Специальные термины и аббревиатуры

— Набор Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip kit на приборе Illumina NextSeq 550 — набор комплектующих для выполнения исследования с определением профиля метилирования ДНК опухоли, использованный в представленных клинических случаях

— Тепловая карта — графическое представление данных, где индивидуальные значения в таблице отображаются при помощи цвета, в данном случае — параметров метилирования генома)

— RTK — receptor tyrosine kinase

— IDH1/2 — гены фермента изоцитратдегидрогеназы, мутации в которых сопряжены с лучшим прогнозом у пациентов с глиомами, а дикий тип, соответственно, с более плохим прогнозом

— дикий тип генов IDH1/2, добавка хромосомы 7, гомозиготная делеция CDKN2A и делеция хромосомы 10 — являются типичными молекулярными особенностями глиобластом

— WHO — аббревиатура ВОЗ (Всемирной Организации Здравоохранения), классификация ВОЗ первичных опухолей ЦНС является основной классификацией в нейроонкологии

— 1p/19q коделеция — обязательный классификационный признак олигодендроглиом grade II—III (в комбинации с IDH-1 мутацией)

— IDH1 R132H — наиболее часто встречающийся вариант IDH1 мутации (до 85% случаев)

— ПЦР-анализ — полимеразная цепная реакция — один из распространенных методов молекулярной диагностики, в нашем случае — опухолевого генома

— STR-локусы — короткие тандемные повторы, состоящие из следующих друг за другом повторяющихся нуклеотидных звеньев с некоторой общей последовательностью, длиной от 1 до 5 нуклеотидов). Индивидуальные аллели таких STR-локусов отличаются друг от друга числом этих одинаковых тандемно повторяющихся последовательностей, т.е. повторов

— Комбинированная система индексов ДНК (CODIS) — это национальная база данных ДНК США, созданная и поддерживаемая Федеральным бюро расследований. CODIS состоит из трех уровней информации: Местные системы индексов ДНК (LDIS), где создаются профили ДНК, Государственные системы индексов ДНК (SDIS), которые позволяют лабораториям внутри штатов обмениваться информацией, и Национальная система индексов ДНК (NDIS), которая позволяет государствам сравнивать информацию ДНК друг с другом

— амплификация EGFR — амплификация (‘умножение’) гена эпидермального фактора роста — частая генетическая аномалия в злокачественных глиомах

— TERT-мутации — мутации в гене телоизомеразы/обратной транскриптазы

— MGMT — метилгуанинметилтрансфераза — фермент, репарирующий поврежденные алкилирующими агентами (например, нитрозопроизводными, лучевой терапией) участки ДНК

Введение

Множественные глиомы — событие в рутинной нейрохирургической и нейроонкологической практике нередкое, развивается у приблизительно 20% пациентов со злокачественными глиомами и требует дифференциального диагноза с метастатическими опухолями, реже с лимфомами, а также с демиелинизирующими заболеваниями и инфекционным поражением головного мозга [1—3]. Для удобства классификации множественных глиом предложены следующие понятия: мультицентрические и мультифокальные опухоли. К мультицентрическим глиомам относят те опухоли, между которыми не наблюдается ни макроскопической, ни микроскопической связи, либо те, при которых не удается идентифицировать путь диссеминации. Формируются подобные опухоли в белом веществе, субэпендимарно и интервентрикулярно [4, 5]. Обычно мультицентрические глиомы развиваются супратенториально, хотя описаны и редкие комбинированные супра- и субтенториальные опухоли [6]. Мультифокальными принято называть опухоли, при которых между ними имеется четкая микроскопическая связь либо ясен характер распространения из первичного очага [2]. Мультифокальные опухоли чаще распространяются по комиссуральным волокнам, субарахноидальным пространствам, желудочковой системе либо формируют отдельный локальный солидный метастаз в непосредственной близости от очага опухоли [3]. По времени развития множественные опухоли принято делить на синхронные (имеющиеся на момент постановки нейровизуализационого диагноза) и метахронные (появляющиеся при контроле заболевания) [6]. По морфологическим и молекулярным особенностям множественные глиомы не отличаются от ординарных глиальных опухолей [5].

В настоящей статье мы представляем описание двух клинических наблюдений синхронных мультифокальных опухолей с последующим обсуждением. В первом случае речь идет о ‘типичной’ мультифокальной первично-множественной глиоме, в то время как природа опухолей во втором случае остается дискутабельной: либо представляет собой редкий нетипичный случай метахронного мультицентрического возникновения различных типов глиальных опухолей, либо речь идет о вторичной глиоме/глиобластоме.

Клиническое наблюдение №1

Пациентка П., 59 лет, была госпитализирована в наш Центр по поводу множественных новообразований передних отделов левой лобной доли и задних отделов правой лобной доли. По данным магнитно-резонасного томографа (МРТ) головного мозга с контрастным усилением были выявлены мультифокальные очаги кистозно-солидного объемного процесса головного мозга в передних отделах левой лобной доли и задних отделах правой лобной доли. До госпитализации для исключения метастатического характера очагов пациентке была выполнена ПЭТ-КТ с 18F-фтордезоксиглюкозой, данных о наличии метаболически активной ткани, характерной для ФДГ-позитивного неопластического процесса, на момент исследования не получено. Проведено микрохирургическое удаление опухолей передних отделов левой лобной доли и задних отделов правой лобной доли с применением нейрофизиологического мониторирования. Биопсийный материал от обеих опухолей раздельно маркирован и доставлен в патологоанатомическое отделение. При гистологическом исследовании в обеих опухолях диагностирована идентичная по морфологической картине глиобластома. Был исследован профиль метилирования ДНК с использованием набора Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip kit (Illumina, Inc., США) на приборе Illumina NextSeq 550. Анализ результатов был произведен на платформе molecularneuropathology.org с использованием классификатора