлении с данными контрольной группы выявлено, что у ВИЧ-инфицированных пациентов с ХБП преобладал иммуносупрессорный состав цитокинов. Об этом свидетельствовало возрастание более чем в 50 раз уровня ТФР-β и увеличение в 4 раза концентрации ИЛ-10 на фоне снижения содержания γ-ИФН, ИЛ-13. Подобные изменения выявлены и при ВИЧ-инфекции без признаков поражения почек. По всей вероятности, состав цитокинов характерен для ВИЧ-инфекции в целом. Тем не менее углубленный анализ показателей цитокинов в группах с ПУ и без ПУ позволил установить, что при ВИЧ-инфекции с поражением почек уровень ИЛ-10 по сравнению с группой без ПУ выше на 74%.

При сопоставлении уровней цитокинов при ВИЧ-инфекции с учетом наличия и отсутствия ПУ установлено статистически значимое повышение концентрации γ-ИФН в группе пациентов с поражением почек (79,7 и 70,2 пг/л соответственно; р=0,024). Уровень γ-ИФН повышен на 11,3% у ВИЧ-инфицированных пациентов с ПУ по сравнению с таковыми без ПУ, что указывает на более выраженное уменьшение числа Т-хелперов 1-го типа (Тh1), которые продуцируют этот цитокин. Динамика изменения уровня ИЛ-13 как цитокина, продуцируемого Т-хелперами 2-го типа (Тh2), может свидетельствовать о нарушении баланса субпопуляций лимфоцитов CD4⁺ 1-го и 2-го типов в пользу Тh2.

Исследование уровней цитокинов в крови у больных ВИЧ-инфекцией с маркерами повреждения почек с учетом полового и возрастного факторов не выявил достоверных различий.

При проведении анализа использовали также следующие дифференциальные показатели: уровень абсолютного числа лимфоцитов CD4⁺ (более и менее 200 клеток/мкл) и концентрация РНК ВИЧ в крови (более и менее 100 000 копий/мл).

У ВИЧ-инфицированных пациентов с поражением почек при снижении уровня лимфоцитов CD4⁺ менее 200 клеток/мкл и повышении концентрации ВИЧ (РНК ВИЧ) в крови более 100 000 копий/мл отмечалось увеличение уровней большинства цитокинов, в том числе профиброзного цитокина ТФР-β, играющего важную роль в прогрессировании поражения почек [12]. Однако зарегистрировано статистически значимое повышение только уровня α-ФНО — цитокина, контролирующего секрецию ТФР-β (при уровне лимфоцитов CD4⁺ более и менее 200 клеток/мкл — 19 и 24,2 пг/мл соответственно, р=0,017; при уровне РНК ВИЧ более и менее 100 000 копий/мл — 24,4 и 19,7 пг/мл соответственно, р=0,012). Кроме того, по мере прогрессирования ВИЧ-инфекции с усилением продукции α-ФНО возрастала концентрация РНК ВИЧ, что и выявлено у ВИЧ-инфицированных пациентов с поражением почек.

Корреляционный анализ между показателями иммунного статуса, состава цитокинов показал следующее. В контрольной группе не выявлено взаимосвязи уровней цитокинов и показателей типовой иммунограммы. У пациентов с ВИЧ-инфекцией без повреждения почек корреляции оказались минимальными, основными клетками среди лимфоцитов являлись Т-эффекторы с цитотоксической активностью (CD3⁺/CD8⁺), а к числу цитокинов, связанных с количеством этих клеток, относили только ИЛ-12, регулирующие клеточный иммунный ответ (r=0,671; р=0,034).

У больных ВИЧ-инфекцией с поражением почек корреляции между цитокинами и субпопуляциями лимфоцитов возрастают. Уровень α-ИФН связан с числом В-лимфоцитов (CD19⁺) (r=0,374; р=0,042), а число естественных киллеров (CD3^–/CD56⁺) коррелировало с уровнем γ-ИФН (r=0,574; р=0,001), последний проявлял взаимосвязь еще и со своими основными продуцентами, с числом Т-хелперов (r=–0,469; р=0,009). С хелперной популяцией Т-лимфоцитов (CD3⁺/CD4⁺) также связаны уровни цитокина профиброзного действия ИЛ-13 (r=0,671; р=0,034) и α-ФНО (r=–0,733; р=0,025).

