Наследственная оптическая нейропатия (НОН) - двустороннее поражение зрительного нерва с развитием его частичной атрофии, которое возникает преимущественно у детей и людей молодого и среднего возраста.
НОН относится к группе митохондриальных заболеваний и характеризуется нарушением работы электронтранспортной цепи митохондрий, снижением уровня окислительного фосфорилирования. Повреждение дыхательной цепи митохондрий приводит к повышенному образованию активных форм кислорода (АФК) и снижению продукции АТФ - основного источника клеточной энергии. Все это приводит к гибели ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) и их аксонов, развитию атрофии зрительного нерва (АЗН) и выраженному снижению зрительных функций. Митохондриальная патология может быть вызвана мутациями как в митохондриальном, так и ядерном геноме.
Наследственные заболевания зрительного нерва классифицируют в зависимости от типа их наследования, выделяя четыре основные группы: аутосомно-доминантные, митохондриальные, аутосомно-рецессивные и X-сцепленные оптические нейропатии (ОН) [1]. Среди всех НОН наиболее часто встречаются аутосомно-доминантная ОН (АДОН), возникающая в результате мутаций в ядерной ДНК (яДНК), и НОН Лебера (НОНЛ), связанная с мутациями в митохондриальной ДНК (мтДНК).
НОН являются наиболее распространенными митохондриальными заболеваниями, в совокупности они встречаются с частотой 1:10 000 населения [2-4]. Описано, что НОНЛ встречаются с частотой 1:31 000 на северо-западе Англии, при этом частота носительства мутаций НОНЛ у новорожденных определена как 1:8500 [2]; в Нидерландах - с частотой 1:39 000, в Финляндии - 1:50 000 [5, 6]. НОНЛ становятся причиной слепоты у 2% людей с официально признанной слепотой в Австралии [7].
Распространенность АДОН на севере Англии оценивают как 1:35 000 [8]. Однако по данным исследования [9], основанного на клинической диагностике заболевания до проведения молекулярно-генетических анализов, распространение АДОН в Дании оценивается как 1:12 000.
В Российской Федерации подобные исследования не проводили. По данным ФГБУ «НИИ глазных болезней», в структуре больных с ОН различного генеза клинические случаи НОН составляют 6,7%, в то же время генетически верифицированные случаи НОН - 2,7%.
Однако некоторые авторы [10] отмечают, что распространенность заболевания недооценивают, так как у части пациентов НОН не диагностируют или этиологию заболевания диагностируют некорректно. В то же время у многих носителей мутаций клиническая картина НОН не развивается в течение жизни. Подобные результаты обусловлены некоторыми особенностями наследственных заболеваний, связанными с неполной пенетрантностью, в результате чего доля лиц, у которых обнаруживают проявление мутантного гена, среди всех унаследовавших этот ген, значительно варьирует. Так, в настоящее время известно, что только у 50% мужчин и 10% женщин с мутацией m.11778G>A развивается НОНЛ в течение жизни [8, 11]. Пенетрантность при АДОН варьирует от 43 до 90% по данным различных авторов [9, 12]. Таким образом, мутации, приводящие к НОН, являются необходимым, но недостаточным условием для повреждения зрительного нерва. АДОН свойственна также вариабельная экспрессия, характеризующаяся тем, что степень выраженности клинических проявлений гена широко варьирует от субклинических изменений функций зрения до полной слепоты. Поэтому родственники больного, имеющие незначительные нарушения зрительных функций, могут не знать об имеющейся патологии зрительного нерва.
90% всех случаев НОНЛ обусловлены тремя первичными мутациями мтДНК: m.11778G>A в гене ND4, m.3460G>A в гене ND1 и m.14484T>С в гене ND6 [1, 13]. Примерно 10% индивидов с клинической картиной НОНЛ не имеют ни одной из трех основных мутаций. В настоящее время, согласно специализированной базе данных митохондриального генома Mitomap 2014 г., официально признано еще 11 первичных, но более редких мутаций (m.3635G>A, m.3700G>A, m.3733G>A, m.4171C>A, m.10663T>C, m.14459G>A, m.14482C>A, m.14482C>G, m.14495A>G, m.14502T>C m.14568C>T), а также большое число потенциальных (кандидатных) мутаций мтДНК, патогенность которых в настоящее время неокончательно доказана в силу единичных случаев наблюдения [14]. В то же время во многих публикациях авторы [15, 16] приводят новые дополнительные первичные и потенциальные мутации мтДНК, связанные с НОНЛ, но еще не включенные в генетические базы, отмечая, что список мутаций неизбежно будет пополняться. Исследования генома таких пациентов непросты, так как мтДНК высоко полиморфна [17]. Впервые выявленные изменения мтДНК не могут быть отнесены к патогенным, пока их не обнаружат в двух и более независимых семьях с проявлениями НОНЛ, а также не проведут биохимические исследования для измерения активности отдельных звеньев комплексов дыхательной цепи с использованием гибридных клеток.
