Офтальмология стала одной из первых областей клинической медицины, в которой лазерное излучение благодаря своим уникальным свойствам нашло широкое практическое применение. Пройдя стадию экспериментальных исследований, лазерная коагуляция (ЛК) тканей хориоретинального комплекса (ХРК) при различных заболеваниях заднего отдела глаза успешно используется в офтальмологии уже более 55 лет [2, 3, 5]. Задачей ЛК является достижение максимального лечебного эффекта путем селективного воздействия на микроструктуры ХРК при минимальном повреждении сенсорной сетчатки. Особое значение это имеет при лечении макулярной патологии в связи с ее высокой функциональной значимостью. Лазерное воздействие в этой области требует наиболее щадящих технологий, оказывающих минимальное повреждающее действие на структуры сенсорной сетчатки. Терапевтический эффект при воздействии непрерывного лазерного излучения обычно сопровождается локальными деструктивными изменениями в ХРК, которые могут быть причиной возникновения относительных и абсолютных скотом, прогрессирующей атрофии ретинального пигментного эпителия (РПЭ), суб- и эпиретинального фиброза, формирования ятрогенной субретинальной неоваскулярной мембраны [19, 22, 23, 25, 26, 29, 35]. Многочисленными морфологическими и цитохимическими исследованиями было показано, что для выполнения избирательного лазерного воздействия существенное значение имеет степень абсорбции лазерного излучения различного спектрального состава пигментсодержащими структурами тканей ХРК. При этом с увеличением длины волны лазерного излучения уменьшается повреждающее действие на сенсорную сетчатку [1, 14, 21, 27]. Также наряду со спектральным составом лазерного излучения важнейшим условием избирательного лазерного воздействия на сетчатку является уровень его энергетических параметров [24, 28, 37]. Было доказано, что офтальмоскопически видимые лазерные ожоги не являются показателем достижения желаемого терапевтического эффекта [13, 20, 24, 34, 39]. Благодаря многочисленным экспериментальным исследованиям установлено, что для успешного лечения многих заболеваний заднего отдела глаза достаточно воздействовать лишь на клетки РПЭ субпороговыми дозами лазерного излучения, сохраняя при этом практически неизменной структуру прилежащих слоев сенсорной сетчатки и хориокапилляров (ХК) [8, 13, 27, 33]. При этом минимальное повреждение РПЭ способствует его регенерации, активации в нем метаболических процессов, восстановлению архитектоники наружных структур гематоретинального барьера, что и приводит к терапевтическому эффекту [13, 33].

Одним из маркеров функционального и структурного повреждения на субклеточном уровне при различных воздействиях, в том числе и при воздействии лазерным излучением, является нарушение оптимального уровня трансмембранной ионной асимметрии ионов кальция в клетке [10, 38]. Ион кальция Ca2+ является одним из ключевых компонентов сложной системы внутриклеточного метаболизма нервных и глиальных клеток [4, 12]. Концентрация ионов кальция в цитозоле клетки регулируется за счет одновременной энергозависимой работы Са²⁺-транспортирующих систем плазматической мембраны, эндоплазматического ретикулума и митохондрий [4, 16, 17, 36]. Как повреждение клеточных мембран, так и деэнергизация митохондрий при действии различных повреждающих факторов оказывают влияние на распределение кальция в клетке, что приводит к дальнейшему расстройству энергетического и пластического метаболизма вследствие активации ионами Са²⁺ мембранно-связанных эндогенных фосфолипаз митохондрий и плазмолеммы, внутриклеточных Са²⁺-зависимых протеаз и эндонуклеаз и в итоге к развитию апоптоза [12, 15].