Несмотря на то что наличие корреляций не отражает причинно-следственных связей, определенные выводы по взаимосвязи уровней цитокинов и количества клеток лимфоидного ряда в крови можно сделать у обследованных пациентов с иммунокомплексным гломерулонефритом — ИКГН (n=9), развившимся на фоне ВИЧ-инфекции. Диагноз верифицирован после биопсии почки у пациентов с протеинурией нефротического уровня.

У больных с ИКГН большинство корреляций формирует α-ФНО, уровень которого связан с числом Т-хелперов (r=0,695; р=0,038), В-лимфоцитов (r=–0,736; р=0,024) и цитотоксических Т-лимфоцитов (r=0,669; р=0,049), последний из которых проявлял достоверный уровень корреляций с цитокином ТФР-β (r=–0,778; р=0,014). При корреляционном анализе между уровнями различных цитокинов и маркерами повреждения почек установлена прямая связь между протеинурией и α-ФНО (r=0,683; р=0,042).

Выявлены взаимосвязь СКФ и цитокином профиброзного действия ИЛ-13 (r=0,667; р=0,050) и отрицательная корреляция с α-ФНО (r=–0,755; р=0,031).

Таким образом, среди факторов, участвующих в развитии и прогрессировании поражения почек при ВИЧ-инфекции, по данным литературы [13, 14] и результатам исследования, можно выделить иммунный и вирусный. К иммунному фактору относятся иммуносупрессия и гиперпродукция профиброгенных цитокинов, к вирусному — высокая виремия. Кроме того, выделяют гемодинамический фактор (перегрузка давлением), влияние оппортунистических заболеваний, сочетанные заболевания (сахарный диабет, вирусный гепатит, наркомания), нефротоксичность лекарственных препаратов и наследственность.

Изменения, происходящие в почках при ВИЧ-инфекции, представлены в виде континуума с точки зрения предикторов повреждения почек (иммунных и вирусологических факторов), экспрессии медиаторов воспаления и маркеров нефропатии, отражающих патофизиологические звенья: протеинурия — начальная ХПН — терминальная стадия ХПН (рис. 2).

Ключевую роль в поддержании гомеостаза организма, формировании согласованных реакций его отдельных систем в ответ на внешние воздействия отводят иммунной системе, реализация функций которой осуществляется через межклеточные связи на тканевом и органном уровнях. Посредниками межклеточных и межсистемных взаимодействий выступают медиаторы, роль которых выполняют цитокины — группа регуляторных белков, осуществляющих передачу сигналов через контакт со специфическими рецепторами на поверхностях клеток [15].

Основными продуцентами цитокинов иммунной системы являются Т-хелперы и макрофаги. Т-хелперы 1-го и 2-го типов участвуют в различных ответных реакциях на патогенное воздействие инфекционных агентов, при этом нарушение баланса цитокинпродуцирующей активности Тh1 и Тh2 типов играет немаловажную роль в развитии аутоиммунных состояний, прогрессирования и хронизации заболеваний. В свою очередь гиперпродукция цитокинов приводит к формированию системных воспалительных реакций [16].

При ВИЧ-инфекции наблюдается дисбаланс синтеза и продукции цитокинов. В норме соотношение Тh1 и Тh2, продуцирующих цитокины, взвешенно и конкурентно, гиперэкспрессия цитокинов клеток одного типа приводит к супрессии другого. Для инфекции, вызванной ВИЧ, характерно угнетение Т-звена клеточного иммунитета — Тh1 [17].

В настоящем исследовании у ВИЧ-инфицированных пациентов с ХБП выявлены разнонаправленные изменения в показателях типовых иммунограмм. Поражение почек при увеличении числа цитотоксических Т-клеток развивалось на фоне более выраженного снижения содержания в крови Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов, что лежит в основе иммунопатогенеза ВИЧ-инфекции [18].

С хелперной популяцией Т-лимфоцитов связаны уровни цитокина профиброзного действия ИЛ-13, контролирующего гуморальный иммунный ответ, и α-ФНО, регулирующего секрецию ТФР-β. У ВИЧ-инфицированных пациентов с поражением почек преобладал иммуносупрессорный состав цитокинов, о чем свидетельствовали высокие уровни иммуносупрессорных цитокинов ТФР-β и ИЛ-10. В связи с противовоспалительной ролью ИЛ-10 усиленная его продукция может приводить к истощению противовоспалительной системы почки и способствовать переходу острого воспаления в хроническое с последующей трансформацией в фиброгенез [19].

