Болезнь Штаргардта (БШ) — наиболее часто встречающееся наследственное заболевание сетчатки, в основе которого лежит дефект одного или нескольких генов.
В подавляющем большинстве случаев причиной БШ являются мутации в гене ABCA4 (MIM: 601691), что делает его одним из важнейших локусов этого заболевания. В настоящее время в этом гене описано более 800 мутаций, среди которых были выделены 5 наиболее частых — p. G863A, p. L541P, p. A1038V, p. G1961E, p. P1380L [1—3]. Однако генетически подтвердить диагноз БШ при полном секвенировании гена ABCA4 удается не во всех случаях. Выявляемость двух патогенных мутаций в этом гене варьирует от 40 до 65% [4—9].
В более редких случаях БШ связана с мутациями в генах ELOVL4 (MIM: 605512), PROM1 (MIM: 604365) и CNGB3 (MIM: 605080). Мутации в генах ELOVL4 и PROM1 описаны при аутосомно-доминантном типе наследования БШ, в генах ABCA4 и CNGB3 — при аутосомно-рецессивном.
Цель работы — сравнить эффективность скрининга генетических вариантов в выборке пациентов с БШ с использованием экспресс-панели для диагностики 5 наиболее частых мутаций в гене ABCA4 и высокопроизводительного параллельного секвенирования всех кодирующих участков генов ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3 с помощью разработанной системы молекулярно-генетической диагностики БШ.
Материал и методы
В исследование включены 54 пациента с БШ I—III типа согласно классификации K. Noble и R. Carr (1979) [10]. Клинический диагноз БШ был верифицирован на основании стандартных (визометрия, офтальмоскопия, исследование цветового зрения) и специальных (кинетическая и статическая компьютерная периметрия, спектральная оптическая когерентная томография сетчатки, флюоресцентная ангиография глазного дна, аутофлюоресценция, электрофизиологические исследования) офтальмологических методов исследования. Клиническая картина и результаты обследования пациентов подробно описаны в статье Н.Л. Шеремет и соавт. [11].
Генетическое исследование проведено на материале ДНК лимфоцитов периферической крови пациентов.
Скрининг 5 наиболее частых мутаций p. G863A, p. L541P, p. A1038V, p. G1961E, p. P1380L в гене ABCA4 проводили с помощью MLPA-анализа, в основе которого лежит мультиплексная пробозависимая лигазная реакция с последующей амплификацией (Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA).
Лигирование проводили в 5 мкл реакционной смеси, содержащей 1х реакционный буфер (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,1% Igepal, 0,01 mM rATP, 1 mM DTT), специфичные пробы (по 3 на каждую мутацию), 0,04 единицы активности термофильной ДНК-лигазы, 0,1—1 мкг геномной ДНК, 20—30 мкл минерального масла.
Лигирование проводили в следующем режиме: первоначальная денатурация при 95 °C — 5 мин, затем лигирование при 66 °C — 2 ч.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) выполняли с помощью праймеров в следующем режиме: первоначальная денатурация при 95 °C — 5 мин, затем 25 циклов смены температур: 94 °C — 2 с, температура отжига праймеров 66 °C — 2 с, элонгация цепи 72 °C — 2 с; заключительная элонгация 72 °C — 7 мин. Для проведения ПЦР использовали режим точной регуляции.
Для анализа и выявления мутаций амплифицированные фрагменты разгоняли в 9% полиакрил-амидном геле. Электрофорез полиакриламидного геля длиной 20 см, толщиной 1 мм осуществляли при комнатной температуре, напряженности 5 В/см с использованием в качестве электрофорезного буфера 1хТВЕ в течении 2 ч. После электрофореза гель окрашивали в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл в 1хТВЕ) и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете при длине волны 312 нм.
Для секвенирования ДНК методом Сэнгера амплифицировали фрагменты ДНК исследуемых генов в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1х реакционный буфер (67 мМ Tris-HCl, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Twin-20), 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1,5 единицы термофильной ДНК-полимеразы, 20—30 мкл минерального масла. Реакцию осуществляли в следующем режиме: первоначальная денатурация при 95 °C — 5 мин, затем 34 цикла смены температур: 94 °C — 45 с, температура отжига праймеров — 45 с, элонгация цепи 72 °C — 45 с; заключительная элонгация 72 °C — 7 мин. Для проведения ПЦР использовали режим точной регуляции.
