Материал и методы

Все экспериментальные манипуляции на крысах проводились в соответствии с требованиями GLP и принципами биоэтики. Моделирование экспериментальной глиомы С6 было выполнено на беспородных крысах общей массой 250 г. Животным была проведена имплантация в стриатум правого полушария головного мозга предварительно культивированных глиомных клеток линии С6 в количестве 400×10³.

Для интраоперационной диагностики в эксперименте использовалась установка лазерная электронно-спектральная ЛЭСА-01-БИОСПЕК, позволяющая локально определять степень накопления фотосенсибилизатора в ткани любых органов, доступных для волоконно-оптического зонда. Установка состоит из лазерного источника для возбуждения фотосенсибилизатора и миниатюрного универсального спектрометра для регистрации и анализа флуоресцентного сигнала. Система комплектуется настольным персональным компьютером или ноутбуком.

В качестве источника излучения, возбуждающего флуоресценцию ПП IX в ткани головного мозга крысы, использовался твердотельный лазер с длиной волны 532±2 нм (ЗАО «БИОСПЕК»). Для регистрации флуоресценции ПП IX и Alexa 488 использовался твердотельный лазер с длиной волны 473±2 нм (ЗАО «БИОСПЕК»). Для регистрации флуоресцентных пиков Alexa 660 - лазер с длиной волны 638±2 нм (ЗАО «БИОСПЕК») с мощностью до 50 мВт/см².

Для одновременного возбуждения флуоресценции ПП IX и Alexa 488 использовались лазерные источники с длиной волны 405±2 и 473±2 нм (ЗАО «БИОСПЕК»).

В качестве источника излучения, возбуждающего флуоресценцию ПП IX в ткани головного мозга крысы, использовался твердотельный лазер с длиной волны 532±2 нм (ЗАО «БИОСПЕК»). Для регистрации флуоресцентных пиков Alexa 660 - лазер с длиной волны 638±2 нм (ЗАО «БИОСПЕК»). При регистрации спектров флуоресценции при одновременном возбуждении коротковолновыми источниками (405 и 473 нм) лазерное излучение на входе в спектрометр ослаблялось посредством фильтра КС-18. При регистрации спектров флуоресценции, индуцированных лазером с длиной волны 532 нм, на входе в спектрометр устанавливался фильтр ОС-13. При использовании для возбуждения флуоресценции лазерного источника с длиной волны 638 нм лазерное излучение ослаблялось с помощью установки на входе в спектрометр фильтра КС-18.

Для получения спектров диффузного отражения от исследуемых тканей использовалась галогенная лампа, излучение которой подавалось к объекту по отдельному каналу оптоволоконного зонда. Результирующие спектры флуоресценции подвергались обработке и анализу с учетом спектров обратного диффузного отражения широкополосного излучения, снятых в той же точке.

Для оценки накопления ПП IX в глиоме в качестве индуктора флуоресценции использовался коммерческий препарат Аласенс (действующее вещество 5-АЛК, предшественник ПП IX). С целью детекции накопления антител к ассоциированным с опухолью антигенам в глиоме и периглиомной зоне применили экспериментальные флуоресцентные метки Alexa 660 и Alexa 488 и производное Фталосенса, модифицированного остатками аминокислоты - лизин.

Раствор препарата Аласенс на физиологическом буфере (из расчета 1,5 г на 70 кг массы тела) вводили в вену немедленно после приготовления за 2 ч до начала эксперимента. Препараты MAbE2Cx43 в исходной концентрации 2 мг/мл ковалентно связывали с флуоресцентными метками посредством сукцинимидного эфира, отделяли от несвязавшихся компонентов методом фильтрации в геле и в количестве 1 мг вводили крысам за 24 ч до эксперимента.

Для конъюгации МАbЕ2Сх43 с производным фталосенса проводили реакцию ацилирования свободных аминогрупп остатков лизина остатком уксусной кислоты. Присоединение произвольного фталосенса к антителам проводили в диметилсульфоксиде с добавлением раствора дициклогексилкарбодимида и N-оксисукцинимида при охлаждении до +4 °С в течение 24 ч. Затем реакционную смесь центрифугировали, осадок отбрасывали, супернатант наносили на колонку с Сефадексом G-50 в 0,05 М фосфатно-солевом буфере PBS (pH 6,0).

