Список сокращений
PME — фосфомоноэфиры
PDE — фосфодиэфиры
Pi — неорганический фосфат
PCr — фосфокреатин
АТР — аденозинтрифосфат с тремя пиками αАТР, βАТР и γАТР
31P МРС — фосфорная (31Р) МР-спектроскопия
PCho — фосфохолин
PEth — фосфоэтаноламин
GPE — глицерофосфоэтаноламин
GPC — глицерофосфохолин
В настоящее время в диагностике заболеваний головного мозга наряду со стандартными МРТ-методиками широко применяется протонная (1Н) магнитно-резонансная спектроскопия (МРС), которая позволяет получить информацию о метаболическом составе тканей, а также определить относительную (соотношение пиков) и абсолютную концентрацию метаболитов в различных тканях [1—6].
Новым подходом в неинвазивной оценке изменения процессов метаболизма, происходящих в мозговом веществе, стала фосфорная (31Р) МРС [4, 6, 7]. Этот метод открывает широкие возможности в исследовании изменений энергетического обмена в мозге. Фосфорная МРС, используя резонансные частоты ядер фосфора (31Р) в его различных химических соединениях, позволяет регистрировать следующие основные метаболиты: PME — фосфомоноэфиры, PDE — фосфодиэфиры, Pi — неорганический фосфат, PCr — фосфокреатин, АТР — аденозинтрифосфат с тремя пиками αАТР, βАТР и γАТР.
Клиническая ценность применения фосфорной магнитно-резонансной спектроскопии (МРС) в неврологии и нейрохирургии связана с тем, что фосфоросодержащие химические вещества играют важнейшую роль в энергетическом метаболизме клеток и их концентрация в белом и сером веществе головного мозга достаточно высока. Это позволяет неинвазивно изучать протекающие в мозге процессы, сопряженные с процессами энергетического обмена. Более того, предполагается, что изменения в энергетическом статусе клеток мозга предшествуют их структурной перестройке. Фосфорная МРС способна визуализировать патологические изменения в мозговой ткани, наступающие на самых ранних этапах структурной перестройки, которые позже можно визуализировать на структурных изображениях. Кроме того, важной составной частью фосфорной МРС является возможность проведения неинвазивной оценки рН мозгового вещества в норме и при опухолевой патологии [8—10].
Цель исследования — отработка методики проведения фосфорной МРС в клинических условиях с определением ее воспроизводимости и информативности в оценке энергетического обмена с измерением внутриклеточного рН в здоровом мозговом веществе.
Материал и методы
Основу данного исследования составила группа из 23 добровольцев в возрасте от 21 года до 28 лет (15 мужчин и 8 женщин, средний возраст 25 лет). В группу вошли молодые люди без какой-либо клинической неврологической симптоматики и без изменений в веществе головного мозга по данным стандартного анатомического МРТ-исследования. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом НМИЦ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко. После подписания добровольцами информированного согласия была выполнена фосфорная МРС с использованием специализированной сдвоенной 1Н-31Р катушки. Все исследования были проведены на МР-томографе с напряженностью магнитного поля 3,0 Тл (GE). В качестве области интереса выбирался участок мозга размером 6×6×2 см в проекции больших полушарий таким образом, чтобы он содержал и белое, и серое вещество, не захватывал желудочки мозга и через него не проходили крупные кровеносные сосуды. Чаще всего это была область семиовальных центров. Положение области интереса задавали по строго аксиальным изображениям, взвешенным по Т2 (Т2-ВИ). На рис. 1 показана
pH = 6,77 + log [(δPi – 3,29)/(5.68 – δPi)],
где δPi — химический сдвиг неорганического фосфата относительно пика фосфокреатина. Определение δPi показано на рис. 2.
