Окклюзия ретинальных вен является тяжелым, широко распространенным сосудистым заболеванием сетчатки, характеризующимся внутрисосудистой или внешней обструкцией, приводящей к формированию интраретинальных кровоизлияний, экссудации жидкости и ишемии различной степени. Такое поражение сосудов сопровождается каскадом клеточных и воспалительных реакций, что нарушает нормальное взаимодействие регуляторных механизмов в поврежденной ткани. Возникает дисбаланс воспалительных и ангиогенных цитокинов, который, вероятно, определяет морфологические и функциональные нарушения органа зрения [1, 2].

Цитокины (ЦК) представляют собой группу медиаторов, участвующих в регуляции защитных реакций организма в ответ на внедрение патогенов или нарушение целостности тканей. В первую очередь, ЦК регулируют развитие местных защитных реакций в тканях с участием различных типов клеток крови, эндотелия, соединительной ткани, глии [3]. Защита на местном уровне развивается путем формирования типичной воспалительной реакции с ее классическими проявлениями — отеком и нарушением функции.

В настоящее время известно более 100 различных ЦК [4]. По биологической активности их распределили на несколько групп (семейств), среди которых наиболее известны интерфероны (ИФН), факторы некроза опухолей (ФНО), различные семейства интерлейкинов (ИЛ), ростовых факторов, хемокины семейства Т-хелперных клонов и регулирующие функции лимфоцитов [5]. Свойства Ц.К. весьма многообразны: они индуцируют, регулируют и ограничивают воспаление, стимулируют рост, пролиферацию, дифференцировку клеток, метаболизм. Для них характерны универсальность, взаимозаменяемость и плейотропность, т. е. одни и те же ЦК могут взаимодействовать с рецепторами различных клеток, при этом ЦК со сходным строением могут оказывать противоположное биологическое действие, а разные в структурном отношении ЦК — вызывать одинаковый эффект [3]. При всем многообразии функций у конкретных медиаторов преобладают определенные свойства.

По функциональной активности ЦК можно упрощенно сгруппировать следующим образом:

1) провоспалительные ЦК (ИЛ-1β, -6, -8, -12, -15, ИФН-γ, ФНО-α и др.) и хемокины — моноцитарный хемоаттрактантный белок-1 (MХБ-1), ИЛ-8, хемокин, выделяемый Т-клетками при активации (RANTES). Первые активируют Т- и В-лимфоциты, стимулируют хемотаксис, фагоцитарную и цитотоксическую активность, вторые ответственны за трафик (хемотаксис) иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления;

2) противовоспалительные ЦК: ИЛ-4, -10, -13, -17, рецепторный антагонист интерлейкина-1 (раИЛ-1) и др. Они ингибируют воспаление, угнетают синтез провоспалительных ЦК, стимулируют пролиферацию В-клеток, синтез иммуноглобулинов, антител, способствуют завершению острой фазы воспаления и формированию фиброза;

3) факторы роста: васкулярный эндотелиальный (ВЭФР), фибробластов (ФРФ), нервов (ФРН), тромбоцитарный (ТцФР), инсулиноподобный (ИПФР), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий (ГМ-КСФ), гранулоцитарный колониестимулирующий (Г-КСФ), трансформирующий (ТФР) и др. Активируют пролиферацию и дифференцировку клеток, участвуют в апоптозе и ангиогенезе, стимулируют «выживаемость» клеток.

Участие ЦК в иммунопатогенезе различных заболеваний не вызывает сомнений [6]. Раскрытие механизмов цитокиновой регуляции при патологии послужило толчком к внедрению в медицинскую практику новых методов цитокиновой (заместительной) и антицитокиновой терапии [7—9]. Офтальмология не стала исключением [10, 11]. Интерес к изучению тканевых и клеточных регуляторов в глазу возник относительно недавно. Так, первые исследования концентрации ЦК при увеитах относятся к началу 90-х годов ХХ века. Интересные данные были получены при оценке иммунного ответа после интраокулярной инъекции отдельных воспалительных ЦК и факторов роста в тканях энуклеированных глаз лабораторных животных [12, 13]. Многочисленные работы были посвящены исследованию воспалительной природы диабетических ретинопатии и макулярного отека, роли ВЭФР и воспалительных ЦК в патогенезе развития пролиферативной стадии [14—16]. Справедливо полагая, что обусловливающий снижение зрения макулярный отек имеет воспалительную природу, офтальмологи в противовоспалительной терапии стали применять кортикостероидный препарат триамцинолона ацетонида в интравитреальных инъекциях [17, 18]. Авторы отмечали положительный эффект, который выражался в редуцировании макулярного отека. Однако действие лекарства длилось недолго, а побочные эффекты препарата в виде вторичной стероидной глаукомы и катаракты заставили постепенно отказаться от его применения.