Экспериментальные препараты вводили крысам с 12-дневной глиомой в бедренную вену под общей анестезией (внутрибрюшинное введение кетамина с премедикацией седуксеном из расчета 10 мг на 1 кг массы тела).

Доступ к головному мозгу крыс для регистрации флуоресцентных сигналов выполняли методом резекционной трепанации черепа в лобно-теменных областях с обеих сторон. Обязательным условием проведения эксперимента являлось сохранение венозного синуса и предупреждение кровотечения. Спектральный анализ флуоресценции с помощью ЛЭСА-01-БИОСПЕК выполняли в два этапа.

На первом этапе эксперимента флуоресценцию регистрировали в условиях in vivo. Крысу с глиомой после введения экспериментальных препаратов погружали в наркотический сон и закрепляли на стереотаксическом столе. После удаления костного лоскута с теменной области спектральный анализ проводили с noверхности коры головного мозга (с поверхности опухоли, периглиомной зоны и контралатерального полушария). По очереди исследовали спектры флуоресцентной активности ПП IX, Alexa 488, Alexa 660. Затем регистрировали активность флуоресценции каждого агента при погружении спектрометрического зонда в глубь глиомы (рис. 1).

На втором этапе крысу подвергали наркозу, декапитировали, извлекали головной мозг, промывали физиологическим буфером и анализировали спектр флуоресценции ex vivo (рис. 2).

Для микроскопических исследований из каждой группы после введения экспериментального препарата отбирали по одной крысе. Животное подвергалось перфузии 4% раствором параформальдегида для получения образцов тканей головного мозга с глиомой. Из головного мозга крыс на вибротоме готовили толстые срезы мозга толщиной 200 мкм (Microm HM 650 V, Thermo Scientific). Накопление и распределение в головном мозге крыс после введения препарата Аласенс и/или MAbE2Cx43 оценивали по флуоресцентному сигналу от ПП IX, Alexa 488 или производного фталосенса при возбуждении источником лазера в диапазоне 600-700 нм лазерного сканирующего микроскопа («Nicon», Япония).

Результаты

Полученные результаты по объективной оценке применения антител в интраоперационной диагностике опухоли и ее границ в эксперименте на крысах с глиомой С6 сопоставляли с таковыми при применении препарата Аласенс.

1. Результаты использования флуоресцентного агента Аласенс

В 1-й группе крыс (4 крысы) оценивали селективность накопления и спектральные характеристики препарата Аласенс через 2 ч с момента внутривенного введения в бедренную вену. При использовании лазера с длиной волны 532 нм получены убедительные пики накопления ПП IX в глиоме, отличающиеся по амплитуде от сигнала, полученного от здоровой ткани, примерно в 3 раза. При этом были обнаружены значительные вариации интенсивности флуоресцентного сигнала от различных участков опухолевой ткани и периопухолевого пространства.

На рис. 3 продемонстрирован спектр флуоресценции Аласенс-индуцированного ПП IX при возбуждении на длине волны 532 нм и ослабляющем фильтре в приемном канале спектрометра ОС 13 (наблюдаются максимумы флуоресценции на длине волны 635 и 710 нм): интенсивность флуоресценции, регистрируемая через кость, примерно на порядок ниже интенсивности флуоресценции, регистрируемой непосредственно с поверхности опухоли.

2. Результаты использования флуоресцентного агента Alexa 660, конъюгированного с анти-Cx43

Во 2-й группе крыс (4 крысы) после имплантации глиомы C6 на 12-е сутки оценивали накопление и распределение в головном мозге MAbE2Cx43 Alexa 660 (антитела к коннексину-43, конъюгированные с флуоресцентным агентом Alexa 660). Спектральный анализ флуоресценции Alexa 660 c применением лазера с длиной волны 638 нм оценивался в глиоме, периглиомной зоне и интактной мозговой ткани.

Интенсивность флуоресценции была нормализована на уровень сигнала от контрольного объекта (кожа руки экспериментатора). При этом интенсивность флуоресцентного сигнала от опухоли, регистрируемого транскраниально in vivo, составила 14 отн. ед. (рис. 4).

