ЛПК — лейкоциты периферической крови

ЛУ — лимфатический узел

ПЦР — полимеразная цепная реакция

СЛ — саркоидоз легких

В развитии многофакторных заболеваний, к числу которых относится саркоидоз легких (СЛ), важную роль играют как генетическая предрасположенность, так и факторы окружающей среды. Саркоидоз является мультисистемным гранулематозным заболеванием, при котором наиболее часто (почти 90% случаев) поражаются легкие [1]. Развитие патологического процесса при данном заболевании сопровождается иммунологическими нарушениями. Показано, что несоразмерный Th1 иммунный ответ (усиление иммунного ответа посредством пролиферации T-лимфоцитов и увеличения производства цитокинов в пораженных органах) является ключевым механизмом в инициировании и поддержании гранулематозного воспаления [2]. Однако природа антигена (ов), инициирующих ответ Th1 при саркоидозе, и механизмы, ведущие к диссеминации гранулем и фиброза, остаются неясными [3]. Кроме того, установлено, что при СЛ повышено количество регуляторных Т-клеток (Treg) с фенотипом CD45RO+ (Т-клетки иммунологической памяти), активно экспрессирующих CD95 (Fas/APO-1) [4]. Клетки Treg играют важную роль в поддержании иммунологической толерантности, участвуя в супрессии чужеродных и собственных антигенов [5]. Однако молекулярные механизмы иммуносупрессии, опосредованной клетками Treg, а также роль этих клеток в патогенезе саркоидоза до конца не выяснены.

Регуляторные Т-клетки характеризуются экспрессией гена FOXP3 (forkhead box P3). Данный ген является ключевым транскрипционным фактором, участвующим в регуляции, активации и дифференцировке Tregs [6]. Установлено, что снижение уровня экспрессии гена FOXP3 усиливает аутоиммунные реакции и приводит к нарушению супрессорной функции Treg, превращая их в эффекторные клетки [7]. В эксперименте с использованием мышей в качестве модельных животных показано, что инактивация гена FOXP3 приводит к дефициту и аномальной продукции регуляторных Т-клеток [8]. В то же время в ряде исследований установлено, что трансдукция гена в составе ретровирусного вектора в лимфоциты CD4+CD25 фенотипически и функционально преобразует их в клетки Treg, способные подавлять Т-клеточную пролиферацию в пробирке и развитие воспалительных аутоиммунных заболеваний в естественных условиях [9, 10].

Функциональная активность генов регулируется различными факторами, в том числе мутациями в их регуляторных последовательностях, что может приводить к нарушению генной транскрипции. Показано, что однонуклеотидные замены (SNP) в гене FOXP3 вовлечены в патогенез различных заболеваний, в том числе аутоиммунных [11].

В настоящее время работы многих авторов посвящены изучению мутаций в промоторной области гена FOXP3. Так, в ряде исследований показана ассоциация полиморфизма −3279 C>A гена FOXP3 (rs3761548) с риском развития таких заболеваний, как острый коронарный синдром, апластическая анемия и др. [12, 13]. Установлено, что данная мутация влияет на транскрипционную активность гена FOXP3. Однако следует отметить, что работы по исследованию роли данного полиморфизма в патогенезе различных заболеваний еще малочисленны. Данные о влиянии −3279 C>A полиморфного маркера гена FOXP3 на развитие СЛ в литературе отсутствуют.

Цель исследования: изучить связь полиморфного маркера –3279 C>A гена FOXP3 с риском развития СЛ и оценить уровень транскрипции этого гена у носителей разных генотипов по данному полиморфному маркеру.

В исследование включили 215 человек: 99 пациентов русской национальности, проживающих на территории Республики Карелия, у которых установлен диагноз персистирующего СЛ (средний возраст 45,4±1,3 года), и 116 здоровых доноров контрольной группы (средний возраст 42,1±1,3 года). Диагноз С.Л. устанавливали на основании клинико-рентгенологических изменений, подтверждали морфологически. У всех пациентов саркоидоз верифицирован гистологически на основании исследования биоптата. Распределение способов установления окончательного диагноза было следующим: видеоторакоскопия — 50,4% случаев, трансбронхиальная биопсия — 42,8%, открытая биопсия легких — 3,1%, биопсия другого органа (кожа, периферический лимфатический узел — ЛУ) — 3,6%.

