Глиобластома - высокозлокачественная опухоль головного мозга с преимущественно астроцитарной дифференцировкой, поражающая в основном взрослых людей с пиком заболеваемости между 45 и 75 годами [14].
В геноме глиобластом выявляются множественные нарушения: амплификации генов EGFR, PDGFRA, MDM2, CDK4 и CDK6, гомозиготная делеция гена CDKN2A и делеция гена PTEN, мутация гена ТР53 - большинство из этих аберрантных генов вовлечены в процессы регуляции клеточного цикла, пролиферации, инвазии и миграции клеток [16, 22]. В патогенезе глиобластом также участвует множество взаимодействующих между собой сигнальных путей, основными из которых являются: EGFR/RAS /NF1/PTEN/ PI3K; TP53/MDM2 /MDM4/ p14ARF и p16INK4a/ CDK4 /RB1 [18].
Глиобластомы у детей не являются столь частыми и составляют около 15% всех опухолей головного мозга [1, 3]. Вероятно, это было одной из причин, по которой долгое время глиобластомы у детей и взрослых рассматривались совместно. И действительно, гистологически ничем не отличающиеся друг от друга опухоли у детей и взрослых имеют одинаково неблагоприятный прогноз. Основное различие заключается в патогенезе этих опухолей: структура выявляемых цитогенетических аберраций, таких как амплификации онкогенов MYC, MYCN, EGFR и PDGRFA, гомозиготная делеция гена CDKN2A и делеция гена PTEN, существенно различается в глиобластомах у пациентов данных возрастных групп, что говорит о вовлечении различных молекулярных путей в развитии этих опухолей у детей и взрослых [3, 15, 17, 21].
Определенную роль в развитии глиобластом играют эпигенетические события: метилирование ДНК, посттрансляционная модификация гистонов и посттранскрипционная регуляция генной экспрессии микроРНК [6, 8].
Поворотным моментом в исследовании генома глиобластом и формировании молекулярной классификации явилось открытие мутаций генов IDH1 [20] и H3F3A [23].
Изоцитратдегидрогеназа (isocitrate dehydrogenase, IDH) - фермент, катализирующий окислительное декарбоксилирование изоцитрата, в результате реакции образуются α-кетоглуторат и СО2. Ген IDH1 расположен на длинном плече хромосомы 2q33.3 и кодирует NADP+ специфичный IDH. Точковые мутации гена IDH1 в кодоне 132, возникающие в глиобластомах, являются гетерозиготными и соматическими и характеризуются заменой пары оснований гуанина на аденин в результате замены аминокислоты аргинина в позиции 132 на гистидин (R132H) [2]. Глиобластомы с мутацией гена IDH1 имеют более благоприятные показатели общей выживаемости [7, 10].
Гетерозиготные мутации гена H3F3A описаны в глиобластомах у детей, в том числе с нашим участием [23], в двух вариантах: замена лизина на метионин (K27M) и глицина на аргинин или валин (G34R/V). Обе мутации возникают в позиции, близкой к концевой N-терминали, которая подвергается важным посттрансляционным изменениям, связанным либо с подавлением (K27), либо с активацией (K36) процесса транскрипции. Мутации гена H3F3A патогномоничны для глиобластом, и по данным E. Je и соавт. [11], исследовавшим 1351 опухоль, не встречаются более ни в какой другой опухоли, включая злокачественные менингиомы, саркомы и карциномы различной локализации.
Цель настоящего исследования - проведение сравнительного анализа молекулярно-генетических особенностей глиобластом у детей и взрослых.
Материал и методы
После получения информированного согласия в исследование были включены 125 пациентов с глиобластомами: 48 - в возрасте от 2 до 18 лет (серия «Детские глиобластомы») и 77 - в возрасте от 19 до 53 лет (серия «Взрослые глиобластомы»). Всем пациентам проведено хирургическое удаление опухоли с гистологической верификацией, лучевое лечение (для пациентов старше 3 лет) и химиотерапия, согласно принятым в ФГБУ «НИИ нейрохирургии» РАМН и в ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии» протоколам. Все 77 взрослых пациентов с глиобластомами были оперированы в ФГБУ «НИИ нейрохирургии» РАМН в период с 2002 по 2008 г. Детская серия включала больных, оперированных в ФГБУ «НИИ нейрохирургии» РАМН и в нескольких мировых центрах, любезно предоставивших замороженную ткань опухоли для генетического исследования в German Cancer Research Center in the Helmholtz Association (DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum in der Helmholtz-Gemeinschaft), Heidelberg, Германия, в рамках проекта «Детские глиобластомы». Сведения об этих пациентах взяты из базы данных DKFZ и находятся в открытом доступе на TCGA website https://tcga-data.nci.nih.gov.