В настоящее время можно констатировать нарастающий интерес исследователей к изучению внутриглазного уровня (баланса) ЦК и раскрытию цитокиновых механизмов развития различных сосудистых заболеваний органа зрения, в том числе окклюзии вен сетчатки (ОВС).

Определенным прорывом в использовании антицитокиновой стратегии в современной офтальмологии стала разработка препаратов-ингибиторов ангиогенеза (анти-ВЭФР-антител, Avastin), эффективность которых доказана при различных сосудистых поражениях, включая ОВС [19].

Участие ВЭФР в патогенезе макулярного отека при ОВС изучено достаточно хорошо [2]. В настоящее время определено, что больные с ОВС характеризуются повышенным уровнем ВЭФР, при этом степень тяжести макулярного отека прямо коррелирует с уровнем ВЭФР и ИЛ-6 [2, 20]. Были выявлены также аналогичные взаимосвязи между уровнем ВЭФР, неоваскуляризацией радужки и сосудистой проницаемостью у пациентов с ишемической ОВС [21]. Очевидно, что чрезмерная сосудистая проницаемость, вызывающая макулярный отек, обусловлена повышенной секрецией ВЭФР. Однако при длительном существовании отек сетчатки способствует повреждению капилляров, поддержанию высокого уровня ретинальной ишемии, что в свою очередь стимулирует дальнейший выброс ВЭФР и воспалительных ЦК [1, 22]. Как известно, макрофаги и моноциты способны секретировать широкий спектр провоспалительных медиаторов, которые наряду с ВЭФР увеличивают сосудистую проницаемость. Кроме того, ИЛ-6 как один из важнейших индукторов острофазовых белков также может стимулировать повышенную секрецию ВЭФР [2, 23].

Несмотря на активное изучение роли ЦК в формировании и поддержании различных воспалительных и сосудистых реакций глаза, в настоящее время нет четких сведений об их количественном содержании в разные фазы постокклюзионных поражений сетчатки. Кроме того, отсутствуют данные об изменении концентрации цитокинов во внутриглазной влаге у пациентов с ОВС на фоне лечения анти-ВЭФР-антителами (ранибизумаб, Lucentis).

Цель исследования — оценить концентрацию внутриглазных цитокинов у больных с ОВС до и после проведения антиангиогенной терапии ранибизумабом, сопоставить полученные данные с клинической активностью заболевания и эффективностью лечения.

Исследование проводилось в Иркутском филиале МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова совместно с сотрудниками НИИ фундаментальной и клинической иммунологии (Новосибирск). Протокол исследования был утвержден Локальным этическим комитетом ИФ МНТК М.Г. Информированное согласие было получено от всех пациентов.

Проведено офтальмологическое обследование 44 пациентов с ОВС в возрасте от 46 до 79 лет (средний возраст 60,7±7,5 года), среди которых 18 — с окклюзией центральной вены сетчатки (ОЦВС) и 26 — с окклюзией ветви вены сетчатки (ОВВС). Соотношение мужчин и женщин — 10:34. Контрольную группу составили 20 пациентов с начальной неосложненной катарактой с высокой корригированной остротой зрения, ориентированные на рефракционную операцию, в возрасте от 49 до 71 года (средний возраст 60±6,1 года), соотношение мужчин и женщин — 11:9.

