Токсическое воздействие различных лекарственных веществ на внутреннее ухо является распространенной причиной нарушения слуха. В настоящее время существует множество препаратов, применение которых может негативно повлиять на функционирование органа слуха [1, 2]. Цисплатин — препарат платины — одно из наиболее используемых и эффективных химиотерапевтических средств. Он нашел широкое применение в качестве химиопрепарата как в монотерапии, так и составе комбинированной терапии ряда онкологических заболеваний благодаря выраженному цитотоксическому действию [3]. Однако применение цисплатина часто осложняется тяжелыми побочными эффектами, такими как нефротоксичность, миелосупрессия, поражение органа слуха. По мере того, как остальные побочные эффекты препарата постепенно удается взять под контроль, проблема необратимой тугоухости после использования цисплатина остается нерешенной. Его применение вызывает в ряде случаев глубокую двустороннюю сенсоневральную потерю слуха преимущественно в высокочастотном диапазоне у 10—25% взрослых, получающих малые и средние дозы, 50% взрослых, получающих высокие дозы (> 400 мг/м²), и 41—61% детей [4—8]. У детей ототоксичность цисплатина является серьезной проблемой, поскольку даже умеренная потеря слуха может существенно влиять на развитие речи и когнитивных навыков. Кроме того, часто прогрессирование потери слуха продолжается после окончания терапии [6, 9].

Известно, что цисплатин вызывает поражение органа Корти [10]. При кратковременном приеме препарата повреждение затрагивает наружные волосковые клетки базального завитка улитки — их дегенерация вызывает нарушение слуха на высоких частотах. Если воздействие цисплатином продолжается, дегенерация распространяется на верхний завиток улитки. Это нарушает слух на разговорных частотах вплоть до полной глухоты [11, 12]. Точные механизмы, которые ответственны за поражение слухового анализатора при использовании цисплатина, до конца не ясны, но предполагается, что увеличение образования активных форм кислорода в митохондриях и последующий оксидативный стресс играют центральную роль в ототоксичности препарата [13]. Есть данные, что цисплатин приводит к активации внутриклеточных процессов апоптоза и снижению антиапоптотической защиты в клетках сосудистой полоски, спирального ганглия и кортиева органа [14].

Цисплатин — первый из препаратов комплексных соединений платины — состоит из центрального иона — двухвалентной платины, вокруг которого в цис-положении координируются лиганды — 2 атома хлора и 2 молекулы аммиака. При замещении анионов Cl^– молекулами воды создается высокореактивный комплекс, который вступает в реакцию с нуклеофилами в ДНК, РНК, белках и пептидах. Связывание платины с ДНК блокирует репликацию и транскрипцию ДНК, индуцирует остановку клеточного цикла и обусловливает цитотоксичность цисплатина в отношении пролиферирующих опухолевых клеток [15, 16]. Помимо опухолевых тканей, аддукты платина-ДНК также обнаруживаются в волосковых клетках улитки и пограничных клетках сосудистой полоски, чем, вероятно, и объясняется повреждающий эффект соединений платины во внутреннем ухе [17].

Вариабельность эффектов, влияющих на слух у пациентов, получающих одну и ту же дозу цисплатина, значительна. Довольно большое число пациентов переносят терапию цисплатином без каких-либо признаков нарушения слуха, тогда как у других ототоксичность развивается уже после первой дозы цисплатина [18]. Известно, что более высокая кумулятивная доза цисплатина [4, 19, 20], детский возраст [4, 19, 21], краниальное облучение [20, 22] и сопутствующее использование аминогликозидов и винкристина [19, 23, 24] являются факторами риска нарушения слуха при проведении химиотерапии цисплатином. Однако перечисленных клинических факторов недостаточно для оценки риска развития ототоксичности [25].

Такие межличностные различия стимулировали поиск отдельных генетических маркеров, ответственных за повышение риска цисплатин-индуцированной потери слуха [12, 18, 25, 26]. В статье, опубликованной в журнале «Nature Genetics» в 2009 г. [26], исследованы образцы ДНК 162 пациентов, получавших лечение на основе цисплатина в детских онкологических отделениях Канады. В результате терапии у 106 из 162 пациентов развилась потеря слуха. Целью исследования явился поиск генетических ассоциаций, связанных с риском развития ототоксичности. Генотипирование проводилось с помощью коммерческого набора Illumina GoldenGate, включающего около 2000 однонуклеотидных вариантов в 220 генах, кодирующих ферменты лекарственного метаболизма. В результате были идентифицированы варианты в генах TPMT (rs12201199, rs1142345, rs1800460) и COMT (rs4646316, rs9332377), которые оказались ассоциированы с риском развития потери слуха при терапии цисплатином. В дальнейшем исследование было продолжено для 155 новых пациентов, где ассоциация была подтверждена для полиморфных вариантов генов TPMT (rs12201199, аллель T, p=0,0013) и ABCC3 (rs1051640, аллель G, p=0,036). При совместном анализе ассоциация также была подтверждена для полиморфного варианта в гене COMT (rs4646316, аллель T) [27]. Однако следующие работы опровергли полученные результаты [28, 29].