У всех пациентов, включенных в данное исследование, во время хирургического удаления фрагменты опухолевой ткани были немедленно заморожены в жидком азоте и впоследствии хранились в жидком азоте или при –80 °С. Наличие замороженной опухолевой ткани позволило провести сравнительную геномную гибридизацию для изучения цитогенетических хромосомных аберраций, а также выполнить прямое секвенирование для определения мутаций генов IDH1, TP53 и H3F3A.
Сравнительная геномная гибридизация (проведена в условиях DKFZ)
Аrray-CGH проведена для 125 глиобластом (48 детских опухолей и 77 глиобластом взрослых), согласно протоколу, принятому в DKFZ [25].
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и выявление мутаций генов IDH1, TP53 и H3F3A методом прямого секвенирования (проведены в условиях DKFZ)
ПЦР и секвенирование генов проведены для 125 глиобластом, как описано ранее [2, 4].
Флуоресцентная гибридизация in situ (проведена в условиях двух центров: ФГБУ «НИИ нейрохирургии» РАМН и DKFZ)
Использованы пробы к следующим онкогенам и хромосомным локусам: MYCN (2p24), PDGFRA (4q12), EGFR (7p12), CDK6 (7q21.2), MYC (8q24.12-q24.13), CDKN2A (9p21), PTEN (10q23), CDK4 (12q14.1) и IRS2 (13q34).
Иммуногистохимическое исследование (проведено в условиях ФГБУ «НИИ нейрохирургии» РАМН)
Иммуногистохимическое исследование было проведено на полуавтоматическом иммуностейнере Lab Vision Autostainer 360 ThermoScientific с антителом: Anti-Human IDH1 R132H astrocytoma and oligodendroglioma tumor cell marker mouse monoclonal antibody (Dianova clone: H09 разведение 1:20) [4, 5].
Статистический метод
Для анализа общей выживаемости был использован метод Каплана-Майера. Общая выживаемость была подсчитана от даты установления диагноза до даты смерти (цензор) от прогрессии основного заболевания (пациенты, умершие по другим причинам, не включались в исследование) или до даты сбора последних катамнестических данных.
Результаты
Диагноз «Глиобластома WHO Grade IV» был поставлен на основании критериев, принятых в текущей классификации ВОЗ опухолей ЦНС [14].
При микроскопическом анализе биопсийного материала глиобластом у детей и взрослых была выявлена идентичная гистологическая картина злокачественной астроцитомы с наличием выраженной ядерной атипии, клеточного полиморфизма, высокой митотической активности, тромбозов сосудов, микроваскулярной пролиферации и некрозов с псевдопалисадными структурами.
Цитогенетические аберрации в глиобластомах
Исследование цитогенетических аберраций методом сравнительной геномной гибридизации показало, что большинство опухолей и у детей, и у взрослых имеют множественные нарушения в геноме. В нашей серии мы наблюдали только у 3 детей глиобластомы без каких-либо цитогенетических аберраций; среди глиобластом у взрослых случаев со сбалансированным профилем без наличия добавок и/или делеций хромосом не было.
Среди амплификаций (увеличение количества копий гена) наиболее часто встречались следующие: амплификации генов MYCN, EGFR, CDK4 и PDFRA. Следует отметить, что амплификация гена MYCN наблюдалась в 12% опухолей у детей и в 4% - у взрослых; амплификация гена EGFR соответственно - в 12 и 29%; амплификация гена CDK4 - в 6 и 18%; амплификация гена PDFRA - в 10 и 5%; амплификация гена MYC - в 6 и 2%; амплификация гена CDK6 - в 6 и 7%; амплификация гена MDM2 - в 2 и 6%; амплификация гена MDM4 - в 2 и 8%.
Таким образом, в детской серии преобладали амплификации генов MYC/MYCN и PDGFRA, в то время как глиобластомы у взрослых чаще демонстрировали амплификации генов EGFR и CDK4.
Гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q наблюдались в обеих возрастных сериях приблизительно в равных пропорциях: гомозиготную делецию гена CDKN2A имели 17% глиобластом у детей и 29% - у взрослых, а потеря хромосомы 10q была выявлена соответственно в 54 и 60% глиобластом.
Основные цитогенетические аберрации в глиобластомах, выявленные методом сравнительной геномной гибридизации и подтвержденные флуоресцентной гибридизацией in situ, показаны на рис. 1-8.
Анализ мутаций генов IDH1, TP53 и H3F3A
Методом прямого секвенирования генов была выявлена мутация гена IDH1 (R132H) в 29 (38%) глиобластомах у взрослых и в 4 (8%) - у детей (рис. 9, 10); мутация гена ТР53 - соответственно в 33 (43%) и 24 (50%); мутация гена Н3F3A - в 17 (35%) и в 1 (1%).
Иммуногистохимическое выявление мутантного протеина IDH1
Данный метод исследования использовался для выявления мутантного протеина IDH1 R132H паралелльно с секвенированием генов. Выраженная цитоплазматическая экспрессия IDH1 (рис. 15) выявлена в 29 (38%) глиобластомах у взрослых и в 4 (8%) у детей - идентично случаям с мутацией гена IDH1, выявленной методом прямого секвенирования.
Подгруппы глиобластом
Исследованная серия глиобластом была разделена на три подгруппы в соответствии с возрастом больного, наличием или отсутствием мутации генов IDH1 и H3F3A, которые расцениваются как ключевые в патогенезе глиобластом. Выявленные хромосомные аберрации и мутации генов распределились по данным трем подгруппам следующим образом (рис. 16).
Амплификации генов MYC/MYCN выявлялись в подгруппе глиобластом у детей и взрослых с мутацией IDH1 приблизительно в равных значениях: 19 и 17% соответственно, в то время как в подгруппе глиобластом у взрослых больных с отсутствием мутации гена IDH1 амплификации генов MYC/MYCN составили лишь 4%.
Амплификация гена EGFR являлась отличительной особенностью глиобластом у взрослых с отсутствием мутации гена IDH1, в данной подгруппе эта цитогенетическая аберрация наблюдалась в 42% случаев, в то время как в детской серии глиобластомы показывали амплификацию гена EGFR в 12% наблюдений, а в серии взрослых больных глиобластомы с мутацией гена IDH1 встречались лишь в 6%.
Амплификация гена CDK4 была выявлена преимущественно в глиобластомах у взрослых, независимо от наличия или отсутствия мутации гена IDH1.
Гомозиготная делеция гена CDKN2A и потеря хромосомы 10q наблюдались во всех трех подгруппах глиобластом, с незначительным превалированием в подгруппе опухолей у взрослых.
Мутация гена ТР53 наблюдалась в подгруппе глиобластом у взрослых с мутацией гена IDH1 и в подгруппе глиобластом у детей.
Далее мы оценили общую выживаемость больных с глиобластомами в трех вышеуказанных подгруппах (рис. 17).
Анализ общей выживаемости достоверно показал, что глиобластомы у взрослых больных с мутацией гена IDH1 являются наиболее прогностически благоприятной подгруппой, 5-летняя общая выживаемость больных в данной подгруппе составила приблизительно 80%. Достоверной разницы между показателями общей выживаемости у детей с глиобластомами и у взрослых пациентов с отсутствием мутации гена IDH1 не выявлено. Пятилетняя общая выживаемость в данных подгруппах составила приблизительно 8 и 0% соответственно.
Молекулярная классификация глиобластом
Исходя из результатов, полученных нами при цитогенетическом, мутационном и метиляционном [24] анализе, а также оценке показателей общей выживаемости при глиобластомах у детей и взрослых, мы разработали молекулярную классификацию глиобластом (рис. 18), выделив три основные подгруппы.
Обсуждение
В настоящей работе мы исследовали молекулярные особенности смешанной серии глиобластом у детей и взрослых; анализ молекулярной структуры глиобластом в двух возрастных группах позволил нам разработать молекулярную классификацию глиобластом, выделив три основные подгруппы: детские глиобластомы, глиобластомы у взрослых с мутацией гена IDH1 и глиобластомы у взрослых без мутации гена IDH1.