Критерием включения в основную группу исследования пациентов был макулярный отек на фоне ОЦВС или окклюзии височной ветви вены сетчатки на сроках давности от 3 нед до 3 мес. Критерии исключения — неоваскулярные поражения сетчатки и радужки, вторичная глаукома, предшествующие хирургические или лазерные вмешательства.

Всем пациентам с ОВС в лечебных целях делали инъекции ранибизумаба в разовой дозе 0,5 мг. После обработки операционной поверхности глазного яблока, непосредственно перед инъекцией выполняли парацентез передней камеры глаза, камерную влагу в количестве 100 мкл забирали с помощью инсулинового шприца с иглой 27-gauge. Затем жидкость помещали в стерильную пробирку и отправляли в морозильную камеру (–80 °С) до лабораторного анализа. Сразу после забора материала выполняли инъекцию ранибизумаба по стандартной технологии. В дальнейшем, через 1 мес, у всех пациентов снова осуществляли забор внутриглазной жидкости перед повторной инъекцией ранибизумаба.

Забор образцов влаги передней камеры глаза в контрольной группе осуществляли идентичным способом однократно перед началом хирургической операции.

В целях выявления прогностических критериев эффективности анти-ВЭФР-терапии все пациенты были разделены на 2 группы с достаточным (1-я группа) и недостаточным (2-я) клиническим эффектом. Критериями достаточности эффекта явились: повышение остроты зрения более чем на 0,05 ед, уменьшение толщины сетчатки в центре макулярной зоны более чем в 2 раза, улучшение электроретинографических показателей (повышение амплитуды a-, b-волны и осцилляторных потенциалов) через 1 мес после однократной инъекции ранибизумаба. Критериями его недостаточности были: снижение остроты зрения, недостоверные изменения толщины сетчатки в макуле и данных электроретинографии. В 1-ю группу (30 пациентов) вошли 9 человек с ОЦВС и 21 — с ОВВС. 2-ю группу составили 14 человек, из них 9 — с поражением ствола центральной вены сетчатки и 5 — с окклюзией височных ветвей.

Лабораторное исследование. Для определения уровня ЦК в исследуемых образцах влаги передней камеры глаза использовался метод протеомного мультиплексного анализа. Концентрацию 27 ЦК человека: раИЛ-1, ИЛ-1β, -2, -4—10, -12p70, -13, -15, -17A, эотоксина, ФРФ основного, Г-КСФ, ГМ-КСФ, ИФН -γ, индуцирующего продукцию ИФН-γ белка-10 (ИБ-10), МХБ-1, макрофагальных белков воспаления 1α и 1β (MIP-1α, -1β), ТцФР BB, RANTES, ФНО-α, ВЭФР — оценивали с помощью метода проточной флюорометрии [24] на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, «Bio-Rad», США) с использованием коммерческих тест-систем Human 27-Plex, в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Офтальмологическое обследование включало стандартные методы диагностики (визометрия, офтальмоскопия), а также дополнительные исследования морфофункционального состояния сетчатки — оптическую когерентную томографию (Cirrus HD-OCT, «Carl Zeiss Meditec Inc.», США) [26], флюоресцентную ангиографию сетчатки (TRC-50DX, «Topcon», Япония), ультразвуковую допплерографию сосудов глаза (Voluson 730 Pro, «General Electric», США) [27], компьютерную периметрию (Twinfield, «Oculus», США) и электроретинографию (ЭРГ) (ЕР-1000 РС, «Tomey», Япония).

Статистическая обработка данных осуществлялась методами одномерной статистики с расчетами критериев Манна—Уитни и Уилкоксона. Кроме того, для выявления наиболее информативных признаков различия в исследуемых группах применялся дискриминантный анализ с определением F-критерия Фишера. Все расчеты производились с помощью программы Statistica 8.0 («Stat Soft Inc.», США).

