Имеющиеся к настоящему времени научные данные свидетельствуют о принципиальной возможности комплексного применения физиотерапевтических факторов и клеточных технологий в регенеративной медицине и открывают перспективы для развития нового направления в современной биомедицине — регенеративной физиотерапии [1]. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) — мультипотентные стромальные клетки — содержатся почти во всех тканях человека, способны к дифференцировке в различные типы клеток [2, 3] и давно привлекают внимание исследователей и практических врачей с точки зрения их возможного использования для заместительной или восстановительной терапии заболеваний. Есть данные о возможности получения из МСК нейрональных предшественников с последующей дифференцировкой их в клетки нервной ткани (нейроны, астроциты, олигодендроциты) [4—7]. Известно также, что МСК секретируют почти все основные провоспалительные цитокины и ростовые факторы [3]. МСК человека сохраняют способность к пролиферации и дифференцировке при культивировании in vitro, а также при реимплантации, что обусловливает их высокую значимость в клинической практике [2].

Одним из известных способов неспецифического регулирования клеточной активности МСК на этапе предварительного культивирования in vitro является воздействие низкоинтенсивным лазерным излучением (НИЛИ), для чего использовали лазерные источники с разной длиной волны, работающие в основном в непрерывном режиме (табл. 1). Ранее нами было показано, что низкоинтенсивный импульсный лазерный свет также способен эффективно стимулировать пролиферацию МСК in vitro [8, 9].

Энергетическая плотность (ЭП) находится в достаточно узких пределах (см. табл. 1), характерных для эффектов, наблюдаемых в других типах клеток [10], но важнейшие параметры методики воздействия часто не указываются, что не позволяет обеспечить воспроизводимость результатов лазерного освечивания [11]. Также не теряет своей актуальности вопрос оптимизации параметров освечивания, выбор длины волны в сочетании с оптимальными энергетическими характеристиками воздействия (мощность, плотность мощности и экспозиция) [12, 13].

Из табл. 1 видно, насколько разнообразны получаемые в результате лазерного освечивания эффекты, но обращает на себя внимание тот факт, что все они кальцийзависимые. Поскольку первичным механизмом стимуляции клеточной активности НИЛИ является термодинамический запуск Ca2±зависимых процессов [41], то это позволяет предположить возможное влияние низкоинтенсивного лазерного света на изменение физиологии регулирования на клеточном уровне. Также известно, что при увеличении внутриклеточного кальция снижается вероятность гибели по механизму апоптоза и повышается выживаемость эмбриональных стволовых клеток in vitro [42], МСК in vivo [43].

В отношении возможного влияния некогерентного света на МСК данные противоречивые, наша же позиция в отношении некогерентных источников однозначна — бесполезны, необходимо использовать только лазерный монохроматический свет для эффективного воздействия, получения максимального отклика биологических систем разного уровня организации [10].

Необходимо также учитывать известный факт, что после одного воздействия наблюдается лишь кратковременное повышение пролиферации (630 нм, 15 мВт/см2, ЭП 4 Дж/см2), эффект усиливается после многократного освечивания и при низкой плотности клеток [44], т. е. необходимо проводить 3—5-кратное повторное освечивание с целью усиления воздействия.

В задачи исследования входило изучение влияния непрерывного низкоинтенсивного лазерного излучения красного (635 нм) и зеленого (525 нм) спектров на МСК человека in vitro (морфология, жизнеспособность, пролиферативная активность и скорость роста МСК in vitro). Основной задачей стала оценка предельных режимов воздействия непрерывным лазерным светом с данными параметрами.

Культура клеток

В эксперименте использовалась адгезивная культура МСК, 4 пассажа, полученных из ткани пуповины донора, давшего информированное согласие. Забор, транспортировка и обработка материала проводилась в течение 24 ч с момента родов. МСК получены методом эксплантов с последующим культивированием фрагментов. Культивирование проводили в течение 6 сут с использованием стандартных питательных сред: Minimum Essential Medium Eagle, Alpha Modification with NaHCO3 («Sigma-Aldrich», Германия), 2 mM L-глютамина («ПанЭко», Россия), 10% сыворотки плодов коровы (MSC FBS, «Gibco», Австралия). Культивирование проводилось на чашках Петри площадью 11,78 см² (EasyGrip, «Beckton Dickinson», США). Также использовались: раствор Дальбекко (DPBS, «Биолот», Россия), раствор трипсина-ЭДТА («ПанЭко», Россия), центрифужные пробирки объемом 50 мл (CentriStar, «Corning Incorporated», Мексика) и серологические пипетки объемом 25 и 10 мл (Falcon, «Beckton Dickinson», США).