Интенсивность сигнала флуоресценции Alexa 660 in vivo после удаления костного лоскута от поверхности коры контралатерального полушария, а также в значительном удалении от глиомы и периглиомного пространства в ипсилатеральном полушарии составила порядка 2 отн. ед., с поверхности глиомы после удаления экстракраниальной части интенсивность сигнала 5 отн. ед. По мере продвижения датчика от опухоли в латеральную сторону по поверхности ипсилатерального полушария сигнал увеличивается до 8 отн. ед. При продвижении датчика в медиальную сторону (в сторону желудочков) от глиомы по поверхности коры в сторону срединной линии сигнал увеличивается до 20 отн. ед. (см. рис. 4).

При исследовании глиомы ex vivo видно, что глиома прорастает мозг в медиальном направлении, чем объясняются снижение или увеличение сигнала флуоресценции Alexa 660 при исследовании с поверхности коры in vivo. На фронтальном сечении и сагиттальном сечении извлеченного мозга крысы сигнал от центра глиомы (зона некроза) достигает 2 отн. ед., по периферии глиомы до перифокальной зоны (в зоне активной миграции клеток опухоли) сигнал увеличивается до 4 отн. ед., а в периглиомной зоне сигнал регистрируется в диапазоне 12 отн. ед. и выше.

3. Результаты использования флуоресцентного агента Alexa 488, конъюгированного с анти-Сх43, дополненного введением препарата Аласенс («двойная» метаболическафя навигация)

С целью колокализации накопления в глиоме и периглиомной зоне препарата Аласенс и антител мы связали МАbЕ2Сх43 с другой флуоресцентной меткой Alexa 488. Так же как и в предыдущих группах, в вену препарат Аласенс ввели за 2 ч и MAbE2Cx43 А1еха 488 за 24 ч до исследования.

При одновременном использовании лазерных источников с длиной волны 405 и 473 нм были получены пики флуоресценции Alexa 488 в диапазоне 500-550 и пик протопорфирина IX в диапазоне 600-650 нм. Было рассчитано отношение интенсивности пика флуоресценции ПП IX (635±10 нм) к интенсивности пика флуоресценции Alexa 488 (520±10 нм) и получено распределение этого отношения интенсивностей в разных зонах опухоли.

В табл. 3 и на рис. 5 приведены значения этого отношения, нормализованные на значение для центра опухоли.

На рис. 5 хорошо видно, что в центре oпyxoли наблюдается высокий уровень флуоресценции обоих красителей, что говорит о хорошем накоплении Аласенс-индуцированного ПП IX и антител, меченных А1exa 488. При этом, чем сильнее оптоволоконный зонд удаляется от центра опухоли, тем значительнее спад сигнала флуоресценции ПП IX при практически неизменном уровне сигнала Alexa 488.

4. Результаты оптической визуализации экспериментальной глиомы С6 крысы с помощью препарата Аласенс и антител, меченных флуоресцентной меткой

Для регистрации видимого излучения использовали камеру со светофильтром. Нами использован полупроводниковый лазер с длиной волны 473 нм, фильтр полосовой интерференционный, выделяющий полосу 500-600 нм. На рис. 6 отмечается интенсивная флуоресценция глиомы С6 вследствие накопления в ней МАbЕ2Сх43 Alexa 488, введенных в системный кровоток за сутки до исследования.

5. Результаты конфокальной микроскопии экспериментальной глиомы С6 крысы с помощью препарата Аласенс и антител, меченных флуоресцентной меткой Alexa

При внутривенном введении препарата Аласенс крысам с глиомой С6 методом конфокальной микроскопии оценивали селективность накопления ПП IX в ткани опухоли и периглиомной зоне. Клетки глиомы С6 перед имплантацией были помечены мембранным трейсером (красителем) DilC18 (флуоресценция на длине волны 546 нм). Таким образом, отслеживали накопление протопорфирина в клетках глиомы по двум флуоресцентным сигналам (лазер 546 нм для DilC18, лазер 630 нм для индукции сигнала от ПП IX).