По данным литературы [17, 18], при ВИЧ-инфекции на фоне прогрессирующего иммунодефицита изменяется не только субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток, но и цитокиновые показатели, что подтверждено в проведенном исследовании. Однако сопоставление этих изменений с уровнем ПУ как одного из маркеров ХБП использовано впервые. В доступной литературе отсутствуют также данные по сопоставлению выраженности иммунодефицита с учетом уровня цитокинов, вирусной нагрузки и наличием или отсутствием ПУ.

При анализе динамики иммуно- и вирусологических показателей показано, что депрессия иммунной системы и активная репликация ВИЧ у пациентов с патологией почек сопровождалась гиперэкспрессией сывороточных цитокинов ТФР-β, α-ФНО, с последним из которых установлена достоверная зависимость. В формировании повреждения почек при ВИЧ-инфекции установлена ведущая роль α-ФНО в сочетании с глубокой иммуносупрессией и высокой концентрацией РНК ВИЧ.

Ряд авторов указывают, что модификация экспрессии медиаторов воспаления, вызванная белками вируса, приводит к необратимым изменениям в иммунной системе при ВИЧ-инфекции [18]. При этом важную роль отводят провоспалительному цитокину α-ФНО, который усиливает пролиферацию Т-клеток, активирует экспрессию генов ВИЧ и инициирует активацию репликации вируса, находящегося в «дремлющем» состоянии [17, 20]. Кроме того, гиперпродукция α-ФНО вызывает целый ряд нарушений в иммунной системе, способствующих более быстрому прогрессированию болезни с поражением различных органов, в том числе почек.

По данным литературы, повышенный синтез α-ФНО, оказывающего фиброгенный эффект и способствующего продукции факторов роста, в том числе ТФР-β, может способствовать пролиферации фибробластов посредством стимуляции эпителиальной и мезенхимальной реакции. Это приводит к нарушению процессов деградации матрикса и развитию коллагеноза с последующим исходом в фиброз [19, 21]. Установлено также, что у пациентов с ВИЧ-инфекцией и нефропатией определяются высокие концентрации α-ФНО в крови. Выявленные изменения в системе медиаторов воспаления у ВИЧ-инфицированных пациентов с патологией почек, по-видимому, являются результатом привлечения макрофагов в интерстициальную ткань почек и отражают активность патологического процесса в почечной ткани. При этом уровень α-ФНО, по данным исследования, прямо коррелировал с ПУ и обратно со СКФ. Учитывая, что α-ФНО, источником которого служат клетки воспалительного инфильтрата, может вызывать не только поражение клубочков, но и участвовать в повреждении канальцевого эпителия, что обусловливает формирование тубулоинтерстициальных изменений, присоединение которых способствует прогрессированию ХБП. Такие корреляции нашли свое отражение и в проведенном исследовании.

Следовательно, полученные нами данные свидетельствуют о важной роли α-ФНО в развитии и прогрессировании хронического воспаления. Следует отметить, что α-ФНО участвует в тех же патологических процессах в почках у пациентов с хроническим гломерулонефритом, не инфицированных ВИЧ. Однако выявленные нарушения регуляции продукции цитокинов у ВИЧ-инфицированных пациентов с поражением почек являются одним из первых исследований в этой области.

Таким образом, оценка динамики параметров иммунного и цитокинового статуса у ВИЧ-инфицированных пациентов с ХБП свидетельствовала о преобладании у них провоспалительных и иммуносупрессорных реакций. В формировании повреждения почек при ВИЧ-инфекции установлена ведущая роль α-ФНО в сочетании с депрессией иммунной системы и высокой виремией, что отображено в схеме почечного континуума при ВИЧ-инфекции с точки зрения предикторов повреждения почек, экспрессии медиаторов воспаления. Приведенные данные о роли цитокинов в прогрессировании заболеваний почек расширяют понимание патогенеза хронического поражения почек, а исследования в этой области позволят открыть широкие возможности для предупреждения, прогнозирования течения и исхода ХБП, выбора патогенетически обусловленного лечения этих состояний.

Конфликт интересов отсутствует.