Исследования последних лет показали, что лактат наряду с глюкозой является основным источником энергии для нейронов не только в условиях гипоксии, но и в норме [1—3]. Согласно «лактат-челночной» (lactate-shuttle) гипотезе, превращение глюкозы в лактат происходит в глиальных клетках — астроцитах, которые и снабжают им нейроны [4, 5]. Кроме того, как и молекула АТФ, молекула лактата выполняет не только трофическую, но и сигнальную функцию, связываясь с несколькими рецепторами в ЦНС [3, 6—10]. При этом молекула искусственного оптического изомера L-лактата — D-лактата — может выступать в качестве антагониста некоторых из этих рецепторов [3, 10]. Сигнальный путь лактата может играть важную роль в ряде мозговых процессов [10—12]. Нарушение этого сигнального пути и/или оборота лактата в головном мозге может быть одной из причин целого ряда патологических явлений [1, 13]. Так, повышенный уровень лактата может участвовать в формировании некоторых видов инсомнии [14]. Уровень лактата в головном мозге находится в тесной связи с состоянием организма в цикле бодрствование—сон [1, 13, 15—17]. Показано, что концентрация лактата в межклеточной среде головного мозга мышей возрастает в бодрствовании и в фазу быстрого сна и снижается при медленном сне [15, 18—21].
Была поставлена цель — проверить, возможно ли обратное влияние изменения концентрации мозгового лактата на цикл бодрствование—сон. В соответствии с рабочей гипотезой кратковременное резкое повышение концентрации внутримозгового L-лактата должно приводить к подавлению медленного сна и увеличению представленности бодрствования и быстрого сна в последующие несколько часов. Введение D-лактата должно подавлять бодрствование и быстрый сон и увеличивать медленный сон.
Материал и методы
В процессе исследования 20 взрослых самцов белых крыс были прооперированы под общим наркозом (золетил, 35 мг/кг, внутримышечно). Животным вживляли эпидуральные электроды для регистрации лобно-теменных отведений электрокортикограммы (ЭКоГ). Поскольку лактат не проходит гематоэнцефалический барьер, животным вживляли также канюли (по одной) в боковой желудочек головного мозга. Электроды представляли собой миниатюрные винтики из нержавеющей стали. Каждому животному вживляли 5 электродов — по 2 в лобную и теменную кору и 1 референтный электрод в носовую кость. После операции животных помещали в индивидуальные звукоизолированные боксы при постоянном световом режиме 12/12 (09:00—21:00 — яркий (150 лк) белый свет, 21:00—09:00 — слабый (15 лк) красный) и температуре 22—24 °C. Вода и пища были доступны постоянно.
По истечении недельного периода восстановления каждому животному поочередно (с интервалом не менее 2 сут) вводили через канюлю (внутрижелудочково) физиологический раствор (5 мкл) (контроль), а затем 0,1 мг (200 mM) Na-соли L- или D-лактата («Sigma-Aldrich», США) в 5 мкл физиологического раствора. Это примерно в 4 раза превышает естественную концентрацию L-лактата в пересчете на суммарный объем внеклеточной жидкости мозга крысы [10, 18]. Для введения животного извлекали из экспериментальной камеры, мягко фиксировали, канюлю открывали и подсоединяли к гибкой пластиковой трубочке. Введение осуществляли с помощью микрошприца. Каждое введение продолжалось не менее 3 мин. Затем животное вновь помещали в его камеру и подключали к отводящему кабелю. Каждому животному выполняли только 2 введения: одно контрольное и одно либо с L-, либо с D-лактатом.
Для проверки точности локализации кончика канюли в боковом желудочке каждому животному по окончании экспериментов был проведен ангиотензиновый тест [22]. Для этого животному вводили через канюли по 0,5 мкг пептида ангиотензин-2 в 5 мкл физиологического раствора. В случае проникновения вводимого раствора через монроево отверстие, соединяющее боковой желудочек с третьим, через несколько минут после введения наблюдается ярко выраженная питьевая реакция. Для окончательного анализа были отобраны 20 крыс, которые прошли этот тест.
Сразу после введения, в 15:00, начинали непрерывную 6-часовую регистрацию полисомнограммы (ПСГ), включающей 2 канала электроэнцефалограммы (ЭЭГ) и запись механограммы (двигательной активности), а также видеорегистрацию поведения животных. Каждое животное было подсоединено посредством гибкого кабеля к входу 2-канального миниатюрного автономного цифрового телеметрического усилителя биопотенциалов размером 30×25×4 мм и массой 5 г, конструкции А.А. Трощенко1, снабженного 3-мерным акселерометром. Плата усилителя была соединена эластичной связью с источником питания и вместе с ним подвешена к штанге над камерой посредством миниатюрного вращающегося карабина. Такая конструкция дает возможность регистрировать ПСГ, не ограничивая свободу перемещений животного, и позволяет плате усилителя биопотенциалов со встроенным акселерометром свободно колебаться в трех плоскостях и реагировать даже на небольшие движения крысы. ЭЭГ регистрировали с частотой дискретизации 250 Гц, а двигательную активность — с частотой 50 Гц. Сигналы усилителя передавались на регистрирующий компьютер по каналу blue tooth. Проводили визуальный анализ полученных ПСГ по 20-секундным эпохам с помощью специальной программы, созданной на базе браузера EDF с открытым кодом [23]. По общепринятым критериям для грызунов выделяли состояния бодрствования, медленного и быстрого сна.
Протокол исследования был поддержан этической комиссией ИПЭЭ РАН.
Статистический анализ проводили с помощью непараметрического критерия Вилкоксона (T-test).
Результаты
Однократное введение в боковой желудочек мозга 5 мкл 0,2-молярного раствора L-лактата 10 крысам не оказывало никакого эффекта на цикл бодрствование—сон в последующие 6 ч светлого периода суток по сравнению с контрольным ведением физиологического раствора тем же животным (см. рисунок). Аналогичное введение D-лактата другим 10 крысам вызывало достоверное снижение процентной представленности (суммарной длительности) бодрствования по сравнению с контролем (с 34,8 до 26,5%, или со 125 до 95 мин) за 6-часовый период записи (p<0,01; T-test Вилкоксона). Соответственно происходило повышение процентной представленности медленного сна (с 57,4 до 69,2%, или с 207 до 249 мин; p<0,01). Что касается быстрого сна, то его представленность также снижалась после введения D-лактата (с 7,7 до 4,2%, или с 28 до 15 мин), однако это снижение не достигало достоверных значений.
Изменение структуры цикла бодрствование—сон у белых крыс в первые 6 ч после введения L- (слева, n=10) и D-(справа, n=10) лактата по сравнению с контрольными введениями 5 мкл физиологического раствора.
По оси абсцисс — состояния бодрствования (Б), медленного (МС) и быстрого (ПС) сна; по оси ординат — проценты от времени записи (100%=6 ч). * — p<0,01 по сравнению с контролем (T-критерий Вилкоксона).
Обсуждение
Таким образом, оказалось, что искусственный оптический аналог D-лактат, в природе не встречающийся, способен при однократном введении непосредственно в желудочки головного мозга увеличивать процентную представленность медленного сна (по сравнению с контролем) в течение последующих нескольких часов. Если учесть, что введение проводили в дневное время, когда представленность сна у крыс и так высока, то выявленный эффект (увеличение суммарной продолжительности медленного сна за 6 ч примерно на 40 мин) можно признать значительным. У натурального L-лактата наблюдалось полное отсутствие эффекта. Причина этого остается неизвестной, но можно предположить, что его уровень в межклеточной жидкости головного мозга исходно настолько велик, что добавленная доза препарата не может его существенно изменить.
Увеличение сна после введения D-лактата можно объяснить блокированием рецепторов L-лактата. Таким образом, в сомнологических экспериментах подтвердилось, что D-лактат может играть роль антагониста одного или нескольких рецепторов его естественного оптического аналога. Вопрос, о каком именно рецепторе (рецепторах) может идти речь (HCA1, OR51E2, GPR4 или каком-то ином), требует проведения дополнительных исследований.
Выявление сомногенных свойств у D-лактата представляет определенный интерес и с фармакологической точки зрения, поскольку эта простая молекула могла бы послужить основой для создания нового снотворного препарата. Однако для этого нужно добиться, чтобы молекула D-лактата оказалась способной проникать через гематоэнцефалический барьер. Необходимо отметить, что современная фармакохимия знает разные способы решения этой проблемы (структурные модификации лекарственной молекулы с целью повышения ее липофильности без потери основной активности, помещение лекарственной молекулы в жировую нанокапсулу и пр.), так что она не представляется непреодолимой.
Заключение
Искусственный оптический аналог L-лактата — D-лактат — способен при однократном введении в боковой желудочек головного мозга крыс подавлять бодрствование и увеличивать медленный сон в последующие 6 ч светлого времени суток. Этот эффект, по-видимому, опосредуется одним (или несколькими) из рецепторов L-лактата, по отношению к которым D-лактат выступает в качестве антагониста.
Работа поддержана грантом РНФ (проект №17-15-01433).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.