Атеротромботический ишемический инсульт (АТИ) составляет 40—60% всех подтипов ишемического инсульта (ИИ) [1, 2] и возникает вследствие атеросклеротического поражения прецеребральных или крупных церебральных артерий. Атеросклеротическая бляшка обычно растет медленно и длительное время остается стабильной, однако впоследствии может возникать ее разрыв, на ней могут образовываться трещины или эндотелиальные эрозии, что вызывает агрегацию тромбоцитов и формирование тромба. Это в свою очередь приводит к локальной окклюзии сосуда или эмболизации дистального сосудистого русла [3]. Проведенные клинические исследования продемонстрировали важность контроля факторов риска для уменьшения больших сосудистых событий у больных с атеросклеротическим поражением интракраниальных артерий [4]. Несмотря на многочисленные исследования, некоторые клинические и патогенетические аспекты АТИ изучены недостаточно [5].
Цель работы — уточнить клинические и лабораторные предикторы исхода острого периода АТИ.
Материал и методы
Проведено комплексное обследование 119 больных с АТИ: 79 (66,4%) мужчин и 40 (33,6%) женщин, средний возраст 69,6±1,4 года. В зависимости от возраста обследуемые были разделены на группы: в 1-ю группу вошел 51 (42,9%) больной 45—59 лет, во 2-ю — 68 (57,3%) пациентов 60—74 лет.
Диагноз ИИ верифицировали по данным КТ (Astelon 4, Toshiba) или МРТ (Simens, Magnetom Avanto, 1,5 Tл) головного мозга. Критерии диагностики АТИ включали наличие окклюзии или гемодинамически значимого стеноза (>70% просвета сосуда) внутренних сонных или крупных интракраниальных артерий по данным транскраниального дуплексного сканирования.
АТИ в каротидной системе диагностировали у 104 (87,4%) больных, в вертебрально-базилярной — у 15 (12,6%). Атеросклероз (АС) выявили у 43 (36,1%) пациентов, сочетание гипертонической болезни и АC — у 79 (66, 4%), ИБС — у 51 (42,9%), сахарный диабет — у 27 (22,7%). Выраженность неврологического дефицита определяли на 1-е, 7-е и 14-е сутки по шкале NIHSS.
Количество лейкоцитов периферической крови в стадии апоптоза и некроза изучали с помощью проточного цитофлуориметра EpicsXL («Beckman Coulter», CША) с использованием набора реагентов ANNEXIN V-FITC-Kit («Bender Medsystems», Австрия). Анексин V применяли для выявления клеток, которые вступили в апоптоз (АNV+-клетки), пропидия йодид — в качестве маркера клеточного некроза (PI+-клетки). Количество лейкоцитов с повышенным внутриклеточным содержанием АФК (АФК+-клетки) определяли с помощью проточной цитофлуориметрии с использованием дихлорфлюоресцеина диацетата («Sigma Aldrich», США), количество клеток с пониженным митохондриальным мембранным потенциалом (ММП) (Mito+-клетки) — с помощью реагентов MitoCaptureTM Mitochondrial Apoptosis Detection Fluorometric Kit («Biovision», США). Активность супероксиддисмутазы (СОД) измеряли по снижению скорости восстановления нитротетразолия синего в присутствии феназинметасульфата и НАДФ и выражали в условных единицах (у.е.). Контрольную группу (КГ) составили 34 здоровых; группы были сопоставимы по возрасту и полу.
Статистическая обработка полученных результатов выполнена с помощью пакета статистического анализа Statistica 8. Сравнение выборок осуществлено с применением критерия Стьюдента (t) и коэффициента корреляции Пирсона (r). Для определения предикторов течения острого периода АТИ использовали метод линейной множественной регрессии.
Результаты
У 85 (71,4%) больных с АТИ обнаружено постепенное развитие неврологической симптоматики с нарастанием симптомов от нескольких часов до 2 сут. У 26 (21,8%) пациентов в анамнезе имелись транзиторные ишемические атаки (ТИА) в том же сосудистом бассейне. Систолическое артериальное давление (САД) в дебюте АТИ в среднем составило 172,6±3,9 мм рт.ст., диастолическое АД — 98,0±1,5 мм рт.ст. У 81 (68,1%) больного АД было повышенным. САД от 140 до 200 мм рт.ст. определяли у 59 (49,6%), выше 200 мм рт.ст. — у 22 (18,5%) пациентов.