Ген TPMT кодирует фермент S-тиопуринметилтрансферазу (thiopurine S-methyltransferase), которая катализирует S-метилирование ароматических и гетероциклических сульфгидрильных соединений, включая некоторые противоопухолевые средства: 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин и иммунодепрессант азатиоприн. С рецессивными мутациями в гене TPMT связана тяжелая гемопоэтическая токсичность, развивающаяся у пациентов при лечении стандартными дозами данных препаратов (OMIM:610460). Ген COMT кодирует фермент катехол-O-метилтрансферазу (сatechol-O-methyltransferase), участвующую в метаболизме катехоламинов. Мутации в гене COMT ассоциированы с риском развития психических расстройств, таких как шизофрения и панические атаки (OMIM: 181500, 167870). Ген ABCC3 кодирует белок ATP-связывающего кассетного транспортера (ATP-Binding cassette, subfamily C, member 3), экспрессирующегося в гепатоцитах и опосредующего перенос S-глутатиона. Экспрессия ABCC3 в клетках карциномы яичников придавала им устойчивость к противоопухолевым препаратам метотрексату, этопозиду и тенипозиду.

В настоящее время не существует стандартных методов идентификации лиц, которые подвержены риску развития цисплатин-индуцированной ототоксичности. Учитывая потенциальную актуальность TPMT, COMT и ABCC3 генотипирования для выявления пациентов с повышенным риском, мы повторили предыдущие исследования в независимой когорте российских пациентов.

Материалом для исследования явились образцы ДНК 50 пациентов, которые получили лечение в детских онкологических отделениях Санкт-Петербургской ГКБ № 31, Национального научно-практического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева и прошли курс химиотерапии на основе цисплатина. После проведенного лечения было проведено тестирование слуха. В результате выборка пациентов была разделена на две группы: 16 пациентов, у которых развилась потеря слуха после химиотерапии с использованием цисплатина, и контрольная группа из 34 пациентов, чей слух остался интактным. Для всех детей проводились регистрация отоакустической эмиссии на частоте продукта искажения (ОАЭПИ) в частотном диапазоне 1,5—10 кГц с интенсивностью стимуляции 65/55 дБ, импедансометрия. Тональная пороговая аудиометрия выполнялась для детей старше 2—3 лет, состояние которых на момент проверки слуха позволяло активно участвовать в обследовании. До начала курса химиотерапии всем пациентам было проведено базовое аудиологическое обследование, которое подтвердило нормальное состояние слуховой функции (ОАЭПИ присутствовала во всем исследуемом диапазоне частот; пороги слуха составили менее 15 дБ нПС).

У всех детей с сенсоневральной тугоухостью снижение слуха носило симметричный высокочастотный характер, т. е. аудиограмма имела характерный нисходящий тип. В данную группу вошли дети, у которых после проведенного лечения отмечалось повышение порогов слуха по типу звуковосприятия и исчезновение ОАЭПИ на отдельных частотах. У всех детей со сниженным слухом пороги слуха были в пределах нормы (менее 15 дБ нПС) на частотах 250—1000 Гц; у 25% детей снижение слуха отмечалось начиная с частоты 2 кГц; у 62,5% детей — с частоты 4 кГц; у 12,5% — с частоты 8 кГц. Средний порог слышимости на частотах 0,5—4 кГц составил 18 дБ; на частотах 2—8 кГц — 39 дБ. Пример типичной аудиограммы и регистрации ОАЭПИ приведен на рисунке.

В качестве популяционной выборки сравнения случайно выбраны 80 образцов геномной ДНК этнически русских неродственных людей с необследованным слухом из Банка лаборатории ДНК-диагностики ФГБНУ МГНЦ среди пар с невынашиванием беременности или первичным бесплодием.

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью готового набора реактивов для выделения DLAtom^тм DNA Prep100 по протоколу производителя (ООО «Изоген», Россия).

Типирование полиморфных вариантов rs12201199, rs4646316 и rs1051640 проводили с помощью мультиплексной пробозависимой лигазной реакции (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification — MLPA), которая рутинно используется для генотипирования однонуклеотидных замен в лаборатории ДНК-диагностики более 9 лет [30, 31].

Реакцию лигирования олигонуклеотидных проб с геномной ДНК и амплификацию лигированных ДНК-фрагментов проводили по стандартному протоколу, описанному ранее [31]. Лигирование проводили в течение 1—2 ч при 63 °C. Температура отжига праймеров составляла 63 °C (30 циклов).