Нуклеотидную последовательность определяли методом прямого автоматического секвенирования с помощью прибора фирмы «Applied Biosystems» (США) согласно протоколу фирмы-производителя.
Высокопроизводительное параллельное секвенирование кодирующих (экзонных) последовательностей и прилежащих участков интронов генов ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3 проводили с использованием прибора Ion Torrent PGM (Life Technologies, США). Для обогащения образцов ДНК фрагментами целевых участков генома методом AmpliSeq разработали два пула праймеров (в общей сложности 294 пары), обеспечивающих полное покрытие экзонов ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3, 14 криптических сайтов сплайсинга ABCA4 и 99% покрытие прилежащих интронных последовательностей протяженностью не менее 100 п.н. В состав разработанной панели включили 33 пары праймеров для секвенирования известных на сегодняшний день минорных экзонов ABCA4. При расчете границ сайтов сплайсинга минорных экзонов использовали схему сайта сплайсинга, опубликованную Braun и соавт. [12], в соответствии с которой акцепторный сайт сплайсинга располагается в границах от (–)2 до (+)13 нуклеотидов от начала экзона, а донорный сайт сплайсинга — от (–)5 до (+)2 нуклеотидов от конца экзона.
Результаты секвенирования анализировали с использованием программного обеспечения Torrent Suite в составе: Base Caller (первичный анализ результатов секвенирования), Torrent Mapping Alignment Program — TMAP (выравнивание последовательностей относительно референсного генома NCBI build 37 — hg19), Variant Caller (выявление вариаций нуклеотидных последовательностей). Аннотацию функционального значения генетических вариаций и фильтрацию известных полиморфизмов проводили с помощью компьютерной программы ANNOVAR. Визуальный анализ данных, ручную фильтрацию артефактов секвенирования и выравнивание последовательностей осуществляли с применением программы Integrative Genomic Viewer — IGV. Достоверность выявления мутаций валидирована секвенированием ДНК по Сэнгеру.
Результаты и обсуждение
Скрининг 5 наиболее частых мутаций в гене ABCA4 позволил выявить, по крайней мере, одну мутацию у 27 (50%) из 54 обследованных пациентов (табл. 1). При этом гаплотип [p.L541P; p. A1038V], обнаруженный у 15 больных, принимали за единую мутацию (в зарубежной литературе часто обозначают термином «комплексная мутация»).
БШ, обусловленная мутациями в гене ABCA4, наследуется по аутосомно-рецессивному типу, по-этому для молекулярно-генетического подтверждения клинического диагноза БШ необходимо обнаружение у пациента, по крайней мере, двух патогенных мутаций в этом гене. При скрининге 5 наиболее частых мутаций в гене ABCA4 2 мутации были выявлены у 7 (13%) из 54 больных.
Из 5 мутаций в гене ABCA4, ранее признанных как наиболее частые, действительно распространенными в выборке российских больных с БШ являются 3 — p. L541P, p. A1038V и p. G1961E, причем [p.L541P; p. A1038V] у 56% пациентов с выявленными мутациями составляют гаплотип, т. е. представляют собой единую, комплексную, мутацию.
Низкая эффективность полного молекулярно-генетического подтверждения диагноза БШ по результатам скрининга 5 наиболее частых мутаций в гене ABCA4 может быть объяснена тремя причинами: ошибками клинической диагностики, наличием у больных минорных мутаций в гене ABCA4, не вошедших в панель частых мутаций, и высокой представленностью в исследованной выборке больных мутаций в других генах, ассоциированных с Б.Ш. Для уточнения вклада каждой из перечисленных причин и для совершенствования молекулярно-генетической диагностики БШ в Российской Федерации мы обследовали случайную подвыборку пациентов (25 из 54) методом высокопроизводительного параллельного секвенирования с помощью разработанной системы молекулярно-генетической диагностики БШ.
Набор генов для включения в панель для скрининга мутаций при БШ был определен по результатам анализа профильной научной литературы. В панель включены гены ABCA4 и CNGB3, мутации в которых обусловливают аутосомно-рецессивные случаи БШ, и гены ELOVL4 и PROM1, повреждения которых ассоциированы с аутосомно-доминантной формой заболевания. Дизайн системы праймеров для геномного секвенирования обеспечивает полное покрытие всех кодирующих областей выбранных для исследования генов, а также некодирующих участков концевых экзонов и участков генов, мутации в которых могут приводить к нарушениям сплайсинга РНК. Генетическая панель для диагностики БШ была разработана с учетом недостатков предыдущих вариантов Next-Generation Sequencing (NGS)-панелей: неполное покрытие кодирующих областей, слабое покрытие прилежащих интронных областей, погрешности дизайна праймеров, избыточный состав секвенируемых последовательностей (генов).