В настоящее время известно более 200 мутаций гена OPA1 (3q28-q29), ответственных за развитие АДОН [18-20]. Однако по данным литературы [8, 9, 19], эти изменения удается обнаружить у 32-89% пациентов с АДОН. Такой разброс связан отчасти с различными клиническими критериями, используемыми для отбора пациентов. С другой стороны, АДОН - генетически гетерогенное заболевание. В настоящее время идентифицированы мутации гена OPA3 (19q13.2-13.2), однако доля выявленных мутаций в этом гене среди больных невелика и составляет около 3% случаев [20]. Другие локусы для этого заболевания - это OPA4 (8q12.2-q12.3) [21], OPA5 (22q12.1-q13.1) [22], OPA8 (16q21-q22) [23], но гены в них еще неизвестны. Описаны также альтернативные типы генетических дефектов, например крупные структурные перестройки - делеции нескольких экзонов и даже всей кодирующей области гена OPA1, встречающиеся в 10% случаев [18, 24], которые не могут быть зарегистрированы в гетерозиготном состоянии с помощью секвенирования.
Большое разнообразие мутаций в митохондриальном и ядерном геноме затрудняет поиск патологических изменений митохондриальной и ядерной ДНК, являющихся причиной НОН. В нашей работе молекулярно-генетическое исследование 12 первичных мутаций мтДНК, выбранных согласно данным базы Mitomap 2012 г. (трех наиболее часто встречающихся мутаций - m.14484T>C, m.3460G>A m.11778G>A, редких девяти мутаций - m.3733G>A, m.4171C>A, m.10663T>C, m.14459G>A, m.14482C>G, m.14482C>A, m.14495A>G, m.14502T>C, m.14568C>T), и мутаций гена OPA1 яДНК в «горячих» участках (экзонах 8, 14, 15, 16, 18, 27, 28) у 100 пациентов с клиническим диагнозом НОН позволило верифицировать заболевание в 40% случаев. Это согласуется с работами других авторов [20], в которых молекулярно-генетическое исследование наиболее часто встречающихся мутаций верифицирует заболевание в 45% случаев.
Из 40 пациентов с генетически верифицированным диагнозом НОН в нашем исследовании мутация m.11778G>A была обнаружена у 22 (57,9% от всех мутацией мтДНК), m.3460G>A - у 8 (21,1%), m.14484T>C - у 6 (15,8%), редко встречающаяся мутация m.4171C>A (5,2%) - у 2 (всего 38 пациентов с НОНЛ, 27 семей; соотношение женщины:мужчины - 1:6,6) (см. таблицу).
У 38 (89,5%) генетически типированных пациентов с НОНЛ мутации мтДНК выявлены в гомоплазмическом состоянии (все копии мтДНК мутантные), в 4 (10,5%) случаях - в состоянии гетероплазмии (часть копий мтДНК мутантная, остальные копии нормальные). Гетероплазмию принято обозначать по содержанию мутантных копий в процентах.
Считают, что высокое содержание мутантной мтДНК при гетероплазмии или встречающаяся чаще гомоплазмия мутантных мтДНК в ткани-мишени является риском для развития заболевания при мутациях НОНЛ [26, 27]. Заболевание у четырех пациентов манифестировало при следующем уровне гетероплазмии в клетках крови: у двух пациентов с m.14484T>C с гетероплазмией 33 и 68%, а также у двух пациентов с m.3460G>A - 48 и 76%. Таким образом, в нашем исследовании у двух пациентов НОНЛ манифистировал при низком содержании мутантной мтДНК.
