Метод кросслинкинга (КРЛ) роговичного коллагена основан на возбуждении фотосенсибилизатора (рибофлавина) под воздействием ультрафиолетовых лучей спектра, А (УФА), образовании активных форм кислорода и сшиванию волокон коллагена.

В результате проведения кросслинкинга (КРЛ) повышается биомеханическая прочность роговицы [1]. Результаты экспериментов in vitro свидетельствуют о том, что в ходе КРЛ происходит изменение свойств ткани, приводящее к увеличению температуры денатурации коллагена при гидротермальной обработке [2], а также повышению устойчивости к различным ферментам, ответственным за разрушение коллагена [3].

Все перечисленные эффекты КРЛ на ткань роговицы (увеличение биомеханической прочности, повышение устойчивости к термовоздействию и ферментам) обеспечивают лечебный эффект КРЛ при воспалительных заболеваниях роговицы.

Помимо этого, по мнению ряда авторов, КРЛ воздействует непосредственно на бактериальные ферменты, замедляя их действие и частично дезактивируя [4, 5]. Так, Е. Spoerl и соавт. [3] в исследовании на свиных глазах показали, что после КРЛ устойчивость роговицы к пищеварительной коллагеназе и пепсину повысилась вдвое.

Однако наиболее важным является антимикробный эффект КРЛ, который возникает за счет взаимодействия УФА с рибофлавином[4]. Первоначально антимикробное действие фотосенсибилизации с использованием рибофлавина для устранения патогенов нашло применение в области трансфузиологии. Технология подавления патогенов (PRT), используемая в системе Mirasol PRT («Terumo BCT», Лейквуд, Колорадо) и разработанная для снижения риска передачи инфекции при проведении трансфузии, также основана на возбуждении молекул рибофлавина [6]. Данный метод эффективно уничтожает широкий спектр микроорганизмов. Механизм действия представлен непосредственным влиянием УФА на генетический материал микробов, неспецифическим повреждением в результате окислительного стресса и более специфическим эффектом, основанным на интеркаляции рибофлавина, приводящей к окислению гуанина ДНК/РНК микробов [7].

Другим потенциальным преимуществом КРЛ является его токсическое действие на воспалительные клетки, которое может ограничивать воспалительный ответ на инфекцию, повреждение сопутствующих тканей и последующее рубцевание [8].

Ряд авторов приводят данные о том, что КРЛ снижает проницаемость роговицы. Так, в эксперименте на свиных роговицах M. Tschopp и соавторы сразу после проведения КРЛ обнаружили статистически значимое снижение проницаемости роговицы для глазных капель «Офлоксацин» и «Вориконазол» на 28 и 15,59% соответственно [9].

M. Stewart и соавт. в экспериментальной работе на 9 кроликах обнаружили статистически значимое снижение проницаемости роговицы через 2 нед и 1 мес после КРЛ. Те же авторы сообщают, что проницаемость роговицы кроликов сохраняется сниженной и через 1 год после КРЛ [10].

При исследовании проницаемости роговицы для капель пилокарпина спустя 4 мес после КРЛ у людей снижения проницаемости не наблюдалось [11]. Авторы предположили, что сроки измерения проницаемости после КРЛ играют важную роль — апоптоз кератоцитов, индуцированный КРЛ, снижает проникновение местных лекарственных средств в строму на ранней стадии после процедуры. Проникновение препарата в роговичную строму после КРЛ также во многом зависит от молекулярной массы лекарственного вещества. Например, масса молекулы пилокарпина мала и составляет 208 г/моль, а моксифлоксацина — 438 г/моль, что может снижать проходимость антибиотика в роговицу после проведения процедуры. Эту информацию следует учитывать при дозировании глазных капель на глазах с инфекционными кератитами, пролеченных методом КРЛ [10].

Антибактериальный эффект взаимодействия УФА и рибофлавина был доказан двумя независимыми друг от друга группами исследователей на бактериях, выращенных на агаровой среде в чашках Петри [12, 13]. В ходе исследований ряд бактериальных штаммов, относящихся к обычным возбудителям микробного кератита, был уничтожен при облучении рибофлавина ультрафиолетом.

