В настоящее время доказана важнейшая роль тромбоцитарного звена гемостаза при различных заболеваниях, особенно при кардиальной патологии.

В клинической практике для коррекции ишемических и гипоксических состояний используется метод гипербарической оксигенации (ГБО) [1], который вызывает легко компенсируемую гипокоагуляцию [2]. Известно, что реологические свойства клеток крови определяются структурной модификацией фосфолипидного компонента мембран [3].

Исследование упруго-вязкостных свойств клеточных мембран методом атомно-силовой микроскопии представляет исключительный интерес, поскольку именно они являются наиболее общими, интегральными показателями их функционального состояния [4], а сама структурная модификация поверхности тромбоцитов при их активации, как известно, является начальным этапом тромбообразования [5].

В доступной литературе встречаются единичные работы, посвященные изучению характера ультраструктурных изменений тромбоцитов при ГБО. Учитывая значение нарушений тромбоцитарно-сосудистого звена гемостаза в патогенезе острых и хронических заболеваний сердечно-сосудистой системы и широкое применение ГБО в медицинской практике, а также необходимость поиска новых методов лечения, нами предпринята попытка изучения влияния гипероксии на эластичность мембраны и спонтанную активность тромбоцитов при кардиальной коморбидности.

Цель исследования — оценить влияние ГБО на состояние эластичности мембраны при спонтанной агрегации тромбоцитов у пациентов с кардиальной коморбидностью.

Проведено экспериментальное проспективное моноцентровое исследование с участием пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС).

В исследование были включены пациенты с ИБС (стабильной стенокардией напряжения I—II функционального класса (ФК)), ассоциированной с артериальной гипертензией (АГ) в возрасте 52,9±11,5 года.

В исследование не включали пациентов с III—IV ФК стенокардии напряжения, некорригированной АГ, хронической сердечной недостаточностью III—IV ФК, хронической обструктивной болезнью легких.

Исследование проводили на базе терапевтических отделений Ульяновского областного клинического госпиталя ветеранов войн в 2015—2016 гг.

Участники исследования прошли обследование и лечение с оценкой всего лечебно-диагностического комплекса согласно европейским клиническим рекомендациям по ИБС, стенокардии и А.Г. Каждый пациент наблюдался в рамках исследования в течение 5 дней.

Всем пациентам, находящимся на стандартной медикаментозной терапии по основным заболеваниям, проводили курс лечения методом ГБО, состоящий из 5 ежедневных процедур в барокамерах БЛКС 301 М и БЛКС 303МК (Россия) продолжительностью 30 мин в режиме 1,2 ата. Параметры агрегации тромбоцитов оценивали перед 1-й и после 5-й процедуры ГБО. Для исследования забор крови до и после ГБО производили натощак из вены, при этом за сутки до проведения исследования необходимо было исключить употребление кофеинсодержащих и алкогольных напитков, жирных, острых и пряных блюд, специй и чеснока, курение, ограничить физические и психоэмоциональные нагрузки. Кровь для исследования у пациентов получали самотеком из локтевой вены через иглу 19G непосредственно в пластиковую пробирку с антикоагулянтом (3,2% цитрат натрия) в соотношении 1:9.

«Суррогатной» конечной точкой исследования явилось изменение параметров агрегации и показателя эластичности мембраны тромбоцитов после проведения ГБО.

Участники исследования были разделены на две группы — по полу.

Для исследования мембраны тромбоцитов методом атомно-силовой микроскопии получали плазму путем центрифугирования при 1500 оборотов/мин в течение 10 мин. Далее плазма отделялась от форменных элементов крови в одноразовые пластиковые чашки Петри.

Спонтанную агрегацию тромбоцитов определяли при помощи 2-канального лазерного анализатора Биола LA-230−2 (Россия) методом световой агрегометрии. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы кровь центрифугировали при 1000 оборотов/мин в течение 18 мин.