Неполная генетическая выявляемость НОН отчасти, вероятно, обусловлена тем, что в нашей выборке пациентов встречаются случаи НОНЛ, причиной которых являются более редкие мутации митохондриального генома. Небольшая доля генетической верификации АДОН, возможно, связана с ограничением задач исследования и поиском мутаций только в «горячих» точках гена OPA1, наиболее часто встречающихся у больных АДОН западноевропейской популяции [20]. Вероятно, спектр и частоты мутаций в гене ОРА1 у пациентов, проживающих на территории Российской Федерации, имеют свои отличия. Однако при этом нельзя полностью исключить возможность того, что определенные спорадические ОН могут быть фенокопиями, вызванными негенетическими причинами, но имеющими схожие клинические характеристики.
Клиническая картина НОН хорошо известна [1, 25, 28], характеризуется специфичностью проявлений, но, как показывают многие исследования, может отличаться особенностями течения, возрастом манифестации заболевания, низкими показателями отягощенности наследственного анамнеза по АЗН. Это затрудняет в некоторых случаях диагностику НОН по клиническим признакам.
Часть пациентов с НОНЛ могут иметь нетипичную клиническую картину с началом заболевания в детстве и медленно прогрессирующим клиническим течением, подобным АДОН, а также с поздним началом заболевания в пожилом возрасте, которое ошибочно может быть расценено как двусторонняя ишемическая ОН [25, 29]. Возможность восстановления зрения при НОНЛ также может приводить к ошибочной оценке этиологии НОН как неврита. АДОН также может протекать нетипично - с острым началом заболевания, подобным НОНЛ [30], ОН с поздним началом [31] и ОН с самопроизвольным восстановлением остроты зрения [32].
Семейный анамнез по АЗН при первичном осмотре и наблюдении пациентов до результатов генетического исследования НОНЛ в нашей работе был установлен только в 19,4% случаев, что согласуется с работами многих авторов [10, 20], которые также отмечают высокий процент спорадических случаев. Лишь только отсроченные данные наследственного анамнеза (через 5 лет) показывают значительно большее количество семейных форм заболевания (83,3% случаев) за счет получения новых сведений о родственниках самими пациентами, а также выявления новых случаев в семьях с прежде неотягощенным семейным анамнезом.
Особенности наследственных заболеваний, которые проявляются неполной пенетрантностью и вариабельной экспрессией, полиморфизмом клинических проявлений, сложностью выявления наследственных признаков заболевания, а также генетическая гетерогенность часто приводят к трудностям в распознавании и диагностировании НОН.
Вместе с тем, учитывая, что в основе НОН лежит поражение ГКС с последующей восходящей атрофией их аксонов, исследование внутренних слоев сетчатки в макулярной зоне, а также слоя нервных волокон сетчатки (СНВС) позволило в нашей работе выявить некоторые особенности структурных изменений сетчатки и зрительного нерва, которые имеют большую значимость для своевременной дифференциальной диагностики НОНЛ среди ОН иного генеза [33].
Спектральная оптическая когерентная томография (ОКТ), выполненная у пациентов в динамике, продемонстрировала определенную последовательность структурных изменений, характеризующуюся первоначальным истончением внутренних слоев сетчатки (ГКС, нервные волокна и внутренний плексиформный слой) в сочетании с отеком перипапиллярного СНВС, а также последующим развитием выраженных атрофических изменений во внутренних слоях сетчатки и лишь отсрочено - в перипапиллярной зоне. Более ранние и значимые структурные изменения возникают в носовом и нижнем секторах парафовеа, а также височном секторе перипапиллярного СНВС, что свидетельствует о повреждении папилломакулярного пучка.
Подобные структурные изменения, выявленные у пациента в острой стадии даже на этапе монокулярного поражения, дают возможность заподозрить наследственную этиологию ОН среди ОН иной этиологии еще до проведения генетического исследования, а также обосновывают клинический диагноз НОНЛ в генетически не верифицированных случаях. Выявление структурных особенностей сетчатки и зрительного нерва представляет большую ценность также в случаях с нетипичной клинической картиной НОНЛ, с которой подчас приходится сталкиваться офтальмологу.
Однако структурные изменения, выявленные в хронической стадии НОН, при обращении пациента после 6 мес от начала заболевания, будут идентичны для НОНЛ и АДОН, а также могут быть обнаружены у части пациентов с АЗН другой этиологии.