По результатам секвенирования с помощью разработанной NGS-системы молекулярно-генетической диагностики БШ, по крайней мере, одна мутация в одном из 4 генов была обнаружена у 23 (91,7%) из 25 больных. Полное молекулярно-генетическое подтверждение клинического диагноза БШ (выявлено 2 мутации) получено у 21 (84%) из 25 пациентов. Один патогенный аллель гена ABCA4 в гетерозиготном состоянии выявлен у 2 больных. Подавляющее большинство мутаций пришлось на ген ABCA4 (83% от всех пациентов с выявленными мутациями), мутации в гене проминина выявлены у 3 человек (PROM1:exon10: c.1117C>T:p.R373C; c. 1114C>T:p.Q372X), у 1 пациента обнаружено 2 мутации в гене CNGB3 (exon10:c.1148delC:p.T383fs; exon6: c.819_826del:p.P273fs). Выявленные мутации представлены в табл. 2.
Структура типов 23 выявленных мутаций была следующей: 13 миссенс-мутаций (56,5%), 4 нонсенс-мутации (17,4%), 4 мутации сайта сплайсинга, локализованные в прилежащих интронных областях генов на стыке экзона и интрона (17,4%), 2 делеции (8,7%).
Найденные мутации гена ABCA4 равномерно распределены по всему гену, тем не менее встречаемость мутаций в экзонах 12, 21 и 42 повышена за счет частых в исследованной группе больных мутаций — p. L541P, p. A1038V и p. G1961E соответственно (см. рисунок). Однако только у 3 пациентов вышеперечисленные частые мутации были обнаружены в двух аллелях, что позволило генетически верифицировать БШ. В остальных случаях (76% от всех обследованных пациентов) обнаружение именно редких мутаций, встречающихся в данном исследовании в единичных случаях, дало возможность полного молекулярно-генетического подтверждения клинического диагноза. Мутация p. L541P может встречаться не только в составе комплексной мутации [p.L541P; p. A1038V], но и самостоятельно, что было обнаружено у одного пациента в данной работе. Следует отметить, что в составе гаплотипа [p.L541P; p. A1038V] обе мутации являются патогенными [13].
У 4 человек были выявлены мутации, локализованные в сайте сплайсинга (в прилежащих интронных областях генов, на стыке экзона и интрона): c.768−1G>T, c.4540−1G>A, c.4634+1G>-, c.5714+5C>T (референсный транскрипт NM_000350). В исследованной выборке больных с БШ нами не выявлено ни одной из ранее описанных патогенных интронных мутаций [12, 14].
Многие авторы отмечают, что некоторые мутантные аллели, такие как p. G863A, p. A1038V и p. G1961E, являются более распространенными, по-видимому, в результате эффекта основателя, и частота встречаемости этих аллелей в различных популяциях может меняться. В РФ М.Ф. Шурыгиной и соавт. (2013) было проведено исследование по поиску 5 частых мутаций в гене АВСА4 (р.G863A, р. L541P, р. A1038V, р. G1961E, р. L1940P) у 14 пациентов с БШ и 26 пациентов с абиотрофией Франческетти, в результате которого у 22 (55%) человек были найдены р. L541P, р. A1038V, р. G1961E, у 1 пациента — р. G863A [15]. Однако 2 мутации для полного подтверждения диагноза БШ были обнаружены только у 12,5% пациентов, что согласуется с результатами нашей работы.
Молекулярно-генетическое исследование гена PROM1 выявило мутации в 2 семьях (3 пациента). По данным литературы, мутации гена PROM1 могут быть причиной таких наследственных заболеваний сетчатки, как палочко-колбочковая дистрофия, пигментный ретинит, БШ, причем одна и та же мутация может быть ассоциирована с любым из вышеперечисленных заболеваний [16].
Молекулярно-генетическое исследование гена CNGB3 выявило 2 мутации у 1 пациента: 1) CNGB3: NM_019098: exon10: c.1148delC: p. T383fs (делеция одного нуклеотида со сдвигом рамки считывания, гетерозигота); 2) CNGB3: NM_019098:exon6:c.819_826del: p. P273fs (делеция восьми нуклеотидов со сдвигом рамки считывания, гетерозигота). Заболевание наследуется по аутосомно-рецессивному типу, у родственников пациента клинических проявлений БШ выявлено не было.