Исследование проводилось в 4 опытных и 4 контрольных группах, при 3 чашках (повторениях) в каждой группе. Посев культуры проводили за 8—10 ч до эксперимента в количестве 9,1∙104 кл/см2 на чашки Петри поверхностью 11,8 см². Опытные 1-ю и 5-ю группы освечивали в режиме лазера № 1, 2-ю и 6-ю группы — в режиме № 2. При этом пассирование освеченных клеток в 1-й и 2-й группах проводилось на обедненной сывороткой среде (1% FBS), а клеток в 5-й и 6-й группах — на стандартной (10% FBS). Контрольные группы (3, 4, 7 и 8-я) не освечивались. Пассирование клеток в 3-й и 8-й группах (контроль 1-я и 4-я) проводилось также на обедненной сывороткой среде, а 4-й и 7-й групп (контроль 2-я и 6-я) — на стандартной (10% FBS). Автоматический подсчет общего количества клеток, живых клеток и жизнеспособности проводился в 1—4-й группах на 1, 3 и 4-е сутки. Морфологический анализ проводился в 5—8-й группах на 3-и сутки. Визуальное наблюдение за ростом культуры проводилось регулярно. Культивирование проводилось при 37 °C и 5% CO2.

Методы исследования

Световая и флюоресцентная микроскопия. Фотодокументирование проводили регулярно в каждой группе с помощью микроскопа Zeiss AxioObserver на программном обеспечении AxioVision V 4.6.3.0.

Фиксация и окраска культуры. Для определения морфологии клеток использовали флюоресцентные красители: WheatGermAgglutinin, AlexaFluor 647 Conjugate (exc/em ~650/668 nm) и DAPI (4›, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride), exc/em 358⁄461 nm («LifeTechnologies», США).

Перед окрашиванием клетки фиксировали на пластике с добавлением 4% формальдегида («Panreac», Испания), приготовленном на бифосфатном буфере (ПБС), фиксацию проводили в течение 30 мин при 4 °C. Отмывали дважды ПБС + 0,1% Triton X100 (ПБСТ).

Далее последовательно окрашивали культуру WGA-Alexa (5 мкг/мл) 10 мин при комнатной температуре. Несвязавшийся краситель отмывали дважды ПБСТ по 5 мин и окрашивали клетки DAPI (1 мкг/мл) 10 мин при комнатной температуре. Несвязавшийся краситель дважды отмывали ПБСТ по 5 мин. Клетки заливали ПБС. Фотодокументирование проводили в каждой группе с помощью микроскопа Zeiss AxioObserver на программном обеспечении AxioVision V 4.6.3.0. Все процедуры по окраске клеток проводили в темноте.

Подсчет общего количества клеток, оценка жизнеспособности проводились на автоматическом анализаторе концентрации и жизнеспособности клеток Vi-Cell XR («BeckmanCoulter», США). Обработка данных и построение графиков проводились с помощью программного обеспечения Excel (Microsoft Office 2007, «Microsoft», США). Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы SigmaPlot v. 11.0.

Параметры лазерного воздействия

Опытные группы клеток освечивались НИЛИ (параметры представлены в табл. 2), время экспозиции 5 мин на 1 чашку. Контрольные группы не подвергалась воздействию. Применяли аппарат лазерный терапевтический Лазмик-ВЛОК (Регистрационное удостоверение №РЗН 2014/1410 от 06.02.14), лазерные излучающие головки, работающие в непрерывном режиме с одним лазерным диодом. Фиксация лазерных излучающих головок, что необходимо для равномерной засветки всей чашки, обеспечивалась специальной насадкой (банкой) для лазерно-вакуумного массажа из комплекта КБ-5 диаметром 35 мм.

Чашки полностью находились в световом поле, что обеспечивало поглощение ≈90% всей падающей световой энергии. Исходя из этого рассчитывалась плотность мощности (ПМ) и ЭП для каждого варианта освечивания. Требование к равномерной засветке всей поверхности чашки связано с обеспечением лучшего эффекта, чем при точечном воздействии на часть культуры клеток [22, 45].

Подсчет общего количества клеток, живых клеток и определение жизнеспособности проводили в двух повторностях в 1—4-й группах. Результаты средних значений представлены в табл. 3.

При подсчете общего количества клеток в культуре было показано, что на 3-й день после освечивания (4-й день пассирования) в контроле, растущем на полной среде, плотность была более чем в 5 раз выше, чем в опытных вариантах и контроле, растущем на низкосывороточной среде. Показатели 4-го дня после освечивания (5-го дня пассирования) незначительно отличаются от показателей 3-го дня. Параллельно с определением плотности культуры определяли жизнеспособность клеток во всех вариантах.