В настоящее время в офтальмологической практике применяется ряд субпороговых лазерных технологий, при которых не происходит повышения температуры в точке приложения лазерной энергии и прилежащих к ней слоях сетчатки до уровней, вызывающих денатурацию белковых структур. Это позволяет прецизионно воздействовать на микроструктуры ХРК, снижая риск развития негативных изменений в сенсорной сетчатке и хориокапиллярном кровотоке [6, 27, 33]. При этом офтальмоскопически видимого повреждения в точке приложения энергии и смежных слоях сетчатки не наблюдается. Также было отмечено, что для получения порогового повреждения сетчатки, регистрируемого при ангиографии, мощность должна быть в 2,7 раза ниже, чем для получения офтальмоскопически видимого. При этом на морфологическом уровне при применении субпороговых лазерных технологий происходит селективное повреждение абсорбирующих структур, которое может ограничиться субклеточным уровнем с минимальными функциональными нарушениями небольшого пула клеток и выявляться лишь при электронной микроскопии [9, 20].

К субпороговым лазерным технологиям, позволяющим избежать необратимых изменений в структурах ХРК, относятся транспупиллярная термотерапия (ТТТ), субпороговое воздействие лазерным излучением видимого (0,532 мкм) и инфракрасного (0,81 мкм) диапазонов длин волн в непрерывном режиме и в режиме субпороговой микроимпульсной ЛК (СМИЛК). При ТТТ воздействуют лазерным излучением с низким уровнем мощности при экспозиции длительностью от 1 до 1,5 мин [28, 31, 32]. При использовании непрерывного лазерного излучения видимого и инфракрасного диапазонов длин волн в субпороговом режиме уменьшают экспозицию импульса воздействия [7, 11, 30] или снижают уровень мощности лазерного излучения [6]. При СМИЛК подают требуемую энергию лазерного излучения не за один импульс, а используют пакеты повторяющихся микроимпульсов [18].

Цель исследования — сравнительное изучение морфологических и гистохимических изменений в тканях ХРК при субпороговом воздействии лазерным излучением на длинах волн 0,532 и 0,81 мкм в непрерывном и микроимпульсном режимах, а также в режиме ТТТ.

Морфологическое исследование проводили на 64 глазах 32 кроликов породы шиншилла серый обоих полов массой 2—2,5 кг. В работе использовали лазерную офтальмологическую установку Simphony фирмы «IRIDEX» (США) на основе двух лазеров: твердотельного ИАГ-лазера с удвоением частоты излучения на длине волны 0,532 мкм, а также диодного лазера с излучением на длине волны 0,81 мкм в непрерывном, микроимпульсном режимах и в режиме ТТТ. Лазерное излучение на глазном дне кроликов фокусировали с помощью контактной линзы Гольдмана. В зависимости от используемой субпороговой технологии лазерного воздействия животные были разделены на 4 группы по 8 кроликов (16 глаз в каждой). Левые глаза всех подопытных животных служили контролем. Животных выводили из эксперимента методом воздушной эмболии через 1, 8 и 30 сут.

В 1-й группе субпороговое воздействие проводили непрерывным излучением диодного лазера на длине волны 0,81 мкм. Предварительно определяли уровень пороговой мощности излучения (появление очага коагуляции 1-й степени по классификации F. L’Esperance) в фокальной плоскости системы наведения щелевой лампы, затем мощность снижали на 30% [6]. При этом параметры коагуляции были следующие: мощность излучения 0,25—0,36 Вт, длительность воздействия 0,2 с, диаметр пятна 200 мкм. Во 2-й группе воздействовали субпороговым излучением диодного лазера на длине волны 0,81 мкм в микроимпульсном режиме. Также предварительно получали коагулят 1-й степени при экспозиции 0,1 с, затем лазер перестраивали в микроимпульсный режим, увеличив экспозицию до 0,3 с при той же мощности. Параметры коагуляции: мощность излучения 0,31—0,33 Вт, диаметр пятна 125 мкм. В 3-й группе применяли субпороговое воздействие с использованием непрерывного излучения на длине волны 0,532 мкм [7, 11, 30] с предварительным определением уровня пороговой мощности при экспозиции 0,2 с, затем длительность воздействия уменьшали до 0,1 с. Параметры коагуляции: мощность излучения 0,07—0,09 Вт, диаметр пятна 200 мкм. В 4-й группе проводили ТТТ непрерывным лазерным излучением на длине волны 0,81 мкм мощностью 0,2 Вт при диаметре пятна излучения 3 мм и экспозиции 1 мин [31, 32].

