Сокращения:

5-АЛК — 5-аминолевулиновая кислота

ПП IX — протопорфирин IX

ТМО — твердая мозговая оболочка

В настоящее время наблюдается значительный рост частоты выявления онкологических заболеваний центральной нервной системы [9]. Особую сложность представляет определение границ первичных внутримозговых опухолей, что обусловлено особенностями их инфильтративного роста вдоль миелинизированных нервных волокон и сосудов [10, 22], приводящими к высокой частоте послеоперационных рецидивов. Надежная информация относительно объема резецированной опухоли должна быть получена путем интраоперационной визуализации. Решение этой проблемы реализуется в основном с помощью интраоперационной компьютерной томографии, магнитно-резонансной томографии, УЗИ-сканирования и трехмерной безрамной ультразвуковой нейронавигации, нейронавигационных систем и различных комбинаций этих методов [8, 18, 21].

С учетом того, что возможности использования в операционной магнитно-резонансной томографии ограничены, а интраоперационное ультразвуковое исследование не позволяет получить информацию о метаболических параметрах опухоли, актуальными представляются разработка и совершенствование методов интраоперационной оптической нейровизуализации и лазерной спектроскопии [16, 19, 24, 25]. Использование современных микроскопов и эндоскопов с флуоресцентными фильтрами позволяет проводить лишь качественную оценку видеофлуоресценции, в то время как методы оптической спектроскопии позволяют определять количественную оценку накопления ПП IX в тканях [14].

Клинические исследования показали значительную корреляцию между уровнем накопления ПП IX и скоростью деления клеток [12], что позволяет использовать это вещество в качестве маркера злокачественности опухоли [26]. Однако ввиду того, что в 30% случаев наблюдается лишь незначительное накопление препарата в опухолевых клетках [1, 2, 15], необходимы дополнительные критерии для интраоперационной диагностики исследуемых тканей. К ним относятся показатели светорассеяния, кровенаполнения и оксигенации [20]. Изменения рассеивающих свойств тканей на тканевом уровне обусловлены разрушением структуры миелиновых оболочек проводящих путей в белом веществе головного мозга в процессе роста опухоли, а на клеточном уровне — изменением поверхности и структуры мембран клеток. Кроме того, на светорассеяние оказывает влияние рост числа и размеров клеточных ядер, при одновременном снижении количества митохондрий, обусловленном переходом опухолевых клеток на гликолиз. Кровенаполнение коррелирует с плотностью микрососудов, степенью гипоксии, а также злокачественностью глиом [6, 7, 13].

Таким образом, одновременное определение этих параметров позволяет повысить чувствительность метода, основанного на выявлении концентрации опухолевого маркера (5-АЛК-индуцированного ПП IX). Спектроскопия диффузного отражения основана на анализе спектра излучения, подвергшегося поглощению и рассеянию в ткани, что позволяет определять концентрацию основных поглотителей и рассеивающих элементов на микроуровне [5]. Флуоресцентная спектроскопия и спектроскопия диффузного отражения представляют точные, быстрые и неинвазивные методы исследования метаболических и структурных изменений, происходящих в тканях, а также позволяют по интенсивности флуоресценции опухолевого маркера ПП IX определять его концентрацию в биологической среде непосредственно во время оперативного вмешательства [4].

Похожий подход к спектроскопическому анализу показан в работе других авторов [24]. Однако он подразумевает последовательную регистрацию спектра фонового излучения, двух спектров диффузного рассеяния и спектра флуоресценции. Полное время, требующееся для регистрации данных спектральных зависимостей в каждой точке, около 3 с. К сожалению, измерения, проводимые последовательно, не позволяют достоверно утверждать, что они получены из одной точки в одинаковых условиях. Другим недостатком указанного метода является использование для возбуждения флуоресценции коротковолнового излучения с длиной волны 405 нм (фиолетовый свет), для которого биологическая ткань является средой с низкой прозрачностью, что приводит к проникновению излучения на глубину, не превышающую нескольких микрометров. В связи с этим необходимо предварительное отмывание тканей от крови перед проведением оптического измерения. Эти недостатки усложняют процедуру анализа ткани методом оптической биопсии. Кроме того, в работах P. Valdes [25] метод комбинированной спектроскопии выполнен на небольшой выборке пациентов (n=23) с глиомами Grade I—IV WHO с параллельным морфологическим анализом 133 биоптатов [25].

Цель работы — изучить возможности метода оптической биопсии с помощью комбинированного спектрального анализа в хирургии опухолей головного мозга с использованием оригинального отечественного спектроанализатора с длиной волны возбуждения флуоресценции 632,8 нм, позволяющего проводить параллельную регистрацию количественного накопления ПП IX, светорассеяния тканей, оксигенации и кровенаполнения.

