АМ — аберрантное метилирование

ДИ — доверительный интервал

ОВ — общая выживаемость

ОМЛ — острый миелоидный лейкоз

ОШ — отношение шансов

Аберрантное метилирование (АМ) промоторных областей некоторых генов, участвующих в регуляции процессов дифференцировки и пролиферации клеток, рассматривается как один из принципиальных механизмов патогенеза ряда гемобластозов, включая острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) [1, 2]. В отличие от генетических аберраций, нередко обнаруживаемых при лейкозной трансформации, эффект АМ реализуется на эпигенетическом уровне, поскольку в данном случае не происходит изменения последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК [3]. Избыточное метилирование остатков цитозина в регуляторной области гена, происходящее главным образом в островках CpG, приводит к снижению или полной блокировке его транскрипционной активности. Несмотря на то что данный механизм является важнейшим регулятором генной экспрессии в онтогенезе, нарушение процессов метилирования в клетке может стать одной из причин ее злокачественной трансформации.

Предполагается, что роль гиперметилирования ДНК в лейкозогенезе опосредована инактивацией определенных генов — супрессоров опухолевого роста. Вместе с тем недостаточно информации о том, какие именно гены-супрессоры характеризуются АМ при том или ином варианте лейкоза. При ОМЛ в качестве потенциальных кандидатов рассматриваются гены SOX7, p15INK4b и антагонисты сигнального пути Wnt/β-катенина, включая гены семейства SFRP (secreted frizzled related proteins) [4—9]. Известно, что метилирование генов SFRP приводит к увеличению уровня цитоплазматического и внутриядерного β-катенина, повышению экспрессии генов c-MYC и циклина D1 (CCND1), дизрегуляции клеточного цикла [4, 5].

Изучение процессов метилирования у онкогематологических больных представляет практический интерес. Это связано с опубликованными данными о возможной ассоциации статуса АМ с неблагоприятным течением миелоидных неоплазий, а также внедрением в клиническую практику гипометилирующих препаратов, в частности децитабина и 5-азацитидина (азануклеозиды) [1, 2]. Результаты исследований статуса метилирования генов семейства SFRP при ОМЛ носят противоречивый характер, что отражает гетерогенность биологического фенотипа заболевания и не исключает влияние половой и расовой принадлежности больных [5—9]. Более привлекательным для практического использования представляется совокупный анализ статуса метилирования генов SFRP с другими генами, например, SOX7 и p15INK4b [10]. В этом случае возможно получение новых данных, в частности об ассоциации числа аберрантных генов с клинико-гематологическими показателями и прогнозом заболевания [11]. Выделение однородных групп больных со значительным числом метилированных генов может послужить основанием для модификации лечебного пособия, что имеет принципиальное значение для пациентов, которым по разным причинам не может быть назначена интенсивная полихимиотерапия, а монотерапия азануклеозидами не дает желаемого результата [12, 13].

Цель исследования — изучить статус метилирования генов SOX7, p15INK4b и антагонистов сигнального пути Wnt у больных ОМЛ для оценки сопряженности частоты АМ с морфологическим вариантом и характером хромосомных аберраций, а также влияние статуса метилирования на выживаемость больных.

Для достижения поставленной цели из банка биологических образцов отобрали образцы геномной ДНК 57 больных ОМЛ, соответствующих следующим условиям: наличие подписанного информированного согласия на обследование и лечение, достаточное для исследования количество ДНК, отсутствие в анамнезе указаний на ранее проводимую терапию гипометилирующими препаратами, доступность клинико-гематологических показателей и информации о результатах терапии. Больных острым промиелоцитарным лейкозом в исследование не включали.

Возраст больных, из которых 20 мужчин и 37 женщин, был в диапазоне от 20 до 79 лет, медиана 51 год. Диагноз устанавливали по критериям классификации ВОЗ. Верификацию отдельных вариантов осуществляли по результатам изучения морфологических препаратов костного мозга, цитохимического анализа и иммунофенотипирования бластных клеток. Распределение по вариантам было следующим: 2 больных с вариантом М0, 7 — с М1, 23 — с М2, 4 — с М4, 8 — с М5, 3 — с М6 и 10 — с ОМЛ с миелодисплазией. У 8 больных ОМЛ с миелодисплазией в анамнезе имелись указание на один из вариантов миелодиспластического синдрома.