Энуклеированные глаза фиксировали в 2,5% охлажденном растворе глутаральдегида. Вырезали участки стенки глазного яблока, подвергшиеся субпороговому лазерному облучению (отграниченные видимыми коагулятами). Полученные образцы дофиксировали в 1% растворе осмиевой кислоты, обезвоживали в спиртах и заключали в смесь эпоксидных смол эпон—аралдит. Полутонкие срезы, окрашенные полихромным красителем, исследовали и фотографировали на Фотомикроскопе III. Ультратонкие срезы контрастировали по Рейнольдсу и исследовали на трансмиссионном микроскопе EM-10C («Opton», Германия). Фоторегистрация изображений со светового микроскопа осуществлялась на цифровую фотовидеокамеру в составе аппаратно-программного комплекса автоматической морфоденситометрии ДиаМорф Объектив компании «ДиаМорф».

Часть глаз (8) фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в спиртах и заливали в парафин для последующего гистохимического исследования по методу Косса (метод выявления фосфата кальция в гистологических препаратах путем их импрегнации раствором нитрата серебра, при этом участки, содержащие фосфат кальция, окрашиваются в черный цвет). Гистохимические препараты подвергались морфометрическому анализу с применением компьютерной телефотометрической программы Видеотест. Обработка полученных количественных данных проводилась с помощью компьютерных статистических программ. Достоверным считали отличие при р<0,05.

Сравнительный анализ морфологических изменений ХРК при указанных выше субпороговых лазерных воздействиях через 1 сут показал, что при всех видах субпороговых лазерных воздействий основные изменения происходили на уровне РПЭ и прилежащего слоя фоторецепторов (ФР). При субпороговом воздействии непрерывным излучением на длинах волн 0,532 и 0,81 мкм эти изменения были наиболее выражены и заключались в отеке и вакуольной дегенерации клеток РПЭ, фрагментации и отеке наружных сегментов ФР, разрежении наружного ядерного слоя (НЯС) за счет локального некробиоза ядер ФР и межклеточного отека. Во внутреннем ядерном слое и слое нервных волокон также имел место межклеточный и межволоконный отек. При СМИЛК и ТТТ выявляли прерывистость РПЭ с мелкими вакуолями в базальном отделе и перинуклеарный отек клеток РПЭ с неравномерной пигментацией соответственно. Наружные сегменты ФР также были частично фрагментированы. В НЯС наблюдали расширение межклеточных пространств. Внутренние слои сетчатки практически не претерпевали каких-либо изменений. Мембрана Бруха (МБр) была неравномерно истончена, но сохраняла свою целостность во всех группах исследования. Проходимость ХК была нарушена, в сосудах среднего калибра (ССК) отмечали стаз крови различной степени выраженности во всех группах воздействия. Однако эти изменения были более выражены при субпороговом воздействии непрерывным излучением на длинах волн 0,532 и 0,81 мкм, чем при СМИЛК и ТТТ (рис. 1).

При сравнительном анализе морфологических изменений ХРК через 8 сут было выявлено, что при всех видах воздействия отмечались признаки неполного восстановления РПЭ на фоне неоднородной пигментации слоя клеток РПЭ. Уменьшалась отечность слоя ФР и выявлялась неравномерная регенерация наружных сегментов ФР различной степени выраженности. При субпороговом воздействии непрерывным излучением на длинах волн 0,532 и 0,81 мкм в НЯС определялось уменьшение разреженности клеток вследствие уменьшения межклеточного отека и гипертрофии мюллеровских клеток. Внутренние слои сетчатки также были значительно менее отечны, чем в острый период, и содержали проминирующие отростки мюллеровских клеток. При СМИЛК и ТТТ в НЯС не отмечалось каких-либо структурных нарушений, хотя отдельные участки межклеточного отека наблюдались. Внутренние слои имели неизменную послойную структуру, несмотря на локальную и незначительную отечность клеток. МБр сохраняла свою целостность. При всех видах субпорогового воздействия кровоток в ХК и ССК был нарушен за счет спазма сосудистой стенки и отека эндотелиальных клеток, однако при СМИЛК ХК и ССК уже были частично проходимы (рис. 2).