Как видно из табл. 3, жизнеспособность клеток во всех вариантах варьирует в пределах 75—90% в разные дни и не коррелирует с особенностями состава среды. Однако стоит отметить, что в опытном образце, который подвергался освечиванию в режиме № 2, наблюдалась самая низкая жизнеспособность (статистически не достоверно).

Оценка морфологии клеток

1-я группа (режим НИЛИ № 1, красный лазер, 635 нм, 10% FBS, рис. 1). В данном варианте культура плотная, наблюдается наслаивание клеток (многослойная культура). Клетки веретеновидной формы, края не деформированы, ядра четкие, во многих просматриваются ядрышки. Клетки без морфологических особенностей.

2-я группа (режим НИЛИ № 2, зеленый лазер, 525 нм, 10% FBS, рис. 2). Визуально культура плотная, наблюдается наслаивание клеток (многослойная культура). Клетки веретеновидной формы, края не деформированы, ядра четкие, во многих просматриваются ядрышки. Клетки без морфологических особенностей.

3-я группа (контроль, 10% FBS, рис. 3). Визуально культура плотная, наблюдается наслаивание клеток (многослойная культура). Клетки веретеновидной формы, края не деформированы, ядра четкие, во многих просматриваются ядрышки. Клетки без морфологических особенностей.

4-я группа (контроль, 1% FBS, рис. 4). Визуально наблюдается 99% монослой. Клетки веретеновидной формы, края не деформированы, ядра четкие, во многих просматриваются ядрышки. Визуально клетки в культуре имеют большие размеры в сравнении с опытными образцами, что вполне сопоставимо с условиями роста на обедненной среде.

Тем не менее на данном фото видно, что клетки свободно распластаны на подложке, при этом морфология не изменена. Края ровные, ядра четкие, цитоплазма чистая.

Во всех вариантах морфология клеток является типичной для мезенхимально-стромальной культуры, клетки веретеновидные фибробластоподобные, распластанные по подложке. Ядра четкие, по большей части находящиеся в интерфазе деления, структура не изменена, хорошо просматриваются ядрышки.

Культуры, представленные на снимках, образуют плотный монослой с количеством здоровых жизнеспособных клеток 99,9%, исключение составляет лишь 4-я группа (контроль на 1% FBS), выращенный на среде с обедненным содержанием сыворотки), где уровень конфлюэнта достигал лишь 70%, что объяснимо низким содержанием в ростовой среде необходимых компонентов.

В 1-й и 2-й группах (клетки, освеченные НИЛИ) никаких различий между собой и контролем также не наблюдается. Единственный отличный от нормы вариант в 4-й группе, которая являлась неосвеченным контролем, выращенным на низкосывороточной среде, чем можно объяснить морфологические отличия.

Полученные данные не позволяют сделать выводы в части применения НИЛИ с целью стимуляции пролиферации МСК in vitro, для оптимизации параметров воздействия необходима дальнейшая исследовательская работа. Однако о предельных режимах воздействия можно говорить достаточно уверенно, что в дальнейших исследованиях позволит ограничить диапазон варьирования параметрами освечивания и понять некоторые особенности биологического действия лазерного света именно на МСК.

Несмотря на значительный разброс энергетических параметров лазерного воздействия в исследованиях по изучению влияния НИЛИ на пролиферацию МСК, данные литературы в отношении оптимальной ЭП для непрерывного НИЛИ с длиной волны 633—635 нм находятся в достаточно узком диапазоне — 0,3—0,5 Дж/см2, при этом ПМ варьирует в значительно более широких пределах, от 3—6,61 мВт/см2 [18—23] до 32,6 мВт/см2 [20], а экспозиция — соответственно от 10 до 90 с (см. табл. 1). При этом M. Giannelli и соавт. [20] получили увеличение пролиферации более чем в 2 раза в первые 3 сут, что авторы связали с активацией Са2±каналов.

Необходимо заметить, что такие значения оптимальных энергетических параметров для стимулирования пролиферации МСК на порядок ниже, чем показано в исследованиях in vitro с другими типами клеток. Например, для различных фибробластов оптимальная ЭП НИЛИ составляет: 4,8 Дж/см2 (ПМ 0,6 мВт/см2) [46], 5 Дж/см2 при ПМ 2,2 мВт/см2 [47] и при ПМ 3 мВт/см2 [48, 49], 8 Дж/см2 при ПМ ~1 мВт/см2 [50].

В некоторых работах [24—26] положительные результаты воздействия НИЛИ с длиной волны 635 нм достигаются при значительно большей ЭП 5 — Дж/см2, но касаются они стимулирования высвобождения клетками эпидермального фактора роста (EGF). Возможно, различные физиологические проявления клеточной активности имеют место при вариациях энергетических и спектральных характеристик лазерного света.