Исследование биохимического дефекта окислительного фосфорилирования в митохондриях при НОНЛ и АДОН - альтернативный путь для выявления митохондриальной дисфункции при клинически диагностированной НОН без генетической верификации мутации, а также для установления причинно-следственной связи между изменениями мтДНК и яДНК и НОН.
Известно, что НОН возникают в результате дисфункции митохондрий, которые играют главную роль во многих важнейших процессах, происходящих в клетке, таких как синтез АТФ путем окислительного фосфорилирования, продукция АФК, регуляция внутриклеточной концентрации ионов кальция и программируемая гибель клеток - апоптоз [34].
Во внутренней мембране митохондрий локализованы пять компонентов дыхательной цепи I-V (за исключением цитохрома С, находящегося в межмембранном пространстве), необходимые для процесса окислительного фосфорилирования, которые дают большую часть АТФ в клетках человека. Субъединицы комплексов дыхательной цепи митохондрий кодируются как ядерными, так и митохондриальными генами. Генетически детерминированное нарушение активности комплексов дыхательной цепи митохондрий, сопряженное со снижением продукции АТФ, лежит в основе развития митохондриальных заболеваний, и в частности НОН. Ткани, такие как нервная и мышечная, а также сетчатка, являются самыми энергозависимыми и особенно чувствительны к изменениям функций митохондрий. Приблизительно в 50% случаев митохондриальные болезни проявляются глазными нарушениями [35].
Для исследования митохондриальных заболеваний были созданы различные клеточные модели с митохондриальными дефектами, такими же как при митохондриальных заболеваниях, которые позволили выявить ряд особенностей при НОН.
Дисфункция I комплекса - наиболее частый дефект энергетического метаболизма митохондрий при митохондриальных ОН. Исследования с различными ингибиторами I комплекса подтверждают, что три частые первичные мутации мтДНК снижают синтез АТФ, идущий за счет субстратов I комплекса, что подтверждает наличие дефекта I комплекса при НОНЛ [36]. Снижение синтеза АТФ в результате повреждения I комплекса было обнаружено в фибробластах пациентов с различными мутациями ОРА1 [37, 38]. Наличие схожего биохимического дефекта при НОНЛ и АДОН было подтверждено при исследованиях скелетных мышц методом фосфорной магнитно-резонансной спектроскопии in vivo [39]. Кроме дефектов в I комплексе, биохимические исследования клеток пациентов с АДОН с мутациями в гене ОРА1 показали дефект активности циклооксигеназы и IV комплекса дыхательной цепи [37].
Учитывая, что в основе развития НОН лежат генетически детерминированное нарушение функций комплексов дыхательной цепи митохондрий и снижение продукции АТФ, а также изменение биоэнергетических функций митохондрий, в нашей работе была предложена методика дифференциальной диагностики НОН путем изучения мембранного потенциала митохондрий в культуре фибробластов кожи пациентов.
Известно, что важнейшим свойством митохондрий является способность поддерживать мембранный электрохимический потенциал, от которого зависят их многочисленные функции. Потенциал митохондрий образуется в результате работы комплексов дыхательной цепи, вдоль которых происходит транспорт электронов. Энергия, выделяемая при транспорте электронов, используется для выкачивания протонов из матрикса митохондрий в межмембранное пространство. В результате этого внутренняя мембрана митохондрий оказывается отрицательно заряженной изнутри и положительно заряженной снаружи. Уровень потенциала можно измерить при помощи митохондриальных флюоресцентных красителей, которые несут положительный заряд и накапливаются в митохондриях. Чем выше потенциал митохондрий, тем больше красителя войдет внутрь митохондрий и тем ярче будет окрашивание.
Бо́льшая часть энергии потенциала митохондрий расходуется на синтез АТФ, ингибирование протонной АТФазы олигомицином останавливает основной расход энергии, в то время как дыхательная цепь продолжает работать и уровень потенциала растет. Рост электрохимического потенциала при добавлении олигомицина - ингибитора АТФазы - может косвенно свидетельствовать о работоспособности дыхательной цепи митохондрий и позволяет оценить ее вклад в синтез АТФ.