Сравнительный анализ содержания 27 ЦК во влаге передней камеры глаза пациентов основной и контрольной групп выявил у больных с ОВС статистически значимые изменения в уровне 11 Ц.К. По данным, представленным в табл. 1, видно, что исходно (до начала терапии ранибизумабом) у больных с ОВС регистрировалось увеличение концентрации ВЭФР, про- и противовоспалительных ЦК (ИЛ-6, -12 и ИЛ-10, -13 соответственно) и хемокинов (ИЛ-8, МХБ-1), при этом содержание раИЛ-1, ИЛ-9 и RANTES было достоверно ниже, чем в группе контроля. Следует подчеркнуть, что наиболее выраженные изменения в уровне исследуемых цитокинов отмечались в подгруппе больных с ОЦВС, тогда как у пациентов с ОВВС нарушения цитокинового профиля проявлялись в меньшей степени. Повышение концентрации ИЛ-15 было самым незначительным (на 70% при ОЦВС и на 39% при ОВВС), хотя и статистически достоверным.

Исследование уровня ЦК во влаге передней камеры глаза пациентов с ОВС в динамике проводимой терапии (через 1 мес после введения ранибизумаба) выявило достоверное снижение концентрации практически всех исследуемых ЦК (табл. 2). Как и ожидалось, после инъекции анти-ВЭФР-препарата произошло наибольшее изменение концентрации ВЭФР: 27-кратное снижение в группе ОЦВС и 5-кратное у пациентов с ОВВС. Кроме того, регистрировалось снижение уровня про- и противовоспалительных ЦК (ИЛ-6, -12 и ИЛ-10, -13, -15 соответственно) и хемокинов (ИЛ-8, MCP-1). Интересно, что раИЛ-1 и ИЛ-9 у больных с ОВС, несмотря на исходно более низкую концентрацию, чем у лиц группы контроля, также продемонстрировали снижение в ответ на инъекцию ранибизумаба.

Необходимо отметить, что достаточный клинический эффект проводимой анти-ВЭФР-терапии в подгруппе больных с ОВВС был достигнут в 81% случаев (у 21 из 26 пациентов), тогда как у больных с ОЦВС эффективность терапии была достоверно ниже — 50% (9 из 18 пациентов).

Согласно результатам сравнительного анализа исходного офтальмологического статуса в подгруппах больных с ОВС, оппозитных по клиническому эффекту анти-ВЭФР-терапии (табл. 3), состояние пациентов с недостаточным клиническим эффектом характеризовалось более выраженным утолщением сетчатки как в зоне fovea, так и в перипапиллярной, депрессией амплитуд а-волны ЭРГ и осцилляторных потенциалов (ОП). И это позволило, согласно разработанным нами ранее критериям [25], констатировать и охарактеризовать глубину ишемического поражения нейроретины I—III степени:

— I степень (легкая): наличие небольшой зоны неперфузии макулы (менее 1 квадранта), снижение ОП на 50—60% от нормы (до 30—20 мкВ), умеренное снижение амплитуды b-волны на 15—20% (до 110 мкВ);

— II степень (средняя): наличие средней зоны неперфузии макулы (от 1 до 2 квадрантов), снижение ОП на 65—80% от нормы (до 20—15 мкВ), умеренное снижением амплитуды b-волны на 20—30% (до 100 мкВ);

— III степень (тяжелая): наличие большой зоны неперфузии макулы (от 2 и более квадрантов), выраженное снижение ОП на 80% и выше (менее 15 мкВ), амплитуды b-волны на 40% и выше (менее 100 мкВ).

Как видно из табл. 3, именно эти параметры позволяют наиболее четко дискриминировать 2 группы — с достаточным и недостаточным клиническим эффектом. Так, у всех пациентов с низкой эффективностью терапии была определена II и III степень ишемии сетчатки по разработанной классификации [25].

Согласно данным сравнительного анализа исходного цитокинового статуса пациентов с ОВС, оппозитных по клиническому эффекту анти-ВЭФР-терапии (табл. 4), пациенты с недостаточным клиническим эффектом характеризовались значимым увеличением концентрации не только ВЭФР (что подтверждает глубину ишемии), но и хемокинов (ИЛ-8, МХБ-1), демонстрирующих степень выраженности воспалительного процесса, а также противовоспалительных ЦК (ИЛ-10, -13), что свидетельствует об интенсивности, но недостаточной эффективности работы компенсаторных механизмов, направленных на ограничение локального воспаления.