Для более глубокой оценки бактерицидных свойств процесса фотоактивации рибофлавина была разработана экспериментальная модель in vitro с конкретной целью определить степень влияния количества рибофлавина на бактерицидный эффект [2]. После выбора бактерий их помещали в раствор и изготавливали суспензию, к которой добавляли нарастающие концентрации рибофлавина. На каждом этапе суспензия подвергалась воздействию УФА. В случае со всеми тремя бактериальными штаммами наблюдалась четкая закономерность. Само по себе облучение УФА с длиной волны 365 нм в дозе, используемой при КРЛ, было недостаточным для устранения значимого количества патогенов, в то время как применение комбинации УФА и рибофлавина привело к снижению числа микроорганизмов. Наблюдалась четкая зависимость результата от дозы УФА. Таким образом, можно сделать заключение, что именно возбуждение рибофлавина и последующий окислительный стресс опосредуют антибактериальный эффект. Для гибели патогенов необходима крайне малая концентрация витамина. Концентрация выше 0,01% не усиливает антимикробный эффект, а ослабляет его.

S. Martins в своем исследовании in vitro продемонстрировал противоинфекционное действие КРЛ на метициллин-резистентный S. Aureus, мультирезистентную P. Aeruginosa, резистентный Streptococcus pneumonia, но отсутствие действия на такие грибы, как Candida Albicans [12]. В отличие от результатов S. Martins, A. Sauer показал, что возбуждение витамина В₂ способно потенцировать противогрибковое действие амфотерицина Б, что было доказано при облучении культур на агаровых средах [14]. In vivo после фотохимической терапии УФА и рибофлавином у кроликов с экспериментальным фузариозным кератитом отмечалось снижение показателей выраженности кератита, уменьшение количества гиф и клеток воспаления [15].

При исследовании воздействия фотооксидации на акантамебы in vitro, как и in vivo, в экспериментах на хомяках исследователям не удалось подтвердить их гибель. Однако в ходе эксперимента на акантамебах in vitro было зарегистрировано замедление роста Acanthamoeba castellanii под воздействием исключительно УФА [16,17]. Это может отчасти объяснить клинический эффект, о котором сообщается в некоторых работах, у пациентов с клиническими признаками акантамебного кератита, регрессировавшего после проведения КРЛ.

После первых сообщений об антибактериальном эффекте УФА и рибофлавина in vitro групп под руководством соответственно S. Martins и соавт. (2008) [12] и A. Schrier и соавт. (2009) [13] стали появляться работы о применении метода КРЛ в лечении бактериальных кератитов у людей, включая бактериальные кератиты с изъязвлением, грибковые кератиты, акантамебные кератиты и расплавление роговицы [18—20].

Большинство этих сообщений как тогда, так и в настоящее время — описание единичных клинических случаев.

Тем не менее H. Iseli и соавторы сообщили о благоприятном исходе у 5 пациентов с различными инфекционными заболеваниями (грибковыми и бактериальными кератитами) в пределах 200 мкм глубины стромы [21], Y. Khan и соавторы привели данные об излечении 3 пациентов с резистентными к терапии акантамебными инфекциями [22]. В работе N. Ehlers и соавторов у пациентов с незаживающими язвами роговицы различного генеза положительный результат наблюдался гораздо реже (в 6 из 14 случаев) [23].

C. Ammermann и соавт. [24] приводят данные ретроспективного анализа 11 случаев резистентного к терапии микробного кератита с изъязвлением. Всем 11 пациентам провели КРЛ как последнюю попытку для того, чтобы избежать проведения срочной сквозной кератопластики (СКП). Этиология кератита была различной: у 1 пациента — грибковая, у 4 — бактериальная, у 6 — возбудителя определить не удалось. У 6 (55%) пациентов проведения СКП удалось избежать при сроке наблюдения 134±82 дня.

K. Makdoumi и соавт. [25] описывают 7 клинических случаев бактериального кератита с расплавлением и отмечают, что заметное улучшение после КРЛ наступило уже в первые сутки после процедуры. Остановка расплавления, уменьшение болевого симптома произошло у большинства (6 человек) больных, в 2 случаях было отмечено исчезновение гипопиона.

В.В. Нероев и соавторы представили результаты трансэпителиального кросслинкинга у 10 больных с бактериальными и трофическими язвами роговицы. У всех пациентов на 7-е сутки наблюдалась положительная динамика в виде сокращения площади и глубины дефекта роговицы; в срок наблюдения 3 мес глубина дефекта сокращалась более чем на 30% от исходной глубины, к 6-му месяцу наступала полная эпителизация [26].

Различия в скорости наступления излечения после процедуры КРЛ могут объясняться как микробиологическими особенностями возбудителя, так и степенью прогрессирования патологического процесса — глубиной язвенного дефекта, степенью кератомаляции, длительностью заболевания, а также действием других методов лечения, применявшихся до КРЛ. По данным E. Spoerl, глубина действия КРЛ ограничивается 300 мкм [27].