Химические сдвиги, возникающие из-за влияния химических связей на локальное поле, в котором находятся исследуемые ядра, имеют значения порядка десятков Гц, тогда как значения резонансных частот имеют порядок десятков МГц. Поэтому значения химических сдвигов выражают в миллионных долях (м.д., ppm — parts-per-million), не зависящих от величины постоянного магнитного поля томографа. Химические сдвиги соединений, представляющих интерес для биологических исследований, попадают в довольно узкий интервал порядка 25 м.д. в шкале от –10 до +15. Дополнительно в качестве теста для оценки фосфолипидного и энергетического метаболизма мы вычисляли соотношения пиков метаболитов, используя стандартный подход к измерению этих соотношений, ориентируясь на данные предыдущих исследований [8—11]. Для статистической обработки результатов был применен программный продукт Statistica v.6. Порог значимости составлял р<0,05.
Результаты
В группе добровольцев нами была получена стабильная картина фосфорного спектра пиков основных метаболитов здорового мозгового вещества, что подтвердило адекватность проводимой методики МРС. На рис. 1, б представлен фосфорный спектр головного мозга здорового добровольца. В табл. 1 приведены
После отработки методики мы оценили уровень внутриклеточного pH и рассчитали показатели целостности фосфолипидов и энергетического обмена здорового мозга на основе вычисления всех соотношений полученных метаболитов.
В табл. 2 представлены
Обсуждение
Самый высокий центральный пик в фосфорном спектре здоровой ткани имеет фосфокреатин (PCr). Фосфорный спектр калибруется таким образом, чтобы частота пика фосфокреатина составляла 0 ppm. Первым по шкале химического сдвига слева от пика PCr расположен пик фосфодиэфиров (PDE=3,6 м.д.). Главные составляющие этого пика (глицерофосфоэтаноламин и глицерофосфохолин) являются структурными компонентами клеточных мембран, а повышение значений PDE наблюдается в случае усиления деградации фосфолипидов клеточных мембран [12]. Затем следуют пики неорганического фосфата — Pi=5,3 м.д. и фосфомоноэфиров — РМЕ=7,1 м.д. Пик РМЕ включает МР-сигналы от фосфатов сахаров: глюкозо-6-фосфата, сахарозо-6-фосфата, а также иных гексозо-6-фосфатов и продуктов-предшественников мембранных фосфолипидов. Эти пики частично перекрываются. В некоторых работах [9, 10] исследователи отдельно описывают метаболиты, составляющие основную часть пика РМЕ — фосфохолин (PCho) и фосфоэтаноламин (PEth) и пика PDE — глицерофосфоэтаноламин (GPE) и глицерофосфохолин (GPC). При исследовании добровольцев нам достоверно удалось дифференцировать только пики GPE и GPC, которые образуют общий пик PDE. Дифференцировка отдельных пиков в составе пика PME была затруднена. Поэтому при дальнейшем сравнении данных, полученных у добровольцев, мы использовали только самые высокие интегральные показатели двух пиков — PME и PDE, не разделяя их на отдельные составляющие.
Справа от пика PCr расположены три пика аденозинтрифосфата — АТР. PCr и тотальный АТР относятся к высокоэнергетичным фосфатам, в то время как PME, PDE и Pi составляют группу низкоэнергетичных фосфатов. Сравнение их показателей часто используется в оценке энергетического обмена мозговой ткани. Количественно фосфорные спектры оценивают по отношению высот пиков метаболитов к высоте пика αATP [13, 14] или по отношению площадей под пиками к площади под пиком αATP как наиболее стабильном в фосфорном спектре.
Молекулы всех метаболитов, кроме АТР, содержат один атом фосфора, поэтому каждая молекула имеет только одну резонансную частоту, т. е. образует один пик в спектре. Если в веществе содержится несколько химически сходных фосфоросодержащих молекул с близкими резонансными частотами, то в 31Р-спектре пики этих метаболитов почти совпадают. Так, при использовании клинических МР-сканеров очень трудно отличить сигнал глюкозо-6-фосфата от фруктозо-6-фосфата или других гексозо-6-фосфатов (составляющих пик PME).