Материал и методы

В исследование включены 90 пациентов (49 мужчин и 41 женщина) в возрасте от 35 лет до 61 года (в среднем 51 год) с опухолями Grade II—IV. Распределение пациентов по гистологическим вариантам опухолей представлено в табл. 1.

Пациентов с опухолями Grade II было 14; Grade III — 13; Grade IV — 63.

После получения информированного согласия пациенты принимали внутрь раствор гидрохлорида 5-АЛК (препарат Аласенс, производитель ФГУП «ГНЦ «НИОПиК», регистрационный номер ЛП-001848 от 21.09.12) в расчете 25 мг на 1 кг массы тела за 2—4 ч до начала удаления опухоли. Пациенты были оперированы с июня 2010 г. по август 2012 г. в НИИ нейрохирургии им. Н.Н. Бурденко РАМН с использованием видеофлуоресцентного анализа и метода комбинированной спектроскопии. С целью оценки визуальной флуоресценции использовались операционный микроскоп Carl Zeiss Pentero (73 наблюдения) и эндоскоп Karl Storz с фильтрами для флуоресцентной диагностики (17), позволяющими провести качественную оценку распределения в тканях 5-АЛК-индуцированного ПП IX. Перед основным этапом операции после вскрытия ТМО осуществлялось спектроскопическое измерение параметров, описанных ниже, для интактной коры.

Индекс флуоресценции вычислялся как отношение интенсивности флуоресценции ПП IX в диапазоне 690—730 нм к интенсивности рассеянного назад лазерного излучения. Флуоресцентный контраст определялся как отношение индекса флуоресценции исследуемой ткани к индексу флуоресценции нормальной коры.

Кровенаполнение и оксигенация вычислялись на основе анализа спектров диффузного отражения в диапазоне 500—600 нм путем разложения спектральной зависимости диффузно отраженного излучения на компоненты, соответствующие спектрам поглощения редуцированного и оксигенированного гемоглобина.

Рассеивающие свойства тканей оценивались как отношение лазерного излучения рассеянного назад исследованной тканью к интенсивности лазерного излучения рассеянного назад интактным мозгом. При этом интенсивность лазерного излучения, рассеянного неизмененным белым веществом, принималась за 1, а интенсивность излучения, рассеянного корой, принималась за 0,5 в соответствии с данными о соотношении их рассеивающих свойств [11].

В ходе операции проводились периодические спектроскопические измерения в процессе удаления опухоли, а также перед этапом гемостаза от ложа с целью контроля радикальности вмешательства. При локализации процесса вблизи функционально важных зон использовался интраоперационный нейрофизиологический мониторинг.

У каждого пациента было взято от 1 до 21 образца ткани для последующего гистологического анализа и сопоставления его результатов с данными спектроскопического исследования. Таким образом, было проанализировано 268 образцов ткани: 216 образцов у пациентов с глиобластомами, 21 — с опухолями Grade III, 31 — с опухолями Grade II (табл. 2).

Для одновременной регистрации спектров диффузного отражения и лазерно-индуцированной флуоресценции была разработана установка, состоящая из спектроанализатора (ЛЭСА-01-БИОСПЕК), двух источников излучения (гелий-неоновый лазер 632,8 нм и галогенная лампа), оптоволоконных средств доставки излучения к ткани и от нее, а также персонального компьютера со специальным программным обеспечением для регистрации и анализа спектров в режиме реального времени. В устройстве используется перекрестная система фильтров, позволяющая реализовать разделение видимого диапазона спектра на две области — регистрации спектра диффузного отражения и спектра флуоресценции ПП IX. При проведении измерений дистальный конец оптоволоконного зонда приближали к ткани до соприкосновения без оказания давления. В результате измерения на вход спектрометра поступает флуоресцентное, а также широкополосное и лазерное излучение, диффузно отраженные тканью. Регистрируемые спектральные зависимости подвергаются в реальном масштабе времени математической обработке в соответствии с алгоритмами, описанными в [4, 5].

Результаты и обсуждение

Дифференциация различных типов глиом головного мозга с помощью спектрального анализа по индексу флуоресценции 5-АЛК-индуцированного ПП IX

Первичный спектроскопический анализ глиом проводился по показателям индекса флуоресценции. Для статистического анализа различий между группами опухолей различной степени использовались параметрические методы. На рис. 1

приведен клинический пример использования метода флуоресцентной диагностики и комбинированной лазерной спектроскопии у пациентки 70 лет с глиомой Grade III в правой лобно-теменно-височной области. Во время операции отмечалась яркая видимая флуоресценция опухоли, выходящей на кору головного мозга.