L. Escariаo и соавторы обнаружили, что КРЛ был эффективен при лечении 7 пациентов с бактериальным кератитом, тогда как у 4 пациентов с грибковым кератитом эффекта не наблюдалось [28]. В отличие от последних Z. Li и соавторы, применив КРЛ у 8 пациентов с резистентным к противогрибковой терапии кератомикозом, отметили полное купирование кератита и заживление язвы роговицы в течение 3—8 дней и повышение остроты зрения у 6 пациентов. Ни в одном случае проведения кератопластики не потребовалось [29].

При лечении акантамебного кератита методом КРЛ L. Müller и соавторы. не обнаружили эффекта [30]. Противоположное мнение высказывают Г.М. Бикбова и соавт., G. Demirci и соавт. [31,32]: применение КРЛ при акантамебном кератите позволило купировать воспалительный процесс, отсрочить операцию СКП и провести ее в плановом порядке.

Следует отметить, что все перечисленные авторы [21—26] использовали КРЛ именно как дополнительный метод, в то время как основным и изначальным методом являлось противоинфекционное лечение (антибиотики, противогрибковые или антисептические средства в зависимости от вида патогена), применяемое местно и системно.

Группа проф. K. Makdoumi провела «чистый» эксперимент, чтобы определить истинный клинический эффект КРЛ при бактериальном кератите. Для этого было начато пилотное исследование [33], в ходе которого у пациентов с язвами и клиническим диагнозом «бактериальный кератит» в качестве первичной терапии использовался КРЛ. Антибиотики применялись только в случае неэффективности КРЛ. В исследование было включено 16 пациентов. У 13 из них удалось подтвердить диагноз микробиологически, у 3 — возбудитель определен не был. Антибиотики пришлось назначить только 2 пациентам. Одному пациенту была проведена трансплантация амниотической мембраны из-за задержки эпителизации.

Несмотря на то что у всех пациентов имелся неосложненный бактериальный кератит, который можно было бы легко вылечить инстилляциями фортифицированных растворов антибиотиков, результаты исследования показали, что КРЛ оказывает положительное влияние на исход кератита. Тем не менее авторы предупреждают, что КРЛ пока не стоит рассматривать как альтернативу антибиотикотерапии, а скорее как дополнительный метод лечения.

Большинство вышеперечисленных авторов использовали для проведения КРЛ при бактериальном кератите классический Дрезденский протокол кросслинкинга [21—26, 30—33].

В 2014 г. F. Hafezi и соавт. [34] оптимизировали методику КРЛ, применив так называемый фотоактивированный рибофлавин и аксереллированный кросслинкинг, при котором рибофлавин инстиллируют на деэпителизированную роговицу в течение процесса облучения. Фотоактивированный рибо-флавин при этом выступает в качестве дополнительного дезинфицирующего средства, снижая микробную нагрузку на поверхности и в передних слоях роговицы. Этот протокол проведения КРЛ был назван PACK-CXL. Вначале авторы применили метод на культурах Staphylococcus aureus и Pseudomonas аeruoginosa, облучив их с мощностью 18 мВт/cм². Уничтожения Staphylococcus aureus добились в 92,5±5,5% (при режиме 5 мин и мощности 18 мВт/см²) и 94,4±2,9% (при режиме 2,5 мин и мощности 36 мВт/cм²) случаев. Для Pseudomonas аeruoginosa соответственно 93,2±8,3% (при режиме 5 мин и 18 мВт/см²) и 92,9±5,0% (при режиме 2,5 мин и 36 мВт/cм²) наблюдений.

В настоящее время протокол PACK-CXL считается наиболее эффективным в лечении бактериальных, грибковых и акантамебных поражений роговицы. D. Tabibian и соавторы предложили использовать PACK- CXL как метод лечения первого выбора и единственную терапию в лечении ранних проявлений грибкового кератита [35].

КРЛ не оказывает токсического эффекта на эндотелий при толщине роговицы 400 мкн и более. При толщине менее 400 мкн при ГЯР E. Spoerl, J. Alio и др. [5, 36, 37] рекомендуют использовать гипотонический раствор рибофлавина или мягкую контактную линзу без УФ-фильтра.

Рассматривая влияние КРЛ на хрусталик, следует отметить, что в экспериментах на животных КРЛ не индуцировал развитие катаракты, поскольку доза УФ-излучения при КРЛ (5,4 Дж/см²) примерно в 13 раз ниже, чем самая низкая доза, способная вызвать помутнение хрусталика (70 Дж/см²). Кроме того, при КРЛ обычно используется УФ-излучение спектра А, тогда как развитие катаракты индуцируется УФ-излучением спектра Б с длиной волны 290—320 нм [27].