АТР принципиально отличается от остальных упомянутых химических веществ, поскольку содержит три атома фосфора в молекуле. Резонансные частоты ядер этих трех атомов фосфора различны, поэтому 31Р-спектр АТР состоит из трех отдельных пиков, которые четко отличаются между собой и всегда воспроизводятся при использовании клинических МР-сканеров. В нашем исследовании у всех добровольцев были получены МР-спектры, где четко визуализировались три составляющие АТР (γАТР: –2,6 м.д., αАТР: –6,8 м.д., βАТР: –15,7 м.д.).
Следует помнить, что концентрация метаболитов в МР-спектрах пропорциональна не только высоте пика, но и площади под ним [14]. Узкий и высокий пик необязательно указывает на более высокую концентрацию метаболита по сравнению с низким, но широким [15]. В нашем исследовании в качестве первичного анализа фосфорных МР-спектров мы регистрировали высоту пиков и проводили нормировку спектров по высоте пика αATP (по аналогии с протонной МРС, где все сравнения проводят по величине пика креатина).
Главные компоненты пика PME — фосфохолин (PСho) и фосфоэтаноламин (PEtn) участвуют в биосинтезе фосфоглицеридов и являются предшественниками фосфолипидов клеточных мембран [9]. Основные компоненты пика PDE — молекулы глицерофосфохолина (GPC) и глицерофосфоэтаноламина (GPE) в свою очередь указывают на наличие продуктов распада клеточных мембран [5, 16]. Отношение PME/PDE может служить индексом метаболизма фосфолипидов клеточных мембран, отражать изменения в скорости мембранного синтеза и оборота фосфолипидов клеточных мембран и тем самым являться маркером малигнизации, продолженного роста опухоли или ответа опухоли на лечение [5, 17, 18]. Интересно, что в нашей серии добровольцев цифровые значения соотношения пиков PME/PDE — 1,17±0,20 отличались от показателей нормы, приведенных в работе D. На и соавт. [9] — 0,47±0,07. Причина такого несоответствия, возможно, находится в различиях технических параметров МР-томографов, так как мы использовали МР-сканер 3,0 Тл, а коллеги — 1,5 Тл, а также в отличии объемов измеряемого участка мозговой ткани.
В группе здоровых добровольцев значения внутриклеточного рН составили 6,963±0,04 (медианное значение — 6,945, минимальное — 6,89, максимальное — 7,05). Полученное в нашем исследовании среднее значение рН является более низким по сравнению с таковым в работах D. Maintz и соавт., D. Ha и соавт., Wenger K. и соавт. [9, 10, 17], где значения рН составили 7,04±0,01, 7,07±0,1 и 7,017±0,026 соответственно. Однако их результаты соответствуют максимальным значениям рН, полученным нами. Одной из возможных причин такого разброса значений уровня рН здоровой мозговой ткани, помимо особенностей настройки и отличия оборудования, может являться разный возрастной состав группы испытуемых, так как уровень рН мозговой ткани с годами меняется [19]. Наша группа добровольцев имела малое различие в возрасте и, возможно, поэтому значения рН были практически одинаковы у большинства испытуемых.
Одним из недостатков фосфорной МРС является сложность распознавания пиков многочисленных метаболитов в исследованиях in vivo. Так, в спектре in vivo пик фосфомоноэфиров — PME образуют около 10 различных химических веществ, сигналы от которых частично перекрываются между собой, поэтому пики каждого метаболита различить сложно. Другой недостаток связан с возникновением артефактов при измерениях. Артефакты могут быть вызваны неоднородностью магнитного поля, металлическими имплантатами (например, зубными коронками), сигналами от крови и движением. Кроме того, при проведении спектроскопии в нашем исследовании из-за большого поля обзора (техническая особенность фосфорной МРС нашего МР-сканера) регистрировался смешанный сигнал как от мозгового вещества с захватом белого (преимущественно) и серого (коркового) вещества, так и от других структур, например крупных кровеносных сосудов, ликвора в субарахноидальных пространствах, попадающих в зоны интереса.