На сегодняшний день описано около 30 мутаций гена CNGB3, которые в подавляющем большинстве случаев ассоциированы с ахроматопсией, а также с ювенильной макулярной дегенерацией и БШ [17, 18]. Выявленные у пробанда мутации описаны при ахроматопсии [19].
Учитывая разноречивые клинико-генетические показатели пациента и возникшие в связи с этим сложности постановки диагноза, приводим краткие данные клинического случая. У пациентки Г. 24 лет с вышеописанными мутациями гена CNGB3 заболевание сетчатки дебютировало в раннем детском возрасте, сопровождаясь светобоязнью, снижением остроты зрения и выраженной дисхроматопсией, т. е. характеризовалось признаками, которые могут наблюдаться при многих вариантах наследственной дистрофии сетчатки. Родители и брат пациентки обследованы окулистом, здоровы. При обследовании больной в возрасте 24 лет офтальмоскопические изменения соответствовали БШ 1-го типа, нистагм отсутствовал, ОКТ-картина сочетала клинические признаки, характерные для БШ, ахроматопсии или другой колбочковой абиотрофии. Помимо резко сниженной фотопической (колбочковой) электроретинограммы (ЭРГ), отмечено также выраженное изменение амплитуды и латентности скотопической ЭРГ, что свидетельствует о значительной палочковой дисфункции с обеих сторон и не характерно для ахроматопсии. Несомненно, дальнейшее наблюдение за развитием клинической картины дистрофии сетчатки пациентки позволит более точно определить клиническую форму заболевания.
Таким образом, генетическое тестирование и определение молекулярной природы такой гетерогенной группы заболеваний, как наследственные дистрофии сетчатки, в некоторых случаях обеспечивают более конкретную характеристику заболевания, чем клиническое фенотипирование. Приведенный пример демонстрирует трудности постановки точного диагноза в случаях со стертой клинической картиной, а также преимущества созданной диагностической панели, включающей гены, ассоциированные с БШ и некоторыми другими дистрофиями, в частности ахроматопсией.
Выявляемость мутаций, как отмечают многие авторы, зависит от различных факторов, наиболее важными из которых являются корректность клинического диагноза, этнический состав когорт, технические возможности методов молекулярно-генетического анализа. Большинство случаев БШ с невыявленными мутациями гена ABCA4, как отмечают некоторые авторы, вероятно, представляют собой фенокопии [20], т. е. у этих пациентов мутации в других генах вызывают штаргардтоподобный фенотип. С другой стороны, мутации могут представлять собой изменения числа копий гена или его участков (делеции или вставки одного экзона или более), которые нельзя обнаружить с помощью секвенирования, синонимичных вариантов в кодирующей области, интерпретация значимости которых затруднена, глубоких интронных мутаций, которые могут влиять на сплайсинг, или повреждения регуляторных областей, таких как промотор или энхансер [12].
В данном исследовании эффективность генетической верификации БШ (выявление двух патогенных аллелей) с помощью разработанной системы молекулярно-генетической диагностики составила 84%, что превышает показатели аналогичных исследований.
Выводы
1. Секвенирование всех экзонных и прилежащих интронных участков генов ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3 позволило добиться полного молекулярно-генетического подтверждения клинического диагноза БШ у 84% пациентов, что одновременно свидетельствует о высоком уровне современной клинической диагностики БШ и об эффективности примененного подхода к молекулярно-генетической диагностике.
2. Подтвержденная нами высокая частота мутаций p. L541P, p. A1038V и p. G1961E в гене ABCA4 у проживающих в РФ больных и низкая представленность мутаций p. G863A и p. P1380L, ранее включенных в панель 5 наиболее частых мутаций в гене ABCA4, ставит вопрос о необходимости модификации экспресс-теста на носительство распространенных мутаций ABCA4 у российских пациентов.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Н.Ш., А.П., В.С.
Сбор и обработка материала: Н.Ш., Н.Ж., И.Г., С.К., А.Ч., А.Л., П.Щ., А.Т., В.С.
Статистическая обработка данных: Н.Ш., Н.Ж.
Написание текста: Н.Ш., Н.Ж., И.Р., С.К., А.П., В.С.
Редактирование: Н.Ш., Н.Ж., И.Г., С.К., А.Ч., А.Л., П.Щ., А.Т., А.П., В.С.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.