Результаты MLPA-анализа оценивали с помощью вертикального электрофореза (20×20 см) в полиакриламидном геле. После разделения фрагментов гель окрашивали в растворе бромистого этидия (0,1 мкг/мл в 1хTBE) в течение 20 мин, промывали водой. Результаты исследования регистрировались на гель-документирующей системе GelDoc 2000.

Статистические расчеты проводили с помощью программы Statistica 6.0. Достоверность различий оценена с использованием точного критерия Фишера. Для показателей возраста, кумулятивной дозы цисплатина и длительности лечения использовали U-тест Манна—Уитни. Для сравнения частот аллелей с европейской популяцией — стандартный критерий χ². Различия считались достоверными при p<0,05.

Среди 50 пациентов экспериментальной выборки, прошедших курс химиотерапии на основе цисплатина, у 16 пациентов развилась потеря слуха. В группах с нарушением слуха и нормальным слухом экспериментальной выборки проведено сравнение следующих характеристик: возраста пациентов (от 1 мес до 17 лет), пола и типа опухоли, этнической принадлежности, кумулятивной дозы и длительности лечения цисплатином, краниоспинального облучения, сопутствующей терапии винкристином, амикацином и ванкомицином (табл. 1).

Был проведен анализ встречаемости полиморфизмов в генах TPMT (rs12201199), COMT (rs4646316) и ABCC3 (rs1051640) в выборках пациентов с развившейся потерей слуха и без потери слуха после проведения химиотерапии с использованием цисплатина, а также популяционной выборке. Результаты генотипирования представлены в табл. 2.

При сравнительном анализе частот аллелей и генотипов данных полиморфных вариантов статистически значимых различий между двумя группами пациентов не обнаружено. Аллельная частота минорного аллеля T в гене TPMT (rs12201199) составила 6% в выборке больных с потерей слуха и 3% в выборке больных без потери слуха. Аллельная частота минорного аллеля T в гене COMT (rs4646316) составила 19 и 15% в данных выборках соответственно. Аллельная частота минорного аллеля G в гене ABCC3 (rs1051640) составила 13 и 18% соответственно.

Мы провели анализ ассоциаций отдельно для этнически русских пациентов. Достоверных различий также не было выявлено. Аллельная частота аллеля T в гене TPMT (rs12201199) составила 0% в выборке больных с потерей слуха и 2% в выборке больных без потери слуха. Аллельная частота аллеля T в гене COMT (rs4646316) составила 7 и 14% в данных выборках соответственно. Аллельная частота аллеля G в гене ABCC3 (rs1051640) составила 14 и 17% в данных выборках соответственно.

Таким образом, при однофакторном анализе ни для одного из однонуклеотидных полиморфизмов в генах TPMT (rs12201199), COMT (rs4646316) и ABCC3 (rs1051640) ассоциация с риском развития ототоксичности не обнаружена.

Частота аллелей данных полиморфных локусов в экспериментальной выборке русских пациентов и популяционной выборке русских неродственных жителей РФ не отличается. При сравнении данной частоты в экспериментальной выборке русских пациентов с популяцией европейцев, данные о которой были взяты из ресурса Genome Aggregation Database (в котором объединены данные полноэкзомного и полногеномного секвенирования около 200 000 неродственных индивидуумов), статистических различий выявлено не было. Аллельная частота среди европейцев аллеля T в гене TPMT (rs12201199) составляет 5,97% (p=0,4057; 0,0601), аллеля T в гене COMT (rs4646316) — 23% (p=0,0841; 0,1981), аллеля G в гене ABCC3 (rs1051640) — 18% (p=0,5751; 0,6508).

В нашем исследовании мы изучили влияние полиморфизмов в генах TPMT (rs12201199), COMT (rs4646316) и ABCC3 (rs1051640) на развитие цисплатин-индуцированной потери слуха у детей, получавших противоопухолевую терапию.

При изучении фармакогенетических ассоциаций большое внимание уделяется негенетическим факторам, которые часто отличаются в разных исследованиях [24—27]. Мы сравнили клинические данные в группах больных с развившейся потерей слуха и без нее. Сопутствующая терапия винкристином и краниоспинальное облучение были несколько выше в выборке пациентов с потерей слуха, однако различия не были статистически значимыми. Статистически значимые различия наблюдались только в национальном составе исследуемых групп, в связи с чем все расчеты были проведены как для всей выборки, так и отдельно для этнически русских пациентов.

Мы наблюдали отсутствие связи полиморфных вариантов TPMT (rs12201199), COMT (rs4646316) и ABCC3 (rs1051640) с нарушением слуха как во всей выборке пациентов, так и выборке этнически русских пациентов.