Для пиков метаболитов, полученных в нашем исследовании, стандартное отклонение химического сдвига составило 0,2 м.д., т. е. проводимая нами настройка МР-сканера обеспечила стабильное положение пиков всех метаболитов относительно пика фосфокреатина. Вместе с тем в литературе величины химических сдвигов отдельных пиков (в ppm) относительно фосфокреатина несколько отличаются от наших данных. Причиной этому, по нашему мнению, могут являться несколько факторов. Например, в работе R. Kamble и соавт. [12] для получения фосфорного спектра использовался МР-томограф с напряженностью магнитного поля 1,5 Тл. К другим причинам могут относиться конструктивные особенности принимающих катушек и особенности настройки аппаратов с различными алгоритмами подавления помех и артефактов.
Заключение
(31Р) МРС является передовым неинвазивным методом исследования, демонстрирующим высокую воспроизводимость результатов с получением спектра метаболитов, участвующих в энергетическом обмене и метаболизме фосфолипидов клеточных мембран. Проведение измерений пиков, соответствующих определенным метаболитам, позволит получить важную информацию о процессах, протекающих как в здоровой, так и в патологической мозговой ткани. Кроме того, с помощью 3(31Р) МРС можно неинвазивно измерять внутриклеточное значение рН в норме и при патологии центральной нервной системы. В перспективе (31Р) МРС может быть полезным инструментом в исследованиях механизмов возникновения и развития различных (особенно нейродегенеративных) поражений головного мозга. Однако для адаптации этого метода в клинике и определения его роли в неинвазивной диагностике различных поражений головного мозга требуются дальнейшие исследования соответствующих групп пациентов. Вторая часть работы будет посвящена анализу данных, полученных при исследовании пациентов с опухолями головного мозга.
Работа поддержана грантом РНФ № 18−15−00337.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
*e-mail: pronin@nsi.ru
Комментарий
Работа посвящена применению метода фосфорной (31Р) магнитно-резонансной спектроскопии (МРС) в изучении энергетического обмена и метаболизма фосфолипидов клеточных мембран мозговой ткани.
Метод фосфорной спектроскопии позволяет изучать метаболизм здоровой и патологической ткани головного мозга, в частности метаболизм опухолей головного мозга, с помощью визуализации основных фосфорсодержащих метаболитов, присутствующих в клетке. Выявляемые в спектре метаболиты позволяют охарактеризовать патологическую ткань по формированию ее энергетического профиля. Другими словами, (31Р) МРС позволяет неинвазивно получать важную информацию о клеточном метаболизме, т.е. фундаментально изучать клеточные процессы. С помощью вычислений соотношений метаболитов, их высоты и интегральных значений возможно изучить энергетический обмен клетки, обмен фосфолипидов клеточных мембран с помощью визуализации двух метаболитов РМЕ и РDE, которые отражают синтез и деградацию клеточных мембран, внутриклеточный рН, вариация значений которого связана со степенью метаболических нарушений клетки, а также может служить маркером ответа опухоли на проводимое химио- и лучевое лечение. (31Р) МРС в совокупности с 1Н-МРС и другими модальностями также может быть использована в определении степени злокачественности опухолей и природы патологических образований.
В работе представлена методика проведения фосфорной (31Р) МРС, проанализированы данные литературы по использованию (31Р) МРС в нейрохирургической клинике. Авторами самостоятельно проведены измерения основных фосфорных метаболитов головного мозга у 23 добровольцев без органического поражения вещества мозга. Эти исследования позволили оценить диапазон значений основных метаболитов в супратенториальных отделах головного мозга, в частности в белом и сером веществе, оценить значение рН в здоровой ткани головного мозга.
Результаты исследования сопоставлялись с данными других авторов для определения воспроизводимости полученных результатов. Полученные значения рН и параметры основных фосфорных метаболитов в здоровом веществе не противоречат измерениям других авторов.
На основании проведенных исследований авторы показали, что данная методика в дальнейшем может быть использована в исследовании метаболических изменений патологической ткани головного мозга, что имеет важное клиническое значение в диагностическом поиске и мониторинге ответа опухоли на лечение, а также в определении прогноза.
М.Б. Долгушин (Москва)