При первичном обращении I стадия установлена у 26 (26%) пациентов, II стадия — у 62 (64%), III стадия — 11 (10%). У 9 (9%) больных отмечено острое и подострое течение заболевания с развернутой картиной синдрома Лефгрена (лихорадка, узловатая эритема, артралгии, увеличение внутригрудных ЛУ). У 20 (19,9%) пациентов обнаружены экстраторакальные проявления саркоидоза в виде поражения кожи (васкулит, подкожные узелки — 0,7%), поражения ЛУ различной локализации (12%), поражение нервной системы (нейросаркоидоз с бульбарными нарушениями, периферическая невропатия — 1,2%), печени (1,2%), глаз (1%), суставов различной локализации (1,2%), селезенки (0,7%), почек (0,5%), сердца (констриктивный перикардит, миокардит — 0,5%).

Оценены результаты функциональных тестов пациентов, исключая пациентов с диагностируемыми в анамнезе бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легких. В 4,3% случаев выявлены рестриктивные, в 2,3% — обструктивные нарушения. Данные изменения зарегистрированы у пациентов со II—III стадией заболевания. Снижение диффузионной способности легких выявлено у 3,7% пациентов (снижение DL_co и низкое DL_co/Vа, что характерно для паренхиматозных нарушений).

На терапии преднизолоном находились 32 (32%) пациента. Длительность терапии составила 11,3 мес. У 1 пациента проводилась пульс-терапия экссудативного перикардита, 6,9% пациентов получали нестероидные противовоспалительные препараты по поводу синдрома Лефгрена. В анамнезе у 5% пациентов отмечалась туберкулостатическая терапия.

При наблюдении положительная клинико-лабораторная и рентгенологическая динамика (спонтанная регрессия и регрессия в процессе лечения) отмечена у 60 (59,6%) пациентов, рецидивирующее течение — у 7 (7%). Стабилизация состояния (спонтанная, в процессе или после терапии) достигнута у 24,2% больных. Рецидивы заболевания через 1 год после окончания основного курса лечения или после спонтанной регрессии отмечались у 3 пациентов (9,4% всех получавших терапию).

Материалом для исследования служили пробы периферической крови.

Критерии исключения из исследования: сахарный диабет, выраженные нарушения функции внутренних органов, а также перенесенные в последний месяц инфекционно-воспалительные заболевания, курение табака, беременность и лактация, алкогольная зависимость, индекс массы тела ≥28 кг/м².

Информированное согласие на участие в исследовании получено от всех пациентов. Работа утверждена этическим комитетом ГБУЗ «Республиканская больница им. В.А. Баранова».

Геномную ДНК из лейкоцитов периферической крови (ЛПК) выделяли с помощью набора Analytik jena (Германия). Генотипирование полиморфизма –3279 С>A гена FOXP3 (rs3761548) осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с полиморфизмом длин рестриктивных фрагментов. ПЦР проводили на приборе Maxygene (США). Для амплификации использовали наборы HS-Screen mix и праймеры производства фирмы «Евроген» (Россия). Последовательность праймеров указана в работе [14]. Гидролиз продуктов ПЦР осуществляли эндонуклеазой рестрикции PstI («Thermo Scientific», Германия) в течение 3 ч при температуре 37 ºС. Фрагменты рестрикции разделяли в 2% агарозном геле, окрашенном 1% раствором бромистого этидия и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Размер фрагментов ДНК, соответствующий генотипу АА, составлял 487 bp, генотипу АС — 487, 329 и 158 bp; СС — 329 и 158 bp [14]. Тотальную РНК выделяли из ЛПК с помощью набора Axyprep Multisource Total RNA Miniprep Kit («Axygen», США). Синтез кДНК осуществляли, используя набор MMLV RT kit («Евроген», Россия). Уровень экспрессии мРНК гена FOXP3 определяли методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) на приборе iCycler iQ5 («Био-Рад», США). Для амплификации использовали наборы qPCRmix-HS SYBR и праймеры производства фирмы «Евроген» (Москва). Последовательность праймеров для ПЦР-РВ указана в работе [15]. Для каждого исследуемого образца реакцию ПЦР-РВ ставили не менее 3 раз. Ген GAPDH использовали в качестве референсного.

Статистическую обработку данных проводили при помощи пакета программ Statgraphics 2.1. Достоверность различий частот аллелей и генотипов в группах оценивали с помощью критерия χ². Достоверность различий уровня транскриптов гена между группами оценивали с помощью непараметрического критерия U Вилкоксона—Манна—Уитни. Данные представлены в виде M±m. Статистически значимыми считали различия при p<0,05.