В нашей работе для анализа дыхательной активности митохондрий в клетках больных и здоровых людей мы использовали предложенную еще в 1992 г. клеточную модель культуры фибробластов кожи [40]. Поскольку нарушение функций митохондрий у таких больных обнаруживают не только в нейронах, но и в других тканях, эта модель культуры клеток является наиболее удобной для диагностики и изучения механизмов митохондриальной патологии.
На рис. 1
Для того чтобы определить, какая часть энергии потенциала митохондрий расходуется на синтез АТФ, к фибробластам, окрашенным при помощи TMRE, добавляли олигомицин и измеряли интенсивность флюоресценции митохондрий до и через 30 мин после действия олигомицина (Заявка на выдачу патента на изобретение №2014125713 с приоритетом от 25.06.2014 «Способ диагностики наследственной оптической нейропатии»). Материалом для исследования служили фибробласты кожи 23 пациентов основной группы, в том числе 13 с НОНЛ, 2 с АДОН, 8 с НОН без выявленных мутаций, а также 6 здоровых лиц группы контроля. Обе группы были однородны по возрасту (критерий Колмогорова-Смирнова, p>0,1).
Изменение интенсивности флюоресценции митохондрий в результате добавления олигомицина представлено на рис. 2.
В линии клеток обследуемых группы контроля олигомицин вызывает увеличение интенсивности флюоресценции митохондрий на 106,7 условных единиц (у.е.) (33,3%). В то же время у пациентов с НОНЛ отмечалось снижение интенсивности флюоресценции митохондрий на 18,0 у.е. (–6,3%), обусловленных влиянием олигомицина.
Та же тенденция отмечена и у двух пациентов с АДОН, у которых в одном случае выявлено снижение интенсивности флюоресценции митохондрий под действием олигомицина на 48,1 у.е. (–13,4%), во втором - небольшое увеличение на 18,6 у.е. (4,7%).
У всех 8 пациентов с клиническим диагнозом НОН и не выявленным генетическим дефектом также было обнаружено снижение интенсивности флюоресценции на 45,1 у.е. (–13,4%).
Анализ полученных данных показал, что эффект олигомицина на уровень флюоресценции митохондрий статистически достоверно отличался у пациентов с НОНЛ и НОН без генетической верификации от эффекта на уровень флюоресценции в группе контроля (p<0,005).
На основании полученных результатов можно заключить, что изменение потенциала митохондрий под действием олигомицина, отражающее их способность синтезировать АТФ, в клеточных линиях пациентов, страдающих НОНЛ и АДОН, а также у пациентов с НОН не верифицированной мутацией митохондриального или ядерного генома, снижено по сравнению с изменениями в клетках обследованных группы контроля. Таким образом, предлагаемая клеточная модель может быть использована для дифференциальной диагностики митохондриальных нарушений.
Кроме того, впервые в России нами была создана коллекция линии фибробластов пациентов с НОНЛ и АДОН, которая позволяет в течение длительного времени исследовать патогенетические механизмы митохондриальных заболеваний зрительного нерва, а также изучать новые терапевтические подходы.
Нарушения в дыхательной цепи митохондрий обнаруживают не только у пациентов с клиническими проявлениями НОНЛ, но и у клинически здоровых носителей мутации. Истинные механизмы, переводящие митохондриальную дисфункцию в результате мутаций мтДНК в избирательную гибель ГКС, остаются предметом споров [26]. В частности, обсуждается, что является более значимым в патогенезе НОНЛ: биоэнергетический дефект или хронический окислительный стресс, или комбинация этих нарушений оказывает значимое влияние на специфическую систему ГКС. Большинство авторов считают, что комбинация этих механизмов ведет к изменению мембранного потенциала митохондрий, снижая порог для митохондриальных водопроницаемых пор МРТР (mitochondrial permeability transition pore), регулирующих апоптоз. При этом различные ткани проявляют дифференцированную чувствительность к дефектам окислительного фосфорилирования [41].
Комплексы I и III дыхательной цепи митохондрий являются главными производителями АФК - супероксидных радикалов, образующихся в результате утечки электронов в процессе их транспорта. Превышающие определенный уровень АФК могут нарушать нормальные клеточные функции, повреждать белки, липиды, ферменты дыхательных комплексов и цикла трикарбоновых кислот, ДНК, увеличивая частоту митохондриальной генетической нестабильности и накопления соматических мутаций [42].