Общемозговая симптоматика выявлена у 27 (22,7%) пациентов. Уровень сознания по шкале комы Глазго на 1-е сутки составил 14,15±0,16 балла. Сохранение сознания наблюдали у 94 (79,0%) пациентов, оглушение — у 15 (12,6%), сопор — у 6 (5,0%), психомоторное возбуждение — у 4 (3,4%). Степень нарушения сознания коррелировала с тяжестью неврологического дефицита (r=0,627; p=0,004), размерами АТИ (r=0,565; p=0,005) и наличием отека по данным нейровизуальных методов обследования (r=0,532; p=0,008). Частота повторных ИИ составила 9,2%.
В соответствии со шкалой NIHSS на 1-е сутки легкий АТИ диагностировали у 27 (22,7%) больных, среднетяжелый — у 53 (44,5%), тяжелый — у 35 (29,4%) и очень тяжелый — у 4 (3,4%). На 7-е сутки неврологический дефицит увеличился у 74 (62,2%) больных. У 45 (37,8%) больных с небольшими и средними размерами инфаркта наблюдали уменьшение выраженности неврологической симптоматики. На 14-е сутки отсутствовала достоверная положительная динамика неврологического дефицита по шкале NIHSS по сравнению с 1-ми и 7-ми сутками. На 1-е сутки тяжесть АТИ достоверно не отличалась у больных разного возраста: в 1-й группе степень тяжести составила 10,88±0,94 балла, во 2-й — 10,58±0,84 балла. На 7-е сутки у пациентов обеих групп отсутствовала достоверная динамика тяжести неврологического дефицита — 10,83±0,87 и 11,84±0,65 балла соответственно. На 14-е сутки у больных 1-й группы наблюдались меньшие показатели NIHSS по сравнению с пациентами 2-й группы — 9,67±0,89 и 11,38±1,02 балла соответственно (p<0,01).
По данным МРТ, для АТИ было характерно развитие очага поражения в одном бассейне, преимущественно в лобной — в 33 (27,7%), лобно-теменной — в 22 (18,5%) и височно-теменной — в 17 (14,3%) областях, средний размер очага составил 43,06±6,08 см3. Малый И.И. был обнаружен у 7 (5,9%) пациентов, средний — у 81 (68,1%) и крупный — у 31 (26,1%). У 86 (72,3%) больных имелись признаки хронической ишемии головного мозга. Перифокальный отек в зоне ишемического очага наблюдался у 33 (27,7%) больных с большими АТИ, дислокация срединных структур — у 18 (15,1%) пациентов. Выявлена связь между размером и тяжестью АТИ в 1-е (r=0,415; p=0,020) и 7-е (r=0,610; p=0,002) сутки заболевания.
У 27 (22,7%) пациентов наблюдалось раннее неврологическое ухудшение (РНУ) в виде нарастания очаговой симптоматики на 2—3-и сутки заболевания. РНУ было связано с доформированием зоны ишемии, появлением отека и повторными цереброваскулярными событиями. Обнаружена связь между РНУ и наличием в анамнезе ТИА (r=0,595; р=0,008), исходным уровнем САД (r= ‒0,659; р=0,003) и степенью стеноза сонных артерий на стороне очага поражения (r=0,562; р=0,007).
Многофакторный анализ показал, что наибольшее влияние на течение острого периода АТИ имели следующие факторы: возраст, САД, размер очага, степень нарушения сознания (по шкале Глазго). Показатель регрессии R, рассчитанный с помощью метода множественной линейной регрессии с учетом этих факторов, составил на 1-е сутки 0,496 (p=0,01). Наблюдалась отрицательная зависимость между уровнем САД в дебюте заболевания с тяжестью АТИ: САД ниже 140 мм рт.ст. было неблагоприятным для течения острого периода АТИ. На 7-е сутки при включении тех же факторов R составил 0,739 (р<0,0001), а при введении дополнительно такого фактора, как ТИА в анамнезе, R составил 0,771 (р<0,0001). На 14-е сутки R составил 0,620 (р<0,0001).
Проанализированы содержание АNV+-, PI+-, АФК+— и Mito+-клеток на 1-е и 7-е сутки АТИ (табл. 1).