Как показали результаты проведенных исследований, предикторами недостаточного клинического эффекта антиангиогенной терапии в виде однократной инъекции ранибизумаба может выступать не только анатомическая локализация окклюзии вены сетчатки (у больных с ОЦВС эффективность ниже, чем с ОВВС), а и в большей степени ишемия сетчатки II, III степени, включение в патологический процесс зоны fovea, а также максимально высокий уровень ЦК (ВЭФР, МХБ-1, ИЛ-8, -10, -13). Полученные данные могут послужить основой для дальнейшего определения пороговых значений концентрации ЦК во влаге передней камеры глаза с помощью метода анализа ROC-кривых (ROC-анализ), что позволит повысить диагностическую точность прогностической модели в отношении клинической эффективности антиангиогенной терапии.

В целях определения механизмов анти-ВЭФР-терапии был проведен многофакторный дискриминантный анализ всей совокупности признаков, включая концентрацию исследуемых ЦК и основных офтальмологических показателей у пациентов с достаточным и недостаточным клиническим эффектом. Для осуществления расчетов всех пациентов разделили на 4 группы: по их исходному состоянию с последующим достаточным и недостаточным эффектом от анти-ВЭФР-терапии — на 1-ю и 2-ю группы, соответственно, и по состоянию после введения ранибизумаба с достаточным и недостаточным эффектом от антиангиогенной терапии — на 3-ю и 4-ю группы, соответственно. Дискриминантный анализ проводился по следующей схеме (см. рисунок): между пациентами внутри пар групп (1—2-я и 3—4-я группы) и внутри троек групп (1—3-я и 2—4-я группы).

Наиболее информативными критериями, позволяющими с высоким уровнем достоверности определить механизмы саногенетического эффекта ранибизумаба у пациентов с достаточным клиническим эффектом, было не только предсказуемое снижение концентрации ВЭФР (F=51,9; р<0,0001), но и изменение морфофункционального состояния ретинальной ткани: уменьшение толщины сетчатки в макулярной зоне (F=45,3; р<0,0001), увеличение амплитуд b-волны ЭРГ (F=8,7; р<0,006) и осцилляторных потенциалов (F=6,9; р<0,02). Введение ранибизумаба также способствовало существенной депрессии ЦК воспалительного звена: ИЛ-15 (F=16,1; р<0,0005), ИЛ-6 (F=13,7; р<0,001) и ИЛ-8 (F=8,6; р<0,01).

В случаях недостаточного клинического эффекта, механизм действия ранибизумаба, помимо снижения уровня ВЭФР (F=87,9; р<0,0001), сопровождался лишь изменениями уровня ЦК раИЛ-1 и ИЛ-12p70, что не вызвало существенного снижения макулярного отека и восстановления функциональной активности сетчатки.

Важным представляется результат, полученный при анализе совокупности всех исследуемых признаков между группами с достаточным и недостаточным клиническим эффектом лечения в до- и послеоперационном период (1—2-я и 3—4-я группы). Единственным в исходном состоянии и наиболее значимым в послеоперационном периоде критерием, определяющим различие исследуемых групп, явился индекс осцилляторных потенциалов, характеризующий уровень ишемизации сетчатки.

Высокий уровень значимости F-критерия Фишера позволяет сделать вывод об адекватности построенной модели реальному процессу.

Результаты проведенного исследования показывают, что ОВС сопровождается иммуновоспалительными процессами с повышенной экспрессией не только ВЭФР, но и других про- и противовоспалительных цитокинов и хемокинов. Выраженность цитокиновых реакций коррелирует с глубиной ишемического повреждения сетчатки. Интравитреальное введение ранибизумаба сопровождается снижением уровня ВЭФР и других цитокинов и/или хемокинов во внутриглазной жидкости. Определение степени ишемии сетчатки до начала лечения позволяет прогнозировать эффективность анти-ВЭФР-терапии и определить необходимость и/или тактику дополнительных лечебных мероприятий.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.Щ., Т.Ю., И.З., Е.Ч.

Сбор и обработка материала: И.З.

Протеомный анализ: А.О.

Статистическая обработка: И.З.

Написание текста: И.З., Т.Ю.

Редактирование: А.Щ., Т.Ю., А.О.