Сравнительный анализ морфологических изменений ХРК через 30 сут показал, что при всех видах субпороговых лазерных воздействий происходило полное восстановление РПЭ и его пигментации, однако местами отмечали локальную неравномерность распределения пигмента в слое РПЭ. Слой ФР приобретал свое нормальное строение, хотя при воздействии непрерывным субпороговым излучением отмечали увеличение толщины слоя ФР, что могло свидетельствовать о незавершенной дифференцировке наружных сегментов ФР. НЯС восстанавливал свою обычную структуру. После воздействия непрерывным субпороговым излучением на длинах волн 0,81 и 0,532 мкм сохранялись малоклеточные зоны в НЯС, частично замещавшиеся гипертрофированными мюллеровскими клетками. Внутренний ядерный слой приближался к своему нормальному строению. МБр прослеживалась на всем протяжении при всех видах субпороговых воздействий, но при воздействии непрерывным субпороговым излучением на длинах волн 0,81 и 0,532 мкм к этому сроку все еще оставалась истонченной. Восстановление кровотока происходило во всех случаях, однако при ТТТ диаметр ХК и ССК оставался меньше исходного (рис. 3).

С помощью просвечивающего электронного микроскопа были выявлены наиболее характерные ультраструктурные изменения ХРК при воздействии лазерным излучением исследуемых субпороговых технологий, которые не удавалось выявить при исследовании методом световой микроскопии. В то же время эти изменения ХРК оказывали существенное влияние на метаболизм клеток в зоне воздействия. Важнейшее значение для сенсорной сетчатки имеет состояние ее кровотока и клеток РПЭ, нормальная структура которых представлена на рис. 4.

Через 1 сут после субпорогового лазерного воздействия основные изменения наблюдали в слоях РПЭ, ХК и ФР. В проекции лазерного воздействия отмечали тромбоз и непроходимость ХК, гипопигментацию и частичную деструкцию ряда внутриклеточных органелл, главным образом митохондрий. Наряду с этим апикальная, базальная клеточные мембраны РПЭ и подлежащая МБр сохраняли свою непрерывность. Однако повышенная проницаемость мембран приводила к скоплению жидкости между РПЭ и слоем ФР. Вследствие этого наружные сегменты ФР были неравномерно отечными, с локально поврежденной наружной мембраной, что позволяло отдельным дискам или их конгломератам выходить в субретинальное пространство. Снижение макрофагальных функций части клеток РПЭ способствовало субретинальному накоплению дисков (рис. 5).

Через 8 сут происходила внутриклеточная регенерация клеток РПЭ, что проявлялось прежде всего увеличением количества гранул меланина в апикальной цитоплазме клеток как своеобразная компенсаторная гиперплазия в ответ на повреждение органелл в результате воздействия субпороговым лазерным излучением. Отмечали частичное восстановление ХК кровотока и макрофагальной функции РПЭ в проекции лазерного воздействия, в результате чего уменьшалось количество тканевого детрита в слое ФР. Межклеточный отек в слое ФР при этом становился менее выраженным (рис. 8).

Через 30 сут после субпорогового лазерного воздействия морфология РПЭ, включая состояние внутриклеточных органелл в зоне воздействия, практически полностью восстанавливалась, равно как и его макрофагальная и трофическая функции (рис. 9).