Установили, что в остром периоде АТИ на 1-е сутки имели место митохондриальная дисфункция, внутриклеточный окислительный стресс, апоптоз и некроз лейкоцитов крови, что проявлялось увеличением в крови количества лейкоцитов в стадии апоптоза и некроза, а также лейкоцитов с повышенным содержанием АФК и пониженным ММП по сравнению с контролем.
Проведенный корреляционный анализ показал тесную связь между показателями апоптоза, энергетическим состоянием митохондрий и уровнем активных форм кислорода в лейкоцитах периферической крови. Отмечалась достоверная связь количества АФК+— и Mito+-клеток в 1-е сутки АТИ (r=0,869; p=0,001). Выявленные связи свидетельствуют о том, что внутриклеточная генерация АФК у больных с АТИ связана с митохондриальной дисфункцией и снижением ММП. Также в 1-е сутки наблюдалась достоверная связь между количеством Mito+— и АNV+-клеток (r=0,838; p=0,004). Приведенные данные показывают, что при АТИ имеет место митохондриальный путь инициации апоптоза. Также установлена зависимость между количеством Mito+— и РІ+-клеток (r=0,782; p=0,001). Митохондрии являются как источником, так и мишенью для внутриклеточных АФК, которые образуются в ряде окислительно-восстановительных реакций в митохондриальном матриксе [6, 7]. Митохондрии легко повреждаются при окислительном стрессе, так как состоят из внутренних и внешних мембран, содержащих жидкости и белки, которые в первую очередь разрушаются АФК [8]. При падении ММП и открытии митохондриальных пор перехода за счет значительного снижения уровня АТФ развиваются апоптоз или некроз клеток [9].
На 7-е сутки количество PI+-клеток в периферической крови достоверно снижалось по сравнению с 1-ми сутками, однако оставалось выше, чем в контроле. Полученные результаты динамики уровня PI+-клеток свидетельствуют, что наиболее выраженные процессы гибели клеток путем некроза при АТИ наблюдаются в 1-е сутки ИИ, что совпадает по времени с формированием первичного очага некроза (ядро инфаркта). В дальнейшем выраженность процессов некротической гибели клеток уменьшается. Уровень АФК+— и Mito+-клеток достоверно снижался наряду с уменьшением количества РІ+-лейкоцитов. Не отмечено достоверной динамики содержания АNV+-клеток, т. е. на 7-е сутки АТИ преобладал апоптический механизм клеточной смерти.
При детальном анализе обнаружено, что, несмотря на положительную в целом динамику образования внутриклеточных АФК на 7-е сутки ИИ, у части пациентов с тяжелыми АТИ, с крупным очагом инфаркта (более 100 см3), количество АФК+-клеток увеличивалось. Это связано с тем, что при обширном инсульте массивное выделение АФК вызывает эндотелиальную дисфункцию, повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и усиленный выход металлопротеаз, увеличивая тем самым размеры инфаркта за счет гибели клеток в области пенумбры [10]. Основная роль в избыточной продукции АФК принадлежит митохондриям. Одновременно у этих больных увеличивалось количество АNV+-, РІ+— и Mito+-клеток в периферической крови. Это указывало на то, что при тяжелом АТИ процессы апоптоза и некроза продолжаются в течение 1-й недели острого периода, вероятно, принимая участие в доформировании ишемического очага.
На 7-е сутки сохранялась связь между количеством АФК+— и Mito+-клеток (r=0,623; p=0,011). Установлена тесная положительная зависимость функционального состояния больных и показателей интенсивности апоптоза на 1-е и 7-е сутки АТИ. Выявлена зависимость между тяжестью АТИ с количеством Мito+-клеток на 1-е (r=0,742; p=0,009) и 7-е сутки инфаркта (r=0,717; p=0,002). Не обнаружили достоверной связи между содержанием АNV±лейкоцитов в периферической крови и тяжестью состояния больных в 1-е сутки. Однако выраженность неврологического дефицита находилась в прямой зависимости от уровня лейкоцитов в стадии апоптоза на 7-е (r=0,595; p=0,015) и 14-е сутки (r=0,670; p=0,007). Наличие корреляционной связи между тяжестью АТИ с содержанием в крови Мito+— и АNV+-клеток указывает на прямое влияние митохондриальной дисфункции и митохондрий-индуцированного апоптоза на течение острого периода АТИ.