Несмотря на очевидные успехи метода КРЛ в лечении тяжелых бактериальных кератитов, имеются сообщения об осложнениях после КРЛ у пациентов с язвами роговицы. К этим осложнениям относятся расплавление роговицы, перфорация роговицы, реактивация герпесвирусной инфекции, диффузный ламеллярный кератит [38—43]. Хотя КРЛ до сих пор считается безопасной процедурой, эти случаи являются доказательством того, что ответ на окислительный стресс может быть разным у различных пациентов.

Большинство авторов резонно считают, что при герпетическом кератите и герпетических язвах роговицы проведение КРЛ противопоказано — под воздействием УФ происходят реактивация вируса простого герпеса (ВПГ) и усугубление течения болезни [26, 43—45].

К другим недостаткам КРЛ относится ограниченное проникновение УФА в ткани. Как уже было сказано выше, наибольший эффект от оксидационной терапии достигается в поверхностных и средних слоях роговицы на глубине до 300 мкм [46]. Поэтому УФ-излучение может не достигать гнойных инфильтратов и язв, захватывающих глубокие слои роговицы. Помимо этого, в отличие от прозрачной стромы нормальной роговицы, в плотных, непрозрачных гнойных инфильтратах УФА-лучи могут затухать быстрее и не проникать в их толщу.

Тем не менее даже при глубоко расположенных гнойных инфильтратах воздействие на поверхностные слои может способствовать эрадикации патогенов и давать другие положительные эффекты (например, повышение устойчивости к действию ферментов).

После экстренной кератопластики выживаемость трансплантата гораздо ниже по сравнению с таковой при плановой кератопластике. По данным L. Xie и соавт., J. Hill и соавт., частота отторжения трансплантата после экстренной СКП на глазу с острым инфекционным кератитом составляет от 16,4 до 52% по сравнению с оптической КП — менее 10% [21, 47, 48]. В случаях тяжелых ГЯР КРЛ может снизить активность инфекционного процесса, позволить отсрочить экстренную операцию и провести пересадку роговицы в плановом порядке на менее воспаленном глазу, уменьшив количество послеоперационных осложнений.

На основании обзора данных литературы о применении КРЛ для лечения инфекционных поражений роговицы можно сделать вывод о том, что КРЛ обладает определенным лечебным потенциалом и может стать перспективным методом лечения инфекционных кератитов и ГЯР в случаях неэффективности традиционного медикаментозного лечения [49].

Лечебный эффект КРЛ реализуется за счет его антимикробного, антиферментного, противовоспалительного действий, а также за счет усиления прочностных свойств стромы и повышения устойчивости ткани роговицы к микробным ферментам.

Большинство авторов отмечают выраженный эффект КРЛ при лечении кератитов и язв бактериальной этиологии. Данные об эффективности КРЛ при лечении грибковых и акантамебных кератитов весьма противоречивы. Сведений о лечении кератитов и ГЯР смешанной этиологии методом КРЛ недостаточно.

При герпетическом кератите и герпетических язвах роговицы проведение КРЛ противопоказано в связи с высоким риском реактивации ВПГ и усугубления болезни.

В связи с постепенным затуханием УФА-лучей на глубине примерно 300 мкн эффект КРЛ более выражен при лечении ГЯР, расположенных в поверхностных и средних слоях стромы роговицы. В этой связи некоторые авторы (F. Hafezi, D. Tabibian) предлагают использовать КРЛ сразу после постановки диагноза гнойного кератита либо применять метод в ранних стадиях ГЯР, до того как инфекционный процесс захватит глубокие слои роговицы. В случаях развитых ГЯР КРЛ позволяет снизить активность инфекционного процесса, отсрочить экстренную кератопластику и провести операцию в плановом порядке, уменьшив количество послеоперационных осложнений.

Возможно ли усилить эффект КРЛ при глубоко расположенных инфильтратах и ГЯР? Это — вопрос, требующий дальнейшего изучения.

Данные литературы по фотохимическому взаимодействию УФА и рибофлавина при лечении инфекционного кератита и гнойного расплавления роговицы свидетельствуют о том, что введение метода в практику может привести к уменьшению количества осложнений, частоты проведения экстренной кератопластики и повышению числа благоприятных исходов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Ян Бяо — аспирант отдела патологии роговицы

e-mail: yangbiao19880930@qq.com