Основными особенностями глиобластом в детском возрасте являлись: мутация гена H3F3A - в 40% опухолей, мутация гена ТР53 - в 50% случаев и гипометилированный генотип. Впервые описанная в 2012 г. [23] мутация гена H3F3A, который кодирует гистон Н3.3, относится к эпигенетическим событиям и связана с процессом посттрансляционной модификации гистонов.
У эукариотических клеток основной структурой ядра является хроматин - комплекс ДНК и гистоновых белков. Гистоны модифицируются посттрансляционно, в этом случае может повреждаться их взаимодействие с ДНК и протеинами ядра. Модификации гистонов составляют так называемый «гистоновый код», который и определяет статус структуры хроматина, а также регулирует виртуально все процессы, действующие или зависящие от ДНК, включая репликацию и репарацию, регуляцию экспрессии генов и сохранность центромер и теломер [23]. Модификации гистонов обычно затрагивают область N-терминали и включают метилирование, ацетилирование и фосфорилирование [6].
Мутация гена ТР53 четко коррелировала с мутацией гена IDH1 и в подгруппе глиобластом у взрослых больных не старше 55 лет, в данной подгруппе мутация гена ТР53 была выявлена в 80% случаев. Подгруппа глиобластом у взрослых с мутацией гена IDH1 имела гиперметилированный генотип и являлась прогностически наиболее благоприятной по сравнению с двумя другими подгруппами глиобластом, 5-летняя общая выживаемость составила в ней 80%.
Что касается мутации гена IDH1 в детской серии глиобластом, то нам удалось выявить ее у 4 детей в возрасте от 11 до 17 лет, в отличие от данных M. Antonelli и соавт. [1], которые не обнаружили ни одного случая мутации гена IDH1 в серии из 22 детских глиобластом. В нашем исследовании во всех 4 случаях мутация гена IDH1 в опухолях у детей сочеталась с мутацией гена ТР53.
Характерными особенностями глиобластом у взрослых больных с отсутствием мутации гена IDH1 являлись: высокая частота встречаемости цитогенетических аберраций, в особенности амплификации гена EGFR, обнаруженной в данной подгруппе в 40% случаев, невысокий по сравнению с двумя другими подгруппами процент выявленной мутации гена ТР53 (около 20%) и нормометилированный генотип.
При сравнении молекулярно-генетических особенностей в трех вышеуказанных подгруппах выявлено, что для формирования глиобластомы в подгруппе детских глиобластом и подгруппе опухолей у взрослых с мутацией гена IDH1 необходима комбинация из двух мутаций генов H3F3A и TP53 (для глиобластом у детей) и сочетание мутаций генов IDH1 и TP53 (для глиобластом у взрослых). Как известно, мутация гена ТР53 играет ключевую роль в развитии вторичных глиобластом [14, 18], также мутация гена ТР53 обнаруживается и в первичных глиобластомах, где не превышает 30% [18]. Мутации гена IDH1 являются более ранним событием в патогенезе глиобластом, чем мутации гена ТР53 [19].
Вероятно, глиобластомы у детей и взрослых больных с мутацией гена IDH1 относятся к вторичным опухолям и происходят из предшествующих глиом низкой степени злокачественности, в то время как глиобластомы у взрослых с отсутствием мутации гена IDH1 являются первичными быстроразвивающимися de novo глиобластомами с катастрофически неблагоприятным прогнозом.
В нашем исследовании было показано, что при глиобластомах у взрослых людей не старше 55 лет (так называемые «глиобластомы у людей молодого возраста») с мутацией гена IDH1 имеют место более благоприятные показатели общей выживаемости. О «долгожителях» среди больных с глиобластомами известно давно - причем возраст моложе 50 лет считался основным прогностически благоприятным фактором. A. Korshunov и соавт. [13] еще в 2005 г. выделили глиобластому у молодых в отдельную подгруппу с отличительными молекулярными особенностями. Последовавшее в 2008 г. открытие D. Parsons и соавт. [20] в глиобластомах у больных этой возрастной группы гетерозиготной точковой мутации гена IDH1 посредством использования технологии Next-Generation Sequencing и базы данных, включающей 23,219 транскриптов от 20,661 гена, явилось поворотным моментом в исследовании генетических поломок в глиомах. Открытие мутации гена IDH1 позволило по-новому объяснить предложенную A. Korshunov и соавт. [12] в 2006 г. молекулярную классификацию глиобластом, выделяющую две прогностически различные подгруппы глиобластом, а выявленный гиперметилированный генотип глиобластом у взрослых с мутацией гена IDH1 [24] позволяет понять, почему опухоли данной подгруппы в отличие от глиобластом у детей и взрослых с отсутствием мутации гена IDH1 чувствительны к лучевой терапии и химиотерапии алкилирующими агентами, в том числе Темозоломидом.