На рис. 2

приведена диаграмма распределения частоты встречаемости экспериментальных данных с показателями индекса флуоресценции для различных групп опухолей.

При попарном сравнении глиом Grade II—IV WHO между собой по уровню индекса флуоресценции с помощью метода дисперсионного анализа и t-критерия Стьюдента были обнаружены статистически значимые различия между глиомами II и III и II и IV WHO с уровнем значимости не более 1% (р<0,01). Однако не было обнаружено статистически значимых различий между опухолями III и IV степени, что показывает необходимость анализа дополнительного параметра с целью дифференциации этих опухолей при проведении интраоперационной спектроскопии. Группы олигоастроцитом и астроцитом одинаковой степени злокачественности были объединены, так как не было показано зависимости индекса флуоресценции от наличия в опухоли олигокомпонента (табл. 3).

В связи с тем, что распределение данных по индексу флуоресценции несимметрично, для его описания использовались такие критерии, как медиана (значение признака, делящее вариационный ряд выборки на две равные части: 50% «нижних» единиц ряда имеют значение признака не больше, чем медиана, а «верхние» 50% — значения признака не меньше, чем медиана), а также первый и третий квартили.

Дифференциация различных типов глиом головного мозга с помощью спектрального анализа по светорассеянию

Сравнение глиом с различной гистологической структурой по уровню рассеяния проводилось по тому же алгоритму. Распределение данных (рис. 3)

для опухолей Grade II по уровню светорассеяния характеризовалось двумя максимумами, один из которых соответствовал уровню около 0,6 (относительно интактного мозга), а второй — 0,9, приближаясь к норме. Это привело к необходимости разделения объединенной группы глиом II степени на две группы по уровню рассеяния для проведения дальнейшего анализа. При этом не было обнаружено статистически значимых влияний на уровень светорассеяния, обусловленных наличием олигокомпонента в структуре глиомы (р<0,05).

При сравнении глиом II—IV степени между собой по рассеивающим свойствам были обнаружены статистически значимые различия (р<0,05) в показателях светорассеяния между указанными группами (табл. 4).

Однако в ходе дальнейшего анализа было выявлено отсутствие различий по уровню светорассеяния у 6 из 23 образцов тканей опухолей Grade II с низким светорассеянием и группой глиом Grade III. Это позволяет сделать вывод о неоднородной структуре доброкачественных глиом, т.е. показатели светорассеяния у этой части опухолей имеют сходство с аналогичными величинами глиом Grade III.

Дифференциация различных типов глиом головного мозга с помощью спектрального анализа по уровню кровенаполнения и оксигенации

Для повышения точности дифференциации тканей в дополнение к описанным выше признакам использовалась группа параметров, таких как содержание гемоглобина в тканях, именуемое в дальнейшем кровенаполнением, и степень сатурации гемоглобина кислородом. Распределение значений параметров оксигенации и кровенаполнения у пациентов с глиомами Grade II—IV приведено в табл. 5.

Малый объем выборки глиом Grade II—III с использованием интраоперационного определения параметров оксигенации и кровенаполнения не позволяет делать статистически значимых выводов о различиях между данными группами. Необходимо проведение дальнейших исследований.

При анализе как степени оксигенации, так и кровенаполнения тканей в различных участках опухоли у пациентов с глиобластомами с помощью U-критерия Манна—Уитни были обнаружены статистически достоверные различия с уровнем значимости 5% (р<0,05) между группами данных, относящихся к зоне некроза и активной части опухоли (табл. 6).

В современной клинической практике активно используются различные методы интраоперационной нейровизуализации, одним из которых является флуоресцентная метаболическая навигация с использованием в качестве опухолевого маркера 5-АЛК-индуцированного ПП IX. Однако у части пациентов с глиомами головного мозга ПП IX накапливается в незначительной концентрации, недостаточной для индукции видимой флуоресценции [1, 2, 16]. Важным представляется также идентификация анапластических участков глиом [1, 2, 17].

В связи с этим для количественной оценки накопления ПП IX используется метод лазерной спектроскопии [1—3, 15, 17, 23—25]. Для всех типов астроцитарных опухолей спектральный анализ показал повышение уровня флуоресценции 5-АЛК-индуцированного ПП IX, зависящее от величины Grade опухоли. Однако индексы флуоресценции глиом Grade III и IV статистически не различаются между собой. В связи с этим актуальным представляется применение дополнительных опций комбинированной спектроскопии, включающих анализ светорассеяния тканей, оксигенации и кровенаполнения с параллельной количественной оценкой накопления ПП IX.