По результатам проведенной микроскопии, опухолевая ткань активно поглощает Аласенс, а в единичных глиомных клетках, мигрировавших от основного очага опухоли, флуоресценции от ПП IX не наблюдалось (рис. 7).

Вероятно, это связано с особенностями метаболизма опухолевых клеток.

Флуоресцентный анализ срезов мозга крыс через 24 ч после внутривенного введения крысам с экспериментальной глиомой препаратов MAbE2Cx43 выявил накопление последних по флуоресцентной метке Alexa 488 в клетках в области перитуморального вала (рис. 8).

Для точной локализации накопления MAbE2Cx43 препарат был дополнительно гистохимически дополнен иммунопроявлением GFAP позитивных реактивных астроцитов.

При введении фотоиммуноконъюгата (MAbE2Cx43 с производным фталосенса) в количестве 400 мкг/кг по белку флуоресцентный сигнал от фотосенсибилизатора был получен в периглиомной зоне (рис. 9).

Обсуждение

Рекомендации по проведению операций при глиомах головного мозга включают максимальную резекцию опухоли с минимальным риском функциональных осложнений с обязательным использованием микрохирургической техники и интраоперационной оптики. При наличии показаний в ходе оперативного вмешательства могут быть использованы нейронавигационные системы и нейрофизиологический мониторинг [4].

Максимальная радикальность оперативного вмешательства с учетом физиологической дозволенности приводит к одномоментной элиминации большого количества жизнеспособных опухолевых клеток, в том числе и резистентных к терапии, уменьшает внутричерепную гипертензию и может способствовать улучшению нарушенных неврологических функций [5]. Надежная информация относительно объема резецированной опухоли может быть получена путем интраоперационной визуализации. Решение этой проблемы реализуется в основном с помощью интраоперационной компьютерной томографии, магнитно-резонансной томографии, УЗ-сканирования и трехмерной безрамной ультразвуковой нейронавигации, нейронавигационных систем и различных комбинаций этих методов [4, 6, 11].

Одним из новых методов интраоперационной навигации является применение 5-AЛK в хирургии различных опухолей головного мозга. Данный метод основан на селективном накоплении опухолевыми клетками ПП IX и используется в хирургии глиом [1, 7, 29], менингиом [12, 15], метастазов [16] и других опухолей головного мозга. Однако в ряде случаев при использовании 5-АЛК встречаются флуоронегативные опухоли. Так, чувствительность оптической диагностики с использованием микроскопа с флуоресцентным модулем в хирургии глиальных опухолей составляет 58,8% при глиомах Grade I-II и 89,7% при глиомах Grade III-IV [1]. Это обусловливает необходимость поиска путей повышения эффективности интраоперационной флуоресцентной диагностики. Один из возможных путей для этого - использование векторизированных фотосенсибилизаторов.

Коннексин-43, участвующий в образовании межклеточных щелевых контактов (gap-junctions), позволяет клеткам осуществлять адгезию и обмениваться различными внутриклеточными мессенджерами. Кроме того, белок выполняет определенную роль в активной миграции Cx43-позитивных глиомных клеток в перитуморальную зону [33]. Помимо того, что Cx43-положительные клетки С6 глиомы обладают более высокой способностью к миграции, чем Cx43 негативные, они более устойчивы к оксидативному стрессу и различным другим повреждающим факторам [33]. Таким образом, Сх43 представляется перспективными мишенями для ингибирования опухолевой инвазии и адресной доставки фотосенсибилизаторов в перитуморальную зону.

В эксперименте при введении крысам с глиомой невекторных фотосенсибилизаторов, в частности препарата Аласенс, мы показали накопление их в опухолевых клетках, однако границы глиомной инвазии оказались Аласенс-негативными. Неспецифичность накопления свободных фотосенсибилизаторов в опухоли послужила поводом для экспериментальных исследований с векторной направленностью.

При спектральном анализе глиомы и периглиомной зоны крыс при введении крысам МАbЕ2Сх43 с флуоресцентными метками Alexa 488 и Alexa 660 был зафиксирован высокий флуоресцентный сигнал в зоне экспрессии Сx43 (по периферии глиомы, где локализуются активно делящиеся клетки опухоли, и периглиомной зоны, представляющей собой реактивный вал из Cx43 и GFAP позитивных астроцитов). При введении МАbЕ2Cx43, ковалентно связанных с производным фотосенсибилизатором фталосенс, методом конфокальной микроскопии мы показали наличие флуоресцентного свечения в перитуморальной зоне.