Среди причин разброса энергетических параметров в зависимости от типа клеток и изучаемого параметра могут быть либо различия в спектрах поглощения клеток и соответственно эффективности светового воздействия, либо в механизмах и/или интенсивности регулирования разных физиологических процессов [51].

Из вышесказанного можно сделать вывод, что для длины волны 635 нм ЭП 1,3 Дж/см2 при плотности мощности ~5 мВт/см2 является предельным, уже не вызывающим стимулирование пролиферации МСК, дальнейшее увеличение этих параметров воздействия нецелесообразно, рекомендуется ограничить экспозицию 100 с при заданной П.М. Такой временной период определяется временем релаксации эндогенных волн Ca2+, регулирующих самые разнообразные внутриклеточные процессы, в том числе пролиферацию, а также участвующих во внеклеточных взаимодействиях МСК [52, 53].

К похожим выводам пришли и другие авторы, показав, что оптимальное значение ЭП составляет от 0,5 до 4,0 Дж/см2 в диапазоне длин волн от 600 до 700 нм и непрерывного режима работы лазеров, превышение этого уровня может вызвать ингибирование внутриклеточных процессов [54, 55].

В спектральном диапазоне 520—525 нм исследований по изучению фотобиологического действия на культуру животных клеток пока не проводилось, есть единичные работы, в которых использовался когерентный и некогерентный (светодиоды) свет в зеленом спектре с близкими длинами волн, но не МСК. R. Lubart и соавт. [56] показали, что освечивание на длине волны 544 нм (12—15 мВт/см2, 300 с, 4 Дж/см2) фибробластов активизирует их пролиферацию в несколько раз. Лазерный свет на длине волны 532 нм (1 мВт, ~10 Дж/см2) увеличивает концентрацию Ca2+ в лимфоцитах и стимулирует производство ими IL-2 [57, 58]. Освечивание узким (5 мм) лучом лазера с длиной волны 532 нм, мощностью 30 мВт при ЭП 4,6—6,9 Дж/см2 вызывает усиление пролиферации и рост мембранного потенциала митохондрий hADSCs, однако, если светить не более 30—45 с, увеличение экспозиции приводит к ингибированию всех процессов [15].

Результаты предварительного изучения возможного влияния непрерывного НИЛИ красного (635 нм) и зеленого (525 нм) спектров на морфологию, жизнеспособность, пролиферативную активность и скорость роста МСК in vitro показали, что при данных энергетических и временных параметрах воздействия их морфология и жизнеспособность не меняются, пролиферативная активность не стимулируется. Морфология освеченных клеток не имеет особенностей, все параметры культуры соответствуют норме.

Жизнеспособность культуры МСК, освеченных НИЛИ в режиме № 2 (зеленый спектр, 525 нм), на 15—20% ниже прочих вариантов, включая контроль. Возможно, при данном сочетании длины волны и плотности мощности может иметь место ингибирующее влияние. Однако данные статистически недостоверны и требуется дополнительное изучение данного вопроса.

Необходимо проведение более детальных исследований для оптимизации параметров воздействия (длина волны, мощность, время и пр.) с возможным расширением методики с освечиванием МСК не только предварительно, в культуре, но также после имплантации in vivo.

Полученные нами данные для длины волны 525 нм, равно как и для красного лазерного света (635 нм), демонстрируют предельный уровень выбранных энергетических параметров, при которых наблюдается не просто отсутствие положительного эффекта в отношении стимулирования пролиферации, но, возможно, и ингибирование. Для зеленого спектра и МСК таких данных в доступной литературе пока нет, но известно, что НИЛИ с длиной волны 410 и 420 нм значительно подавляют пролиферацию фибробластов in vitro при ежедневном освечивании с ЭП 5—10 Дж/см2, 453 нм также обладает некоторым ингибирующим действием, но при более высоких значениях ЭП (30 Дж/см2) [59].

Сравнительная оценка оптимальных энергетических параметров возможна только после уточнения спектров поглощения культуры МСК в разных спектральных диапазонах, но предварительные выводы на основе анализа данных литературы и собственных результатов позволяют сделать прогноз в отношении оптимальных параметров НИЛИ с длиной волны 520—525 нм, при которых возможно стимулирование пролиферации МСК. Это Э.П. 0,1—0,3 Дж/см2 при плотности мощности ~1—2 мВт/см2 и экспозиции не более 100 с. При анализе данных литературы необходимо также учитывать способ получения и другие особенности МСК.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования, редактирование: С.М., Д.К.

Сбор и обработка материала, статистическая обработка данных: С.М., Д.К., Е.А., А.Г., О.К.

Написание текста: С.М.