Анализ динамики показателей апоптоза выявил, что у больных с нарастанием неврологического дефицита в течение 48—72 ч наблюдается значительная активация процессов клеточной смерти. Установлены достоверно более высокие показатели ANV+-, АФК+— и Мito+-клеток у больных с РНУ по сравнению с пациентам со стабильной неврологической симптоматикой на 2—3-и сутки заболевания (p<0,05) (см. рисунок). Не выявлено достоверной разницы в содержании PI+-клеток у больных с РНУ и без РНУ.
Таким образом, увеличение содержания внутриклеточных АФК и активация процессов апоптоза играют определенную роль в прогрессировании неврологического дефицита в остром периоде АТИ. Установлено снижение активности внутриклеточной СОД-зависимой антиоксидантной системы защиты (АОСЗ) в дебюте АТИ, что подтверждалось снижением по сравнению с контролем активности СОД в 1-е сутки (общей СОД, Cu, Zn- и Mn-СОД). При этом активность митохондриальной СОД была достоверно ниже, чем Cu, Zn-СОД (табл. 2).
У больных с АТИ обнаружен выраженный дисбаланс между процессами внутриклеточного образования АФК и активностью СОД-зависимой АОСЗ, особенно Mn-СОД. При повышенной генерации внутриклеточных АФК, которая является преимущественно митохондриальной, не наблюдалось компенсаторного роста активности АОСЗ, что указывало на недостаточный синтез Mn-СОД митохондриями в условиях ишемического повреждения. Ряд исследований свидетельствует о том, что Mn-СОД защищает сосудистую митохондриальную ДНК от повреждений и предупреждает развитие атеросклероза [6]. Кроме того, Mn-СОД синтезируется преимущественно эндотелием, и резко сниженная ее активность может указывать на гибель эндотелиоцитов при АТИ. Такие изменения, вызванные гиперпродукцией АФК в митохондриях, ухудшают исход ИИ вследствие углубления эндотелиальной дисфункции, повышения проницаемости ГЭБ и усиленного выхода металлопротеаз [10, 11]. Установлена достоверная отрицательная связь между активностью общей СОД и Mn-СОД в 1-е сутки с тяжестью АТИ на 7-е сутки (r=–0,628; p=0,010 и r=0,675; p=0,008 соответственно). Таким образом, низкая активность СОД в дебюте заболевания является неблагоприятным прогностическим фактором течения острого периода АТИ. При тяжелых инсультах низкая активность Cu, Zn-СОД не в состоянии нейтрализовать массивного образования внутриклеточных АФК, особенно с учетом чрезвычайно низкой активности митохондриальной изоформы.
На 7-е сутки АТИ выявлено достоверное снижение общей активности СОД по сравнению с исходными значениями за счет внутриклеточной СОД, активность которой снизилась в 3 раза. Активность Mn-СОД достоверно не изменялась по сравнению с 1-ми сутками. Отсутствие динамики активности Mn-СОД еще раз подтверждало наличие энергетического дефицита и неспособность митохондрий в условиях гипоксии к генерации СОД. Снижение активности СОД при тяжелых АТИ на 7-е сутки сопровождалось ростом количества АФК+-клеток. Учитывая достоверно более высокие исходные показатели активности Cu, Zn-СОД по сравнению с Mn-СОД и ее снижение на 7-е сутки, можно предположить, что обезвреживание внутриклеточных АФК при АТИ происходит преимущественно за счет внутриклеточной изоформы СОД.
Выводы
1. Среди клинических факторов, оказывающих негативное влияние на течение острого периода АТИ, наибольшее значение имеют: крупный размер очага, нарушение сознания в 1-е сутки, низкий исходный уровень САД (менее 140 мм рт.ст.), возраст больного старше 60 лет, наличие ТИА в анамнезе.
2. В остром периоде АТИ имеют место митохондриальная дисфункция, внутриклеточный окислительный стресс, апоптоз и некроз лейкоцитов крови, что проявляется ростом количества АNV+-, РІ+-, АФК+— и Мito+-клеток. Обнаруженные связи тяжести инсульта с содержанием Мito+— клеток с количеством АФК+— и АNV+-клеток указывают на прямое влияние митохондриальной дисфункции и митохондрий-индуцированного апоптоза на течение АТИ в остром периоде.
3. Высокое содержание АNV+-клеток и АФК+-положительных клеток наряду с низким содержанием интрацеллюлярной изоформы СОД может быть предиктором неблагоприятного течения острого периода АТИ.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.