Таким образом, продемонстрирована возможность проведения интраоперационной диагностики клеток глиомы, мигрирующих от основного очага опухоли, с применением векторизованных фотосенсибилизаторов, что может быть использовано для интраоперационной метаболической навигации. Пилотное экспериментальное исследование с использованием антител к коннексину-43, конъюгированных с различными флуоресцентными метками, показало эффективное накопление флуорофора в клетках опухоли в условиях in vivo. Это дает основание полагать, что МАbЕ2Сх43 могут быть эффективной мишенью для доставки флуоресцентных агентов в ткань глиомы, что дает перспективу развития метода в хирургии нефлуоресцирующих (при использовании препарата Аласенс) глиом в будущем.

Комментарий

Лечение пациентов с глиальными опухолями головного мозга является важной проблемой в современной нейрохирургии. Одним из основных аспектов хирургического лечения данной категории пациентов является интраоперационная демаркация границ опухоли ввиду инфильтративного характера процесса. Крайне важным фактором, влияющим на продолжительность общей и безрецидивной выживаемости пациентов, остается максимально возможное хирургичское удаление опухоли.

С этой целью используются различные методы интраоперационной мультимодальной нейронавигации, в том числе флуоресцентная диагностика с 5-аминолевулиновой кислотой. Однако, к сожалению, чувствительность метода, по данным литературы, составляет около 80-90% в хирургии злокачественных глиом. Значительно реже флуоресцентный эффект наблюдается у пациентов с доброкачественными глиальными опухолями. Применение метода лазерной спектроскопии позволяет повысить чувствительность и специфичность флуоресцентной диагностики в ходе оперативного вмешательства. Другим способом повышения эффективности метода может служить использование различных туморотропных антител для векторной доставки флуоресцентных агентов в опухоль.

В качестве вектора для доставки флуоресцентных агентов в область активной инвазии опухолевых клеток весьма перспективно применение моноклональных антител к антигену, активно накапливающихся в периглиомной зоне, в частности, к коннексину-43. Авторами в экспериментальной работе показана возможность использования флуоресцентных агентов Alexa 488 и Alexa 660, соединенных с указанными антителами, в том числе в сравнении с применением протопорфирина IX (препарат Аласенс). При этом спектральный анализ распределения двух флуоресцентных препаратов (протопорфирин IX и Alexa 488), данных одномоментно (метод «двойной» метаболической навигации), показал их различное накопление в центре опухоли и в перифокальной зоне. Так, центральная часть опухоли в большей степени накапливает протопорфирин IX, тогда как периферическая зона - конъюгат Alexa 488 с антителами к коннексину-43. Использование дополнительного источника света и камеры со светофильтрами позволило провести оптическую флуоресцентную визуализацию глиомы на срезах мозга. Работа иллюстрирована фотографиями конфокальной микроскопии, подтверждающими накопление флуоресцентных препаратов в ткани опухоли. В работе продемонстрирована возможность проведения интраоперационной флуоресцентной диагностики с применением векторизованных фотосенсибилизаторов для визуализации клеток глиомы, мигрировавших от основного узла опухоли, что может быть использовано с целью повышения эффективности метода.

Из недостатков работы можно отметить отсутствие данных об использовании векторной доставки флуоресцентных агентов при доброкачественных глиомах головного мозга, что может быть связано с трудностью моделирования данной патологии в эксперименте. Кроме того, авторами не указано: происходит ли развитие возможных побочных эффектов при использовании антител к коннексину-43. Также было бы интересно уточнить возможности использования антител к другим опухолевым антигенам с целью векторной доставки флуоресцентных агентов в глиальные опухоли головного мозга.

Таким образом, разработанный метод векторной доставки флуоресцентных препаратов может быть использован для повышения эффективности флуоресцентной диагностики в ходе дальнейших экспериментальных работ с возможной перспективой применения и внедрения в клинике в будущем после проведения полного цикла клинических исследований при глиомах головного мозга.

О.Н. Древаль (Москва)