Упруго-вязкостные свойства клеточной мембраны тромбоцитов оценивали с помощью модуля ее изометрического сжатия (модуль Юнга; сканирующий зондовый микроскоп Solver P47-PRO (Nt-MDT, Россия) в контактном режиме с использованием кантилевера типа PNP-DB), характеризующего способность клетки к деформациям, возникающим при взаимодействии мембраны с вершиной зонда АСМ, и чем больше его значения, тем меньше упругие деформации клетки [6, 7].

Протокол исследования был одобрен 16.05.16 комиссией по этике медицинских исследований Ульяновского государственного университета.

Размер выборки предварительно не рассчитывался. Статистическую обработку данных проводили с использованием лицензионной компьютерной программы Statistica 10.0 («StatSoft Inc.», США). Данные представлены в формате M±SD. Достоверность полученных статистических данных оценивали по t-критерию Стьюдента. Различия считали статистически достоверными при p<0,05.

В группу участников исследования вошли 24 пациента с ИБС I—II ФК, ассоциированной с АГ, в возрасте 52,9±11,5 года, из них 67% мужчин и 33% женщин. Длительность ИБС составила 8,76±0,24 года, продолжительность АГ — 6,6±0,87 года.

При оценке исходной агрегации тромбоцитов (до ГБО) у пациентов с кардиальной коморбидностью в 33,3% случаев была выявлена гиперагрегация, в 25,0% — гипоагрегация и в 41,7% — нормоагрегация.

При изучении спонтанной агрегации тромбоцитов установлены недостоверные гендерные различия, характеризующиеся несколько более высокими значениями у мужчин по сравнению с женщинами (1,46 отн. ед. против 1,16 отн. ед. (p>0,05). Возможно, недостоверность гендерных различий обусловлена недостаточной выборкой пациентов в каждой из групп (табл. 1).

При гендерной оценке эластичности мембраны тромбоцитов у пациентов с кардиальной коморбидностью достоверных различий выявлено не было (0,78 МПа против 0,79 МПа; p>0,05).

Оценка эластичности мембраны тромбоцитов у обследованных пациентов в зависимости от исходного состояния их функциональной активности выявила бόльшую жесткость мембраны при состоянии гиперагрегации. Данные по исходной жесткости мембран тромбоцитов с учетом состояния их агрегации представлены в табл. 2.

При проведении атомно-силовой микроскопии активированных тромбоцитов выявлены их скопления с диаметром около 40 мкм и высотой 3 мкм при исходной гиперагрегации (рис. 1, 2)

Сравнительная оценка спонтанной активности тромбоцитов, проведенная после 5 процедур ГБО, выявила тенденцию к ее снижению у мужчин в отличии от женщин (см. табл. 1).

Изменение модуля упругости при ГБО отличалось в зависимости от исходной функциональной активности тромбоцитов. Так, применение курса ГБО у пациентов с повышенной агрегацией тромбоцитов сопровождалось снижением модуля упругости, что свидетельствует о повышении эластичности мембраны. У пациентов с нормо- и гипоагрегацией тромбоцитов отмечалась только тенденция к снижению показателя упругости тромбоцитов (р>0,05) (табл. 3).

Показатели упругости, рассчитанные по модулю Юнга, после курса ГБО характеризовались достоверным уменьшением у мужчин (0,78±0,21 МПа против 0,54±0,15 МПа; p<0,05) и увеличением у женщин (0,79±0,16 МПа против 0,85±0,26 МПа; p>0,05). Это свидетельствует о большей жесткости мембраны тромбоцитов у женщин по сравнению с мужчинами (р<0,05).

За время проведения исследования нежелательных явлений обнаружено не было.