Для оценки функциональной сохранности микроструктур ХРК проводилось сравнение площади и уровня оптической плотности гранул фосфата кальция в сенсорной сетчатке в динамике в зависимости от технологии воздействия на сенсорную сетчатку. При этом за исходные уровни были приняты показатели площади гранул (1,31±0,11 мкм²) и показатели оптической плотности гранул кальция (0,09±0,002 усл. ед.) в контрольной группе. Помимо этого, рассчитывали критерии достоверности различий воздействия указанных выше субпороговых технологий (табл. 1, 2).

Так, на основании приведенных в табл. 1 и 2 данных и исходных показателей площади и уровня оптической плотности включений в сенсорной сетчатке в норме (1,31±0,11 мкм² и 0,09±0,002 усл. ед. соответственно) выявили четкую тенденцию к увеличению этих показателей через 1 и 8 сут и соответственно к уменьшению к концу 30-х суток при всех видах воздействия на сенсорную сетчатку. Наиболее выраженные изменения площади гранул отмечали к концу 8-х суток в 1-й и 3-й группах (р<0,05). Во 2-й и 4-й группах (СМИЛК и ТТТ соответственно) через 8 сут происходили не столь значительные изменения площади гранул фосфата кальция в сенсорной сетчатке (р<0,05). Вместе с тем в 3-й группе продолжался рост уровня оптической плотности, в то время как при других методах к концу 30-х суток имело место его снижение (рис. 12, 13).

При сравнительном анализе было выявлено, что непрерывное лазерное излучение на длинах волн 0,81 и 0,532 мкм в субпороговых режимах вызывает изменения в тканях хориоретинального комплекса с вовлечением всех слоев сетчатой оболочки, в то время как при воздействии лазерным излучением на длине волны 0,81 мкм в микроимпульсном режиме и в режиме ТТТ основные изменения происходят исключительно в наружных слоях сетчатки без выраженных изменений внутренних слоев.

Электронно-микроскопическое исследование позволило расширить представления о степени и уровне изменений в ХРК после воздействия субпороговым лазерным излучением, особенностью которого следует считать ультраструктурные повреждения клеточных мембран и органелл, в основном митохондрий внутренних сегментов ФР и РПЭ, повреждение которых ведет к нарушению клеточного метаболизма.

Воздействие лазерным излучением на длинах волн 0,81 и 0,532 мкм в субпороговых режимах через 1 сут во всех случаях приводит к дисбалансу ионов Са²⁺, вызывающему статистически значимое (р<0,05) нарушение клеточного метаболизма, нарастающего к концу 8-х суток; через 30 сут в клетках сенсорной сетчатки отмечены частично обратимые метаболические нарушения различной интенсивности. Наиболее выраженные изменения клеточного метаболизма выявлены при воздействии непрерывным лазерным излучением на длинах волн 0,81 и 0,532 мкм в субпороговых режимах.

Ультраструктурные повреждения органелл клеток ХРК являются в основном обратимыми; индуцируя процессы внутриклеточной регенерации, они обеспечивают адекватное функционирование жизнеспособных клеток и образуемых ими тканей, что и лежит в основе терапевтического действия субпороговых лазерных технологий.

Морфологические изменения в структурах ХРК в каждой из четырех групп вызывают соответствующие метаболические нарушения в сенсорной сетчатке. Сравнительное электронно-микроскопическое и гистохимическое исследование во всех группах показало корреляционную зависимость динамики ультраструктурных и гистохимических изменений в структурах ХРК. Это позволило выделить при субпороговых лазерных технологиях наряду с офтальмоскопическим, ангиографическим и морфологическим порогами повреждения структур ХРК также метаболический порог, выявляемый с помощью гистохимических и электронно-микроскопических исследований.

Субпороговые лазерные вмешательства в микроимпульсном режиме и в режиме ТТТ наиболее избирательны и прецизионны по сравнению с другими видами субпороговых лазерных технологий, что имеет принципиальное значение при использовании этих технологий в лечении заболеваний макулярной области.