По результатам изучения кариотипа, известного у 56 больных, сформировали 3 группы: 31 (54,4%) больной с нормальным кариотипом, 8 (14,0%) с комплексным кариотипом и 17 (29,8%) с другими хромосомными аберрациями.

Заготовку образцов крови для исследования статуса метилирования осуществляли при диагностике ОМЛ. Геномную ДНК выделяли стандартным способом. До проведения исследования образцы ДНК хранили при температуре –20 °С. Статус метилирования генов изучали посредством метилспецифической полимеразной цепной реакции [14—16].

Статистическую обработку данных осуществляли по точному методу Фишера. Для описания межгрупповых различий использовали отношение шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ) и значением р. Кривые Каплана—Майера использовали для расчета выживаемости.

Признаки АМ ≥1 генов выявлены у 52 (91,2%) из 57 больных. У 5 пациентов статус метилирования исследованных генов не был изменен. На рис. 1 представлены данные о доле больных с аберрантным статусом метилирования отдельных генов. Наиболее часто выявлялось метилирование генов SFRP1 и p15INK4b — у 39 (68,4%) и 36 (63,2%) больных соответственно. Следующими по частоте убывания оказались гены SOX7, SFRP4 и SFRP5 — у 27 (47,4%), 24 (42,1%) и 20 (35,1%) больных соответственно. Метилирование ≥1 гена семейства SFRP обнаружено у 48 (84,2%) больных.

При анализе распределения больных по числу метилированных генов установлено, что метилирование 1, 2, 3, 4 и 5 генов имелось у 8 (14,0%), 17 (29,8%), 12 (21,1%), 7 (12,3%) и 8 (14%) больных соответственно. Таким образом, наиболее частой находкой было АМ двух или трех генов одновременно. Статистически значимого различия в распределении по числу генов с АМ между больными в возрасте моложе или старше 60 лет не обнаружено.

Учитывая небольшое число больных с отдельными вариантами ОМЛ, мы посчитали нецелесообразным сравнивать характер распределения по числу генов с АМ в группах, выделенных по морфологическим критериям. Вместе с тем необходимо отметить следующие находки. Во-первых, половина всех случаев с метилированием 5 генов (4 из 8 больных) приходилась на группу ОМЛ с миелодисплазией. Во-вторых, среди больных ОМЛ с миелодисплазией было больше лиц с одновременным метилированием 3—5 генов — 7 (70%) из 10, чем при любом другом варианте.

В группах, сформированных по результатам цитогенетического исследования, выявлено, что у больных с нормальным кариотипом чаще обнаруживалось метилирование генов SFRP1 и p15INK4b: в 71 и 64,5% случаев соответственно. Аберрантный статус метилирования этих же генов, а также гена SOX7 были наиболее частой находкой у больных с хромосомными поломками независимо от их вида: 64, 60 и 64% соответственно.

При анализе числа метилированных генов в группах с разными вариантами кариотипа выявлено, что у больных с нормальным кариотипом или с одной или двумя независимыми хромосомными аберрациями чаще обнаруживалось метилирование 2 (32,3 и 29,4% соответственно) и 3 (22,6 и 23,5% соответственно) генов одновременно. Напротив, метилирование 5 генов чаще выявлялось у больных с множественными хромосомными аберрациями (рис. 2). Отражением этого является статистически значимое различие между долей больных с комплексным и нормальным кариотипом, у которых выявлено одновременное метилирование 5 генов: 50% против 9,7% соответственно (ОШ 9,3 при 95% ДИ от 1,5 до 58,0; p=0,022). Еще более выраженное различие по данному показателю наблюдалось при сравнении группы больных с комплексным кариотипом со всеми остальными пациентами (50% против 8,3% соответственно; ОШ 11,0 при 95% ДИ от 2,0 до 61,6; p=0,01).

В ходе исследования также изучено влияние числа генов с аберрантным статусом метилирования (0—2 против 3—5) на выживаемость больных с нормальным кариотипом при проведении стандартной индукционной терапии. Для этого из анализа исключены данные 5 больных, у которых выявлены мутации генов FLT3 и NPM1, и 3 больных, которые по причине возраста, наличия сочетанных заболеваний и соматического статуса не получали такой терапии. Из оставшихся больных у 13 метилированы от 0 до 2 генов и у 10 больных — от 3 до 5 генов.