Одним из возможных механизмов, объясняющих снижение жесткости мембраны тромбоцитов у мужчин при воздействии ГБО, может быть гендерное различие локальных эластических свойств мембраны в ответ на гипероксию. Известно, что в тромбоцитах непосредственно у внутреннего слоя мембраны находится микротубулярное кольцо, образованное белком тубулином и локализованное вдоль окружности мембраны. Тубулин занимает относительно большую поверхность, вследствие чего сохраняется дискоидная форма интактных тромбоцитов. У дискоидных форм микротрубочки локализуются по внутреннему периметру мембраны, в случае активации они разрушаются и хаотично распределяются по цитоплазме с последующим изменением формы клетки из дискоидной в сферическую, вызывая изменения эластических свойств мембраны тромбоцитов [8]. Изменение модуля упругости при агрегации свидетельствует о запуске процессов реорганизации цитоскелета при активации тромбоцитов [4].

Полученные факты свидетельствуют об ограниченности использования только агрегатометрии для оценки эффекта антитромбоцитарного препарата и не позволяют однозначно интерпретировать эффект дифференцированного влияния ГБО на ультраструктурные основы агрегации активных и неактивных тромбоцитов.

ГБО оказывает мембраномодифицирующий эффект на тромбоциты, более выраженный у пациентов с повышенной функциональной активностью, которая выражается в улучшении эластичности мембраны и снижении спонтанной агрегации тромбоцитов. Гендерные отличия характеризуются достоверным уменьшением жесткости мембраны после лечения методом ГБО у мужчин. Полученные результаты могут быть обоснованием целесообразности применения ГБО в указанных режимах для коррекции гиперреактивности тромбоцитов и тем самым для расширения показаний к использования данного метода.

Источник финансирования. Исследование и публикация статьи осуществлены на личные средства авторского коллектива.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Благодарности. Авторы выражают признательность Мутале Муленга за помощь в переводе.

Участие авторов: Рузов В.И. — разработка концепта исследования, руководство проектом, редактирование текста статьи; Алтынбаева Э.Н. — отбор пациентов для исследования, проведение ГБО-терапии, логистика, редактирование текста статьи, работа с литературой; Горячая М.Н. — определение агрегации тромбоцитов, редактирование статьи; Арямкина О.Л. — отбор пациентов для исследования, редактирование текста статьи; Костишко Б.Б. — проведение атомно-силовой микроскопии; Чурсанова Н.В. — логистика, работа с литературой; Воробьев А.М. — логистика, редактирование статьи, связь с редакцией, работа с литературой.

Сведения об авторах

*Воробьев Андрей Михайлович [Andrey M. Vorobev]; адрес: Россия, 432000, Ульяновск, ул. Кузнецова, 26 [address: 26 Kuznetsova str., 432000 Ulyanovsk, Russia]; https://orcid.org/0000-0002-7461-4780; eLibrary SPIN: 2054-8754; e-mail: kreed73@yandex.ru

Рузов Виктор Иванович, д.м.н., профессор [Victor I. Ruzov, MD, PhD, Professor]; https://orcid.org/0000-0001-7510-3504; eLibrary SPIN: 9374-9249; e-mail: viruzov@yandex.ru

Алтынбаева Эльвира Наильевна [Elvira N. Altynbaeva]; https://orcid.org/0000-0001-7249-3076; eLibrary SPIN: 7262-4358; e-mail: eliese@yandex.ru

Горячая Марина Николаевна [Marina N. Goryachaya]; https://orcid.org/0000-0001-7249-3076; eLibrary SPIN: 6385-1323; e-mail: marina.gorya4aya@yandex.ru

Арямкина Ольга Леонидовна д.м.н., профессор [Olga L. Aryamkina, MD, PhD, Professor]; https://orcid.org/0000-0002-0149-6103; eLibrary SPIN: 6176-5907; e-mail: aol56@yandex.ru

Костишко Борис Борисович [Boris B. Kostishko]; https://orcid.org/0000-0002-1112-0740; eLibrary SPIN: 2648-6046; e-mail: cagkaf@yandex.ru

Чурсанова Наталья Валерьевна [Natalia V. Chursanova]; https://orcid.org/0000-0002-4050-2967; eLibrary SPIN: 5654-1410; e-mail: natasha.hudiackova2016@yandex.ru