В исследовании J. Yang и соавт. [28], в котором изучены образцы ДНК 213 детей из США с медуллобластомой, получавших лечение на основе цисплатина, ассоциаций данных полиморфных вариантов с риском развития ототоксичности также не было выявлено (p=0,50 для rs12201199; p=0,15 для rs4646316). Кроме того, в данной работе индуцированная цисплатином потеря слуха была оценена с помощью модели in vivo, в которой изучались мыши с разными генотипами гена TPMT. После четырех последовательных инъекций цисплатина потеря слуха была существенной, особенно глубокой на высоких частотах. Однако различий в повреждении слуха не наблюдалось у мышей с диким типом гена TPMT и мышей с нокаутом данного гена. Также в работе исследовалась взаимосвязь между генетическими вариантами в генах TPMT и COMT и уровнем цисплатина в цитоплазме лимфобластных клеток. Концентрация цисплатина, необходимая для достижения 50% гибели клеток, оказалась не связана ни с TPMT и COMT генотипами, ни ферментативной активностью S-тиопуринметилтрансферазы. Молекулярные механизмы, связывающие ген ABCC3 с повреждением слуха, также остаются неясными.

В совокупности эти результаты согласуются с нашими наблюдениями у пациентов и указывают на отсутствие прямой роли генов TPMT (rs12201199), COMT (rs4646316) и ABCC3 (rs1051640) в развитии ототоксичности при проведении химиотерапии с использованием цисплатина. Такая противоречивость между оригинальным исследованием и последующими независимыми работами может быть обусловлена множеством причин: критериями отбора пациентов, этническими различиями, размерами выборок, используемыми протоколами лечения и другими факторами. Стоит также упомянуть, что на основании выявленных ранее ассоциаций с изучаемым нами полиморфизмом в гене TPMT в 2011 г. в инструкцию к препарату цисплатин была добавлена информация о его ассоциации с риском развития ототоксичности [32]. Все это показывает важность повторения исследований в независимых выборках пациентов.

Генетическая основа ототоксического действия цисплатина, вероятно, является сложной, поскольку множество генов участвует в пути биотрансформации цисплатина и его детоксикации. До сих пор не описано ни одного варианта, который присутствовал бы исключительно у пациентов, у которых развилась ототоксичность при лечении цисплатином. Большинство из фармакогенетических исследований либо не были подтверждены независимыми исследованиями, либо показали противоречивые результаты [11].

На данный момент есть две работы, результаты которых были подтверждены независимыми исследованиями или функциональным анализом. В исследовании H. Xu и соавт. [33] проведен полногеномный поиск ассоциаций (GWAS, Genome-Wide Association Studies) для выявления рисков цисплатин-индуцированной ототоксичности. Анализ проводился для образцов ДНК 238 детей из США с диагностированными опухолями головного мозга и независимо для 68 детей с одинаковым протоколом лечения. В результате был идентифицирован полиморфный вариант в гене ACYP2 (rs1872328, минорный аллель А), который сильно предрасполагал этих пациентов к развитию потери слуха в каждой из выборок (p=3,9·10^–8). В дальнейшем группа из Голландии прицельно протестировала образцы ДНК 156 пациентов европейского происхождения с остеосаркомой на наличие данного полиморфного варианта в двух группах (с потерей слуха после лечения цисплатином и без нее) [34]. Значительная ассоциация между аллелем, А и цисплатин-индуцированной ототоксичностью также наблюдалась (p=0,027).

Канадская сеть по исследованиям в области фармакогеномики также провела полногеномный поиск ассоциаций (GWAS, Genome-Wide Association Studies) для выявления рисков потери слуха при лечении цисплатином [35]. Анализ образцов ДНК проводился независимо у 188 пациентов из Онтарио (США) и 92 пациентов из Колумбии. Все пациенты были мужчинами старше 17 лет, которым был поставлен диагноз рака яичка, получавшими терапию на основе цисплатина. В результате анализа 7907 SNP был идентифицирован полиморфный вариант в гене SLC16A5 (rs4788863, аллель T), который оказался связан с защитой от ототоксического действия цисплатина (p=2,17·10^–7). Кроме того, участие гена SLC16A5 в токсическом действии цисплатина было подтверждено с помощью функционального анализа in vitro.

Таким образом, наши результаты не подтвердили пригодность генотипирования SNP-полиморфизмов TPMT (rs12201199), COMT (rs4646316) и ABCC3 (rs1051640) для выявления пациентов с риском развития ототоксичности, индуцированной цисплатином. Полученные результаты подтверждают важность повторения результатов в фармакогенетических исследованиях ассоциаций. Для выяснения генетических особенностей, которые предрасполагают к развитию потери слуха, вызванной цисплатином, необходимы дополнительные исследования, в том числе полноэкзомные и полногеномные.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

¹е-mail: mironovich_333@mail.ru; https://orcid.org/0000-0003-0351-1271