В группе с 0—2 метилированными генами полная ремиссия достигнута у 9 (69,2%) больных. У 4 больных констатирован первично-резистентный вариант, рецидив ОМЛ развился у 5. Медиана времени наблюдения составила 24 (7—64) мес. В группе с 3—5 метилированными генами полная ремиссия диагностирована у 8 (80%) больных, из которых у 4 в последующем развился рецидив. Период наблюдения варьировал от 2 до 96 мес, медиана 17 мес. Как отражено на рис. 3, медиана общей продолжительности жизни между группами не различалась: не достигнута и 31 мес соответственно. Кроме того, не различалась и медиана продолжительности жизни без рецидивов: 26,7 и 33,5 мес в группах с 0—2 и 3—5 метилированными генами соответственно.

Результаты проведенного исследования в сочетании с данными литературы дают основание рассматривать АМ генов как неслучайный биологический феномен, наблюдающийся у большинства больных ОМЛ. Ранее рядом авторов получены различные данные относительно частоты метилирования отдельных генов у больных ОМЛ, что, вероятно, объясняется сопряженностью аберрантного статуса с вариантом и стадией заболевания, а также характером молекулярных и цитогенетических аберраций. Так, Н. Kroeger и соавт. [17] при обследовании 30 больных во время постановки диагноза ОМЛ наибольшую частоту аберрантного статуса выявили в генах CDH13 (83%), OLIG2 (77%), PGRA (72%), PGRB (70%), NOR1 (63%), NPM2 (63%) и p15 (47%). При рецидиве число больных с метилированными генами CDH13, PGRA и p15 увеличивалось до 93, 92 и 80% соответственно. H. Hou и соавт. [8] обнаружили статистически значимое различие по частоте метилирования антагонистов сигнального пути Wnt между больными М0- и М4/М5-вариантами ОМЛ de novo: 100% против 47,3% (р=0,0006). E. Jost и соавт. [5] установили ассоциацию между гиперметилированием одного и более генов семейства SFRP с вариантами CBF ОМЛ (р=0,02).

Внимание, уделяемое исследователями гену p15INK4b, объясняется его ролью в процессах регуляции клеточного цикла. Метилирование островков CpG промоторных областей p15INK4b сопровождается подавлением активности гена с последующим снижением чувствительности лейкозных клеток к ингибирующему действию β-фактора, трансформирующего рост (TGFβ) [18]. АМ p15INK4b — типичное для больных вторичными ОМЛ и миелодиспластическим синдромом эпигенетическое событие, ассоциированное с аберрациями 7-й хромосомы и неблагоприятным прогнозом [19]. Прогностическая значимость аберрантного статуса гена p15INK4b у больных ОМЛ de novo сомнительна [20, 21]. В то же время M. Grovdal и соавт. [22] констатировали отсутствие полной ремиссии после стандартного индукционного курса у больных с миелодными неоплазиями в случае гиперметилирования гена p15INK4b одновременно с генами CDH и HIC.

Участие сигнального пути Wnt/β-катенина в гемопоэзе обусловливает повышенный интерес к механизмам его регуляции и, в частности, к таким ингибиторам, как DKK1 и 2, LKB1, RASS-F1A, RUNX3, SFRPs, SOX17 и WIF1 [7, 23]. Метилирование островков CpG промоторных областей генов, контролирующих ингибиторы Wnt, — частая находка у больных ОМЛ. А. Valencia и соавт. [6] у 64% обследованных больных обнаружили АМ, по крайней мере, 1 из 6 изученных генов. Метилирование генов SFRP1, SFRР2, SFRP5 и SFRP4 имелось у 41, 31, 22 и 4% больных соответственно. Авторами установлена ассоциация статуса метилирования SFRP5 с резистентностью к химиотерапии (р=0,015) и снижением безрецидивной выживаемости у больных в возрасте 60 лет и моложе с промежуточным кариотипом. H. Hou и соавт. [8] обнаружили ассоциацию частоты метилирования ингибиторов Wnt с хромосомными аберрациями (р=0,0034), но при этом не подтвердили сопряженности аберрантного статуса с эффективностью лечения. Напротив, Е. Jost и соавт. [5] установили низкую выживаемость больных с вариантами CBF ОМЛ с метилированием гена SFRP2 (р=0,003), а Е. Griffiths и соавт. [7] выявили ассоциацию между АМ этого гена и высоким риском смерти больных, имеющих нормальный кариотип.