В отличие от данных P. Valdes [24, 25], проводившего комбинированную спектроскопию у пациентов с глиомами головного мозга на небольшом объеме выборки (23 пациента), нами метод использован у 90 пациентов. Кроме того, применение отечественного оригинального спектроанализатора ЛЭСА-01-БИОСПЕК позволило выполнять параллельные в отличие от P. Valdes измерения уровня флуоресценции, светорассеяния, оксигенации и кровенаполнения. В работе P. Valdes измерения спектров диффузного рассеяния и флуоресценции проводились последовательно. Это не позволяет достоверно утверждать, что спектры получены из одной точки в одинаковых условиях. В отличие от P. Valdes, использовавшего для возбуждения флуоресценции фиолетовый лазер с длиной волны 405 нм, нами был использован красный лазер с длиной волны 632,8 нм, свет которого значительно лучше проникает в ткань в условиях наличия в ней крови.

При анализе показателей светорассеяния между глиомами Grade III—IV WHO были выявлены статистически значимые различия. Также интересными представляются данные о различии показателей светорассеяния между подгруппами глиом Grade II. Близкие по значению уровни светорассеяния были получены у пациентов с глиомами Grade III, что указывает на гетерогенность доброкачественных глиом по клеточной и тканевой структурам. Различия в светорассеянии интактных и патологических тканей обусловлены неоднородностью структур мембран, изменением количества митохондрий и размеров ядер в клетках опухоли.

При оценке оксигенации и кровенаполнения у пациентов с глиобластомами выявлено различие данных показателей между зонами некроза и активного роста опухоли. Таким образом, предварительный анализ данных показал, что применение комбинированной спектроскопии позволяет повысить диагностическую ценность метода лазерной спектроскопии и существенно расширить его возможности, проводя интраоперационную морфологическую оценку структуры тканей. Это дает основание использовать термин «оптическая биопсия» в ходе проведения исследования.

Приведенные выше данные позволяют составить общую картину спектроскопических характеристик и соответствующих им физиологических изменений для различных видов глиальных опухолей, однако наиболее интересным приложением данного метода в нейрохирургии является интраоперационная демаркация границ глиом. Для оценки влияния комбинированной спектроскопии на радикальность удаления опухоли необходимо проведение дальнейших исследований с оценкой данных послеоперационной магнитно-резонансной томографии.

Заключение

Предложенный метод оптической биопсии, заключающийся в проведении спектрального анализа концентрации гемоглобина в оксигенированной и редуцированной формах, опухолевого маркера (5-АЛК-индуцированного ПП IX), а также изменения рассеивающих свойств исследуемых тканей показал возможность дифференциации различных подтипов глиальных опухолей, сходных по степени проявления флуоресценции ПП IX, но различающихся по другим параметрам. Приведенные результаты классификации спектроскопических данных в сопоставлении с морфологическим анализом показали возможность интраоперационной идентификации различных участков опухоли у пациентов с глиобластомами. Это позволяет провести быструю оптическую интраоперационную диагностику и детекцию фокусов глиомы с высокой пролиферативной активностью, а также, возможно, оценить радикальность удаления опухоли. Метод оптической биопсии с комбинированным биоспектральным анализом обеспечивает повышение достоверности измерений, увеличение скорости получения информации, увеличение глубины зондирования и упрощение процесса регистрации спектров in vivo.

Комментарий

В статье А.А. Потапова и соавт. «Интраоперационная комбинированная спектроскопия (оптическая биопсия) глиом головного мозга» представлены данные об использовании метода комбинированной лазерной спектроскопии в хирургии глиом головного мозга. Клинические исследования показали высокую эффективность применения 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК) для интраоперационной флуоресцентной диагностики при различных опухолях головного мозга. Однако у части пациентов отмечается отсутствие эффекта видимой флуоресценции или сходные показатели накопления протопорфирина IX в разных подгруппах глиом. Частично это ограничение метода может быть преодолено внедрением в процесс фотодинамической детекции количественной лазерной спектроскопии по протопорфирину IX. Для расширения ее возможностей используется параллельный анализ дополнительных параметров спектрального исследования: концентрации гемоглобина в оксигенированной и редуцированной формах, а также рассеивающих свойств тканей. Авторами приведены особенности исследуемых спектральных характеристик для различных видов глиом головного мозга.

В целом статья А.А. Потапова и соавт. является актуальной и востребованной для клинического применения в нейроонкологии и направлена на решение фундаментальных проблем интраоперационной нейронавигации в хирургии данной группы опухолей.

О.Н. Древаль (Москва)