Для определения мутации гена IDH1 и выявления прогностически наиболее благоприятного подтипа глиобластом в рутинной практике любого патологоанатомического отделения возможно использование простого в применении иммуногистохимического исследования, результаты которого в 100% случаев совпадают с прямым секвенированием генов и анализом с использованием Illumina 450k метиляционного аррея. Выявление мутации гена IDH1 (или мутантного протеина IDH1, если речь идет о рекомендуемом нами иммуногистохимическом исследовании) в глиобластомах у взрослых представляется особенно важным не только из-за чувствительности опухоли к химио- и лучевой терапии, но и по причине возможной таргетной терапии ингибиторами AGI-5198 и AGI-6780, действующими на R132H IDH1 и R140Q IDH2 соответственно [9].
Как показано в настоящей работе, глиобластомы у детей представляют собой достаточно привлекательную для дальнейшего исследования гетерогенную группу; среди детей с глиобластомами, несмотря на низкие показатели 5-летней общей выживаемости, встречаются отдельные «долгожители». В будущем мы планируем провести анализ мутации гена Н3F3A методом прямого секвенирования на большей группе детских глиобластом, сравнить возможные выявленные мутации K27M и G34R/V с локализацией опухоли и определить прогностическое значение каждого типа мутации.
Выводы
Глиобластомы у детей и взрослых при всей схожести гистологической картины, с некоторыми различиями по частоте выявленных цитогенетических аберраций (в детской серии преобладали амплификации генов MYC, MYCN и PDGFRA, в то время как глиобластомы у взрослых чаще демонстрировали амплификации генов EGFR и CDK4, гомозиготную делецию гена CDKN2A и делецию хромосомы 10q) представляют собой гетерогенную группу опухолей, в которой на основе анализа мутационного статуса можно выделить как минимум три различные подгруппы: глиобластомы у детей, глиобластомы у взрослых с мутацией гена IDH1 (прогностически наиболее благоприятный подтип) и глиобластомы у взрослых с отсутствием мутации гена IDH1.
Благодарность
Авторы сердечно благодарят сотрудницу отделения патологической анатомии ФГБУ «НИИ нейрохирургии» РАМН И.В. Шибаеву за оказанную помощь в обработке клинических данных и Prof. Dr. Stefan M. Pfister (Division of Pediatric Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), Heidelberg, Germany) за приглашение участвовать в проекте «Pediatric Glioblastomas» и любезно предоставленную возможность исследовать генетические особенности глиобластом у взрослых на базе DKFZ. Также авторы выражают признательность благотворительному фонду помощи детям с онкогематологическими и иными тяжелыми заболеваниями «Подари Жизнь» за содействие в проведении данного исследования, а также за неоценимую помощь и поддержку, которую фонд оказывает детям с опухолями головного мозга и их семьям.
Комментарий
Исследование генетических повреждений в глиобластомах очень важно, так как в конечном итоге может привести к выяснению гистогенеза опухолей, опухолевой прогрессии и в результате к разработке более эффективных методов лечения. Все это делает представленную работу крайне актуальной. Особую актуальность работе придает сравнительная характеристика генетических аберраций глиобластом у детей и взрослых, потому что под одним названием объединены, по всей вероятности, генетически различные опухоли. К сожалению, в работе не указаны возрастные группы обследованных детей. По моему мнению, необходимо указать значение изменений регуляторных генов в развитии опухоли и ее клинической и гистологической характеристике. Исследование выполнено на хорошем методическом уровне. Очень интересны данные по полному совпадению иммуногистохимического и генетического исследований. Хорошо представлено обсуждение полученных результатов и даже предлагается молекулярная классификация глиобластом (я бы не рискнул это делать, так как классификация не основывается только на одном методе исследования, особенно при гетерогенности полученных результатов и относительно небольшом материале).
А.Г. Талалаев (Москва)