Учитывая противоречивый характер результатов предшествующих исследований и небольшое число собственных наблюдений, при анализе полученных данных мы уделили особое внимание распространенности аберрантного статуса метилирования изученных генов и их ассоциации с клинико-гематологическими показателями. В итоге установлено, что АМ 3—5 генов являются преимущественной находкой у больных ОМЛ с миелодисплазией или с комплексным кариотипом. Это позволяет прогнозировать низкую эффективность монотерапии гипометилирующими препаратами у больных этой категории. Основанием для такого предположения является сообщение M. Abaigar и соавт. [11], которые при многофакторном анализе результатов лечения 63 больных ОМЛ и миелодиспластическим синдромом с медианой возраста 69 лет установили снижение общей выживаемости (ОВ) в случае лейкоцитоза ≥15,0·10⁹/л (р=0,033), содержания гемоглобина <100 г/л (р=0,029) и числа метилированных генов ≥2 (р=0,022). При этом необходимо отметить, что авторы не выявили сопряженности числа метилированных генов с ответом на 5-азацитидин.

Совокупный анализ собственных находок с данными литературы, в частности о реэкспрессии гена p15INK4b и антагонистов сигнального пути Wnt in vitro при добавлении 5-азацитидина к культуре лейкозных клеток [5, 6, 24], делает обоснованным назначение больным ОМЛ с миелодисплазией или комплексным кариотипом 5-азацитидина в комбинации с цитостатиками [12, 13]. В настоящее время увеличивается число сообщений о модификации терапии 5-азацитидином у больных с миелоидными неоплазиями. Так, G. Borthakur и соавт. [12] приводят результаты одновременного назначения 5-азацитидина и цитарабина. Доза 5-азацитидина варьирует от 37,5 до 75 мг/м² и вводится внутривенно однократно в течение последовательных 7 дней. Цитарабин назначается по 100 мг/м² внутривенной суточной инфузией в течение 7 дней или по 1 г/м² в виде внутривенной суточной инфузии в течение 4 или 3 дней (последняя доза использована у больных 65 лет и старше). Полная ремиссия констатирована у 2 из 34 больных, один из которых имел комплексный кариотип, а другой — мутацию FLT3-ITD. Необходимо отметить крайне неблагоприятный прогноз у больных в данном исследовании: 94% имели рецидив или резистентный вариант. При этом случаев негематологической токсичности IV степени не зафиксировано.

Возможен и другой вариант комбинированной терапии, предполагающий последовательное введение препаратов. U. Krug и соавт. [13] ранее не леченным больным ОМЛ в возрасте ≥61 года перед стандартным индукционным курсом 7+3 в течение 5 дней вводили 5-азацитидин по 37,5 или 75 мг/м². В гематологической клинике РосНИИГТ инициировано пилотное клиническое исследование схемы, предполагающей последовательное введение 5-азацитидина в стандартной дозе (75 мг/м² подкожно в 1—7-й день) и малых доз цитарабина (20 мг/м² подкожно однократно в день на 8—14-й день). Данную схему планируется назначать больным ОМЛ с миелодисплазией или комплексным кариотипом после завершения первых двух курсов монотерапии 5-азацитидином.

Для оценки прогностической значимости аберрантного статуса метилирования отобраны больные ОМЛ с нормальным кариотипом и не имеющие мутаций в генах FLT3 и NPM1. Это обусловлено выраженной клинической вариабельностью течения заболевания у лиц указанной группы, когда выбор интенсивности постремиссионной терапии затруднителен и, следовательно, актуальным представляется поиск новых прогностических факторов. Сопряженности показателей ОВ и/или безрецидивной выживаемости с числом метилированных генов не выявлено. Тем не менее не исключено, что информативной может оказаться динамика статуса метилирования при проведении первых курсов терапии 5-азацитидином.

АМ генов p15INK4b, SOX7 и антагонистов сигнального пути Wnt обнаруживается у большинства больных ОМЛ, что позволяет рекомендовать гипометилирующие препараты для лечения больных, которым по разным причинам не может быть назначена интенсивная цитостатическая терапия. Обнаружение у большинства больных ОМЛ с миелодисплазией или комплексным кариотипом значительного числа генов с аберрантным статусом метилирования служит основанием для инициации пилотного исследования по оценке эффективности комбинации 5-азацитидина с малыми дозами цитарабина. Число гиперметилированных генов не может использоваться как предиктор эффективности лечения больных ОМЛ с нормальным кариотипом и без мутаций в генах FLT3 и NPM1 с применением стандартных схем индукционной терапии.

Конфликт интересов отсутствует.