Другим важным повреждающим фактором является перекисное окисление липидов (ПОЛ), которое может нарушать несколько митохондриальных функций, в том числе окислительное фосфорилирование, барьерные качества внутренней мембраны, сохранение митохондриального мембранного потенциала и митохондриальной буферной емкости ионов Са2+ [43]. В частности, важной мишенью для АФК является кардиолипин, фосфолипид в составе внутренней мембраны, участвующий в митохондриальнозависимом апоптозе, стабильности и динамике митохондрий. АФК также могут являться сигнальными молекулами, регулируя функцию и экспрессию многих митохондриальных белков, вовлеченных в апоптоз, динамику и митохондриальный биогенез. Поэтому установление баланса между продукцией АФК и их ликвидацией антиоксидантными энзимами (супероксиддисмутазой, глутатионпероксидазой, пероксиредоксинами) является чрезвычайно важным процессом [35, 42]. Апоптоз, предположительно, является финальной стадией нейродегенеративного процесса, поражающего ГКС при митохондриальных НОН, однако прямых подтверждений этому не найдено [44].
Учитывая вышеописанный патогенез заболевания, терапия митохондриальных НОН направлена на усиление митохондриальных функций и предотвращение окислительного стресса. Однако в настоящее время эффективность терапевтического воздействия ограничена. Были исследованы различные комбинации витаминов и кофакторов (B
Однако объективные доказательства положительного эффекта большинства препаратов при НОНЛ не были получены [46]. В то же время применение таких антиоксидантов, как идебенон и EPI-743, в ходе исследований дало обнадеживающие результаты [10, 47, 48].
Новым перспективным методом лечения является генотерапия - в настоящее время в мире несколько проектов по генной терапии НОНЛ находятся на различных стадиях испытаний.
Несмотря на отсутствие четко доказанной эффективности для коррекции зрительных функций пациентов с митохондриальной НОН, врачи, а подчас и пациенты самостоятельно используют различные комбинации антиоксидантных и энерготропных препаратов для составления так называемых «митохондриальных коктейлей».
В нашей работе динамическое наблюдение за пациентами с НОНЛ выявило частичное восстановление остроты зрения у 6 пациентов (15,7% случаев среди всех пациентов с НОНЛ): у двух пациентов с мутацией m.11778G>A в гомоплазмическом состоянии, у одного пациента с мутацией m.3460G>A в гомоплазмическом состоянии, у двух пациентов с мутацией m.14484T>C в гетероплазмическом состоянии, у одного пациента с мутацией m.14484T>C в гомоплазмическом состоянии.
Все пациенты с НОНЛ, которые находились под нашим наблюдением, получали энерготропную терапию, улучшающую внутриклеточные процессы энергообмена и показанную при митохондриальной патологии. Однако механизмы восстановления зрения у части пациентов непонятны, не изучены они и другими авторами [49-51]. Неизвестно, является ли восстановление зрения самопроизвольным, обусловленным особенностями генетического дефекта или в определенной мере корректирующее влияние оказывает энерготропная терапия. Многие авторы [14] сообщают о возможности спонтанного клинического восстановления при НОНЛ, которое более вероятно возникает при благоприятной мутации m.14484T>C - до 37-65% случаев, менее вероятно при мутации m.3460G>A - до 22%, при мутации m.11778G>A - до 5% случаев.
Представленные методы клинической, молекулярно-генетической и цитологической диагностики позволяют в большинстве случаев выявлять митохондриальные НОН, а пациентам с митохондриальной патологией и неверифицированным генетическим дефектом рекомендовать расширенный поиск мутаций яДНК и мтДНК. Выявление этиологии заболевания дает возможность последующего прогнозирования течения заболевания зрительного нерва, позволяет рекомендовать пациенту адекватные способы лечения, а также определять прогноз для потомства пробанда и родственников, осуществлять пренатальную профилактику рождения детей с данным заболеванием, выявлять наличие мутации у потомков пробанда до начала клинических проявлений с целью диспансерного наблюдения, лечения, проведения разъяснительных мероприятий с рекомендациями по изменению образа жизни и ограничению влияния провоцирующих факторов на усугубление течения наследственного заболевания.
Перспективы лечения НОН неоднозначны, связаны с дальнейшим изучением патогенеза заболевания, разработкой новых препаратов и методов генотерапии.
Часть работы с клеточными культурами выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант №13-04-0031а).