Исследования выполнены на научном оборудовании Центра коллективного пользования ИБ КарНЦ РАН «Комплексные фундаментальные и прикладные исследования особенностей функционирования живых систем в условиях Севера»».

По результатам проведенного нами исследования не установлено статистически значимых различий по распределению частот аллелей и генотипов полиморфного маркера –3279 C>A гена FOXP3 в группе больных СЛ и в контрольной группе (см. таблицу).

Количество транскриптов гена FOXP3 в ЛПК больных СЛ и в контрольной группе статистически значимо не различалось: 0,220±0,032 и 0,249±0,038 отн. ед. (p>0,05). При этом нами не обнаружено статистически значимых различий по уровню экспрессии гена FOXP3 у носителей разных генотипов по полиморфному маркеру –3279 C>A гена FOXP3 как в контрольной группе, так и в группе больных саркоидозом (p>0,05).

Распространенность аллелей и генотипов исследуемого полиморфного маркера у населения Карелии аналогична таковой среди представителей европеоидной расы [16].

Полиморфные варианты указанного гена в силу его клинической значимости активно изучаются для исследования их ассоциации с риском развития различных заболеваний. В проведенном нами исследовании не установлена связь полиморфизма rs3761548 гена FOXP3 с риском развития СЛ у русского населения, поживающего на территории республики Карелия (p>0,05).

Данные о связи указанного полиморфизма с развитием полигенно-наследуемых заболеваний противоречивы. Так, получены аналогичные данные, отражающие отсутствие ассоциации rs3761548 полиморфизма гена FOXP3 с риском развития некоторых заболеваний. Не установлена связь этого полиморфизма гена FOXP3 с риском развития преэклампсии в иранской популяции [17], псориаза, а также эндометриоза в китайской этнической группе Хань [18, 19]. Тем не менее в работе Е. Fodor и соавт. [20] показано, что у женщин из венгерской популяции — носителей генотипа АА по полиморфному маркеру –3279 С>A гена FOXP3 риск развития аллергического ринита снижен по сравнению с таковым у носителей генотипа СС или СА.

В проведенном нами исследовании отсутствие ассоциации полиморфизма rs3761548 гена FOXP3 с риском развития СЛ, возможно, связано с тем, что в настоящей работе проводилась оценка влияния на риск развития патологии только по одному полиморфному маркеру гена FOXP3. Не исключено, что такая связь может быть обнаружена при исследовании сочетанного действия нескольких полиморфных вариантов указанного гена или разных генов. Например, показано, что у населения Китая риск развития такого заболевания, как аллергический ринит, повышен у носителей определенных гаплотипов по полиморфным маркерам rs3761548 и rs4824747 гена FOXP3 (р=0,031; отношение шансов 1,755) [21].

Кроме того, полученные нами данные об отсутствии связи исследуемого полиморфизма гена FOX3 с риском развития СЛ могут быть обусловлены тем, что в наше исследование включены пациенты с персистирующей формой С.Л. При этом известно, что функциональные свойства регуляторных Т-клеток могут различаться на разных стадиях саркоидоза. Так, в работе М. Miyara и соавт. [22] показано увеличение количества клеток CD4+CD25bright Tregs при активном саркоидозе, а также увеличение пропорции регуляторных Т-клеток с фенотипом CD45RO +, активно экспрессирующих CD95 [4, 22]. Ряд авторов высказали предположение, что клетки, регулирующие FOXP3+, подавляют формирование гранулем на ранних стадиях развития патологии [2]. В то же время способность клеток Treg подавлять продукцию цитокинов Т-клетками и развитие воспалительной реакции снижается при хроническом течении саркоидоза [23].

В проведенном нами исследовании не установлена связь полиморфного маркера –3279 С>A гена FOXP3 с риском развития СЛ.

Финансовое обеспечение исследований осуществлялось из средств гранта правительства РФ по постановлению № 220 (договор № 11.G34.31.0052) и федерального бюджета на выполнение государственного задания (тема № 0221−2014−0008).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Топчиева Людмила Владимировна — в.н.с. лаб. генетики

Тихонович Элла Леонидовна — зав. отд-нием респираторной терапии

Курбатова Ирина Валерьевна — н.с. лаб. генетики

Балан Ольга Викторовна — с.н.с. лаб. генетики

Малышева Ирина Евгеньевна — с.н.с. лаб. генетики; тел.: +7(814)257-1879; е-mail: i.e.malysheva@yandex.ru