При развитии ишемического инсульта (ИИ) в головном мозге происходит перераспределение функциональных и анатомических связей между нейронами, от которого зависит степень функционального восстановления пациента [1]. Реализацию этого процесса обеспечивает ряд физиологических механизмов: апоптоз, пранинг (локальный, отграниченный «молекулярными тормозами» апоптоз части аксона или дендрита), спраутинг, нейрогенез [2]. Все эти процессы могут быть инициированы посредством внешней рецептор-опосредованной активации апоптозиндуцирующих сигнальных путей [3—7]. Любая их точка в каждый момент времени может быть представлена как точка бифуркации сигнала в рамках вилки возможностей: обучение (адаптация клетки к изменившимся условиям микроокружения) или реализация клеточной гибели при невозможности адаптации [8] (рис. 1). Выбор определяется состоянием нейрона в данный момент времени, факторами окружающей его микросреды в текущий момент времени и в прошлом (так как в прошлом они обеспечивали последовательное преобразование морфологической структуры нейрона и включающих его сетей до состояния в текущем моменте) [2]. Значимым фактором микроокружения является непрерывная атака растворимыми и мембраносвязанными лигандами смерти соответствующих рецепторов на поверхности нейрона [9]. К факторам, способствующим успешной адаптации и выживанию нейрона, можно отнести функциональную активность сети, что подразумевает повышение нейромедиаторной, электросинаптической стимуляции [10], стимуляцию факторами роста [11, 12], достаточное энерго- и субстратное обеспечение [13]. С учетом позиции, что ИИ и последующий восстановительный период, сопровождающийся утратой привычных паттернов двигательной и социальной активности вследствие неврологического дефицита, является актуальной стрессовой ситуацией, приводящей к активации стресс-реализующих систем организма, следует ожидать их значимого влияния на соотношение вышеуказанных факторов. Выявление паттернов этого влияния имеет большое клиническое значение, так как в настоящее время существуют реальные клинические возможности для модулирования соотношения участия стресс-реализующих систем организма в реализации ответа на актуальное стрессовое воздействие [14, 15]. В настоящем исследовании выявлен феномен влияния нейрогуморального ответа на выраженность активности Fas-лиганда периферической крови и клиническое течение острого периода ИИ, а также рутинные клинические показатели, которые можно использовать для ориентировочной оценки этого влияния.

Рис. 1. Схематичное изображение влияния апоптоз-индуцирующих факторов на результат конкуренции реализации процессов в рамках вилки возможностей: обучение (адаптация клетки к изменившимся условиям микроокружения) или реализация клеточной гибели.

ММР-9 — металлопротеиназа-9; . — точка бифуркации; sDL — растворимый лиганд смерти; tmDR — трансмембранный рецептор смерти; sDR — растворимый рецептор смерти, CD3 — CD3+лимфоцит.

Материал и методы

Объектами исследования явились пациенты, впервые перенесшие ИИ в бассейне левой и правой средних мозговых артерий (ЛСМА и ПСМА соответственно), установленный клинически, подтвержденный при помощи методов нейровизуализации (магнитно-резонансной томографии — МРТ, режимы Т1, Т2, DVI, компьютерной томографии — КТ) или патологоанатомически, и подписавшие информированное добровольное согласие на участие в исследовании. В исследование не включали пациентов с геморрагическим характером нарушения мозгового кровообращения, повторным эпизодом нарушения мозгового кровообращения по ишемическому типу, наличием черепно-мозговых травм, онкологических и аутоиммунных заболеваний в анамнезе, аллергических, воспалительных реакций, не связанных с ИИ, и тяжелой соматической патологией в стадии декомпенсации на момент исследования. Группу контроля составили сопоставимые по полу и возрасту добровольцы, подписавшие информированное согласие на участие в исследовании. Участие в исследовании не изменяло плана диагностических и лечебных мероприятий: все пациенты получали объем медицинской помощи в соответствии со стандартом медицинской помощи больным с инсультом (при оказании специализированной помощи). Исследование соответствовало требованиям Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (2000) и было одобрено Межвузовским этическим комитетом.

В ходе исследования обследованы 948 больных, поступивших по каналу Скорой медицинской помощи в неврологический стационар и отделение реанимации ГКБ №6 и №36 ДЗ Москвы в период с 2011 по 2013 г. Из них критериям включения в исследование соответствовали 155 больных (74 мужчины и 81 женщина). Группу контроля составили 28 человек, 15 мужчин и 13 женщин (см. таблицу).

Характеристика группы обследованных и группы контроля

Для объективизации тяжести состояния, выраженности очагового неврологического дефекта и динамики клинических показателей использовали балльную шкалу оценки тяжести неврологического дефекта после инсульта Национального института здоровья (National Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS) [16]. Для экспресс-оценки тяжести депрессии и тревоги на 7-е и 21-е сутки пребывания пациентов с ИИ в стационаре и однократно в группе контроля использовали Госпитальную шкалу тревоги и депрессии (Hospital Anxiety and Depression Scale, HADS) [17]. Для определения уровня психоэмоционального стресса на 7-е и 21-е сутки пребывания пациентов с ИИ в стационаре и однократно в группе контроля использовали опросник Reeder (Daily Life Stress scale) [18]. Определение содержания sFas, sFasL, кортизола (К), адреналина (А), норадреналина (НА), адренокортикотропного гормона (АКТГ) в плазме крови пациентов с ИИ на 1, 7 и 21-е сутки пребывания в стационаре и однократно в группе контроля проводили методом иммуноферментного анализа ELISA (Enzyme Linked Immunoassay) с помощью стандартных тест-систем и многоканального спектрофотометра Multiscan EX («Labsystems», Финляндия). Иммунологическое исследование включало фенотипирование CD3CD95+лимфоцитов в периферической крови пациентов с ИИ на 1, 7 и 21-е сутки пребывания в стационаре и в группе контроля однократно методом проточной цитофлюорометрии (цитофлюориметр Beckman Coulter Epix XL-MCL, Франция) с использованием моноклональных антител CD3/FITC, CD95, Fas/RPE («Dako», Дания). Статистическую обработку данных проводили при помощи программного обеспечения Statistica 6.0. Применяли методы дисперсионного, корреляционного, кластерного анализов. Значимость различия двух выборок (p) определяли при помощи t-критерия Стьюдента.

Результаты

Распределение пациентов на группы с благоприятным и неблагоприятным исходом ИИ

Для распределения пациентов, перенесших ИИ, на группы с учетом функционального восстановления и апоптозиндуцирующих характеристик периферической крови был проведен ретроспективный анализ зависимости тяжести исхода (балл по NIHSS на 21-е сутки) от концентраций sFasL, sFas и их соотношения на 1-е сутки. По его результатам пациентов распределили на 2 группы в зависимости от значений отношений концентраций sFasL и sFas, при этом граничным значением NIHSS на 21-е сутки для этого разделения была выраженность неврологического дефицита, равная 5 баллам. Учитывая, что функциональные ограничения пациента при таком уровне неврологического дефицита (≤5 баллов по NIHSS) слабовыражены или полностью отсутствуют, на основании вышепреведенных результатов было принято решение о выделении в группе исследования двух подгрупп пациентов: с благоприятным исходом ИИ (показатель по NIHSS на 21-е сутки <5 баллов) и с неблагоприятным исходом (показатель по NIHSS на 21-е сутки > 5 баллов) острого периода ИИ (рис. 2).

Рис. 2. Ретроспективный анализ зависимости тяжести исхода ИИ (NIHSS на 21-е сутки) от концентраций sFasL (а), sFas (б) и их отношения (в) на 1-е сутки (кружки — пациенты с благоприятным исходом, треугольники — с неблагоприятным).

Отношение sFasL/sFas на 1-е сутки принимает значения 2,22±0,60 при NIHSS ≤5 баллов на 21-е сутки и не отличается от контрольной группы (2,26±0,33); для пациентов с NIHSS >5 баллов отношение sFasL/sFas принимает значения 3,71±0,60 и отличается (p<0,01) от значений контрольной группы (p<0,01).

Активность растворимого FasL периферической крови и ее клиническая значимость

Характерным паттерном для концентрации sFasL после развития ИИ являлось ее прогредиентное нарастание в течение всего острого периода ИИ независимо от его исхода. При этом в группе пациентов с благоприятным исходом концентрация sFasL была достоверно ниже, чем в группе с неблагоприятным (р<0,01). Концентрация растворимого рецептора Fas также достоверно нарастала, повторяя динамику концентрации sFasL, однако достоверных различий между группами не наблюдали.

Учитывая способность растворимого Fas-рецептора, а также рецептора Fas, расположенного на мембране CD3CD95+лимфоцитов, связывать растворимую форму своего лиганда [19], снижая тем самым активность апоптозиндуцирующей атаки других клеток, в том числе нейрональных, нами был введен интегральный показатель «sFasL-агрессия», отражающий потенциальную способность периферической крови регулировать лиганд-рецепторные соотношения растворимых рецептора и лиганда системы Fas за счет связывания растворимого лиганда с трансмембранным рецептором на поверхности CD3+лимфоцитов периферической крови. Выраженность sFasL-агрессии вычисляли по формуле: отношение концентраций sFasL и sFas к абсолютному содержанию CD3CD95+лимфоцитов. В группе контроля этот показатель был достоверно выше. Между группами пациентов с благоприятным и неблагоприятным исходами на 1-е и 7-е сутки исследования также были выявлены достоверные отличия. При этом значения были большими в группе неблагоприятного исхода (рис. 3). Динамика этого показателя имела следующие закономерности: при благоприятном исходе от 1-х к 7-м суткам не происходило достоверных изменений. В отличие от этого к исходу острого периода происходило достоверное увеличение его значения. При неблагоприятном исходе на 7-е сутки исследования, напротив, приходилось пиковое значение показателя с последующим трендом его уменьшения до уровня 1-х суток.

Рис. 3. Выраженность sFasL-агрессии (отношение концентраций sFasL и sFas к абсолютному содержанию CD3CD95+лимфоцитов) в группах пациентов с благоприятным (обозначены белым) и неблагоприятным (обозначены темным) исходами острого периода ИИ на 1, 7 и 21-е сутки после его развития и в группе контроля (ГК) (л/109).

С уровнем неврологического дефицита в баллах по NIHSS наиболее сильные корреляционные связи были у показателя соотношения концентраций sFasL/sFas во все сроки исследования (p<0,01). Так, на 1-е сутки r=0,662, на 7-е сутки r=0,550, на 21-е сутки r=0,701. Концентрация sFasL также достоверно влияла на выраженность неврологического дефекта в баллах по NIHSS. Так, на 1-е сутки после ИИ коэффициент корреляции r=0,632, p<0,01, на 7-е сутки r=0,693, p<0,01, на 21-е сутки r=0,496, p<0,01. Зависимость между концентрацией sFas в периферической крови и уровнем неврологического дефицита была достоверной только на 1-е и 7-е сутки исследования (r=0,388, p<0,01 и r=0,554, p<0,01 соответственно). От абсолютного количества CD3CD95+лимфоцитов неврологический дефицит зависел на 1-е (r=0,603, p<0,01) и 21-е (r=0,565, p<0,01) сутки исследования. Для показателя активности sFasL отмечена прямая зависимость (r=0,244, p<0,05) на 7-е сутки исследования в общей выборке, при этом в группе с неблагоприятным исходом острого периода ИИ наблюдался обратный тренд на 1-е и 7-е сутки (r=–0,695 и r=–0,638, p<0,01 соответственно).

Закономерности изменения концентрации эффекторов стресс-реализующих систем

При оценке концентрации АКТГ в периферической крови пациентов с ИИ выявлено достоверное ее увеличение во все сроки наблюдения относительно группы контроля (7,91±1,88 пг/мл, р<0,01). В группе исследования на 1-е сутки ее значения 15,60±6,40 пг/мл, на 7-е сутки — 10,93±3,98 пг/мл, на 21-е сутки — 9,20±2,63 пг/мл. Концентрация К в периферической крови пациентов с ИИ также была достоверно повышена во все сроки исследования по сравнению с контрольной группой (246,99±45,68 нмоль/л, р<0,01). На 1-е сутки исследования уровень К в группе исследования был равен 507,90±134,93 нмоль/л, на 7-е сутки — 339,09±84,34 нмоль/л, на 21-е — 368,54±93,03 нмоль/л. Концентрация А в группе контроля составила 62,05±27,66 пг/мл, что достоверно отличалось от группы исследования лишь на 7-е сутки (101,75±27,99 пг/мл, р<0,01). Уровень НА от контрольного значения 126,99±14,51 пг/мл достоверно отличался на 7-е (142,62±43,01 пг/мл) и 21-е (144,18±41,53 пг/мл) сутки исследования (р<0,05). Между группами пациентов с благоприятным и неблагоприятным исходами в концентрации эффекторов стресс-реализующих систем на 1-е сутки исследования были отмечены достоверные различия по всем параметрам. При этом концентрации АКТГ и К были наименьшими, а А и НА — наибольшими в группе благоприятного исхода.

При анализе динамики концентраций были отмечены тенденция к снижению уровня АКТГ и К с течением времени и повышение А и НА. При этом в группе пациентов благоприятного исхода отмечен «провал» концентрации К на 7-е сутки исследования (рис. 4), для А в этот срок были отмечены пиковые значения для всех групп.

Рис. 4. Концентрация К в группах пациентов с благоприятным (обозначены белым) и неблагоприятным (обозначены темным) исходами острого периода ИИ на 1, 7 и 21-е сутки после его развития и в группе контроля (ГК) (пг/мл).

Влияние нейрогуморальных эффекторов стресс-реализующих систем на клинические особенности течения и исход острого периода ИИ

В общей выборке можно было проследить схожие зависимости на 1-е сутки исследования между концентрациями АКТГ, К и баллом по шкале NIHSS: на 1-е сутки соответственно r=0,552, r=0,485 (р<0,01). Из эффекторов симпатоадреналовой системы только концентрация А была связана с достоверным влиянием на уровень неврологического дефицита. При этом в 1-е сутки исследования зависимость была обратной (r=–0,325, p<0,01) в общей выборке и прямой (r=0,452, p<0,01) в группе благоприятного исхода. Значения индекса Бартел и балл по шкале Рэнкина повторяли зависимости от выраженности неврологического дефицита по шкале NIHSS (р<0,01). При поступлении в стационар прослеживалась противоположная зависимость в группах неблагоприятного и благоприятного исходов между концентрацией НА и показателями неврологического дефицита и функционального статуса (от балла по NIHSS r=–0,380 и r=0,317 соответственно, р<0,05).

Концентрация К во все сроки исследования и А на 7-е сутки достоверно прямо коррелировали с выраженностью тревоги, депрессии в баллах по шкале HADS.

Влияние эффекторов стресс-реализующих систем на активность эффекторов системы Fas в остром периоде ИИ

Концентрация АКТГ достоверно коррелировала с концентрацией растворимого рецептора sFas в исходе острого периода ИИ как в общей выборке (r=0,369, р<0,01), так и в группе пациентов с благоприятным исходом (r=0,422, р<0,05); с концентрацией растворимого лиганда FasL только в общей выборке на 1-е (r=0,365, р<0,01) и 7-е (r=0,341, р<0,01) сутки исследования, с соотношением концентраций sFas и FasL в общей выборке и в группе пациентов с неблагоприятным исходом на 1-е (r=0,597, р<0,01 и r=0,343, р<0,05 соответственно) и 7-е (r=0,479, р<0,01 и r=0,451, р<0,01) сутки; с выраженностью sFasL-агрессии на 1-е сутки исследования в группе пациентов с благоприятным исходом (r=–0,582, р<0,01) и на 7-е сутки в общей выборке (r=0,449, р<0,01).

С концентрацией К выявлены достоверные корреляционные связи у следующих показателей: концентрация растворимого sFas на 7-е сутки исследования в общей выборке (r=0,310, р<0,01) и на 21-е сутки в общей выборке и в группе пациентов с благоприятным исходом ИИ (r=–0,280, р<0,05 и r=–0,386, р<0,05 соответственно), концентрация растворимого sFasL на 1-е и 7-е сутки исследования в общей выборке (r=0,335 и r=0,626, р<0,01 соответственно). Соотношение концентраций sFas и FasL тесно коррелировало с концентрацией К в общей выборке во все сроки исследования (r=0,440, r=0,697, р<0,01 и r=0,262, р<0,05 на 1, 7 и 21-е сутки соответственно) и в группе пациентов с неблагоприятным исходом ИИ на 1-е сутки (r=0,279, р<0,05), при этом sFasL-агрессия имела достоверную отрицательную связь с концентрацией К на 1-е сутки исследования в группе пациентов с благоприятным исходом (r=–0,586, р<0,01), а на 7-е сутки только в общей выборке (r=0,655, р<0,01).

Концентрация НА практически не оказывала достоверного влияния на уровень эффекторов системы Fas в периферической крови пациентов после ИИ: достоверные связи выявлены лишь для соотношения концентраций sFas и FasL в общей выборке на 1-е и 21-е сутки исследования (r=–0,178 и r=0,279, р<0,05 соответственно).

С концентрацией А в периферической крови достоверно коррелировали: концентрация sFas в группе пациентов с благоприятным исходом на 1-е сутки (r=0,454, р<0,01) и в группе пациентов с неблагоприятным исходом на 7-е сутки (r=–0,363, р<0,05), концентрация sFasL на 1-й день исследования в общей выборке и в группе пациентов с благоприятным исходом (соответственно r=–0,242, р<0,01 и r=0,357, р<0,05), величина соотношения концентраций sFasL и sFas в общей выборке на 1-е сутки исследования (r= –0,585, р<0,01), показатель sFasL-агрессии на 1-е сутки в общей выборке и группе благоприятного исхода (соответственно r= –0,296, р<0,01 и r= –0,408, р<0,05), на 7-е сутки только в общей выборке (r=0,204, р<0,05).

Обсуждение

При исследовании закономерностей динамики значений отношения концентраций sFasL и sFas была обнаружена парадоксальная тенденция их роста у пациентов из подгруппы благоприятного исхода. Этот тренд повторял и показатель sFasL-агрессии периферической крови: для подгруппы с благоприятным исходом острого периода ИИ на 7-е сутки была характерна тенденция снижения с последующим достоверным увеличением к 21-м суткам на фоне противоположной картины при неблагоприятном исходе. Возможным объяснением этого впервые выявленного в настоящей работе феномена может быть следующее. Учитывая плейотропный эффект апоптоз-индуцирующих факторов [3—7], которые на 7-е сутки исследования оказывали свой апоптоз-индуцирующий эффект в обеих подгруппах исследования, а к 21-м суткам — у пациентов с благоприятным исходом, вероятно, происходило его смещение в сторону инициации адаптивных процессов. Следует отметить, что в группе контроля sFasL-агрессия была достоверно большей, чем в группе исследования, во все сроки, т.е. в группе благоприятного исхода к концу острого периода ИИ ее значение стремилось к контрольным. В связи с этим мы допускаем факт существования регуляторного механизма, который снижает агрессивность апоптоз-индуцирующих стимулов, несмотря на увеличение их концентрации в периферической крови. Одним из исследованных в этой работе его компонентов может быть емкость связывания sFasL периферической крови (отражением которой является показатель sFasL-агрессия), которая, как показывают наши данные, определяется преимущественно величиной популяции CD3CD95+лимфоцитов. Увеличение абсолютного содержания лимфоцитов этой популяции в 1-ю неделю ИИ может быть связано со специфическим иммунным ответом на стимуляцию «забарьерными» мозгоспецифическими антигенами. Классическими фазами этого ответа являются селекция, клональная экспансия, эффекторная и элиминация [20]. Временные интервалы первых трех фаз в среднем составляют от 5 до 7 сут. После пика ответа большинство антигенспецифических Т-клеток элиминируется, что поддерживает гомеостаз Т-клеточной популяции. Гибель периферических Т-клеток в основном вызывается двумя механизмами: «death by neglect», или автономной клеточной смерти, которая связана c возникающей недостаточностью костимулирующих и цитокиновых сигналов (это происходит в основном на ранних этапах активации, до момента индуцированной экспрессии Fas-рецептора) [21]. Далее преобладают механизмы активационно-индуцированной гибели клеток (AICD, от англ. Activation-Induced Cell Death), реализующиеся через активацию апоптоза по внешнему, в основном Fas-зависимому, пути, который обеспечивает понижающую регуляцию иммунного ответа. Относительная важность двух форм гибели Т-клеток не установлена [22]. Интенсивность экспрессии рецепторов Fas способна модулировать различные факторы, в том числе эффекторы стресс-реализующих систем. Так, инкубация иммунокомпетентных клеток in vitro в среде с повышенным содержанием К приводит к увеличению экспрессии CD95 и частоты последующего апоптоза [23]. Мы выявили положительные корреляционные связи между концентрацией К и CD3CD95+лимфоцитов в периферической крови у пациентов в острейшем периоде ИИ в общей выборке. Также в периферической крови и ткани головного мозга присутствуют ферменты, например металлопротеиназы, способные отщеплять надмембранную часть Fas-рецептора, образуя его растворимую форму [24]. В первые дни после ИИ их активность увеличивается [25]. Однако К способен ингибировать их активность [26], влияя таким образом на содержание CD3CD95+лимфоцитов в периферической крови, а также на величину соотношения растворимых Fas рецептора и лиганда, увеличивая их концентрации, однако не изменяя соотношение. Именно поэтому при повышенном уровне К наблюдается увеличение количества CD95+лимфоцитов с последующим их апоптозом и иммуносупрессией. Нами показано, что у пациентов с благоприятным исходом острого периода ИИ пиковая концентрация К в 1-е сутки после ИИ достоверно меньше, чем у пациентов группы неблагоприятного исхода. Последующая динамика также имеет сходные тренды, однако при неблагоприятном исходе ИИ концентрация К была достоверно большей, оставаясь при этом в рамках референтных значений, что исключает клиническую прогностическую значимость данного показателя в индивидуально рассматриваемом случае. Однако нами была выявлена достоверная прямая корреляционная связь между уровнем К и выраженностью тревоги и депрессии по удобной и легкой для применения в клинической практике ориентировочной шкале тревоги и депрессии [17], в которой уровень тревоги и депрессии в баллах пропорционален негативному действию К. Пациенты, у которых отмечен клинически выраженный уровень тревоги и депрессии (на 7-е сутки по шкале HADS уровень депрессии составил 8,50±4,07 и 15,39±3,47, тревоги — 10,08±3,82 и 12,67±2,72 балла соответственно в группах благоприятного и неблагоприятного исходов), а также более высокий балл по опроснику Reeder, имели более высокие концентрации К, показатели Fas-агрессии на 7-е сутки и более низкие — на 21-е сутки исследования, худшие темп восстановления и функциональный исход острого периода ИИ. В настоящее время показано, что в развитии депрессии важную роль играют процессы апоптоза и воспаления. В связи с этим есть основания допускать, что при ИИ в группе неблагоприятного исхода происходит их активация со смещением акцентов, характерных для депрессивного расстройства. На это значимо влияет тип ответа стресс-реализующей системы с преобладанием эффектов К в 1-ю неделю развития ИИ. Поэтому предикторы развития постинсультной депрессии можно рассматривать как прогностические маркеры неблагоприятного исхода острого и последующих периодов ИИ. Таким образом, доминирование в ответе на стрессорное воздействие гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы с преобладанием эффектов К ассоциировано с активацией апоптоз-индуцирующих свойств периферической крови в 1-ю неделю после развития ИИ и их снижением к концу острого периода. Клинически это проявляется повышенным уровнем тревоги и депрессии, а также неблагоприятным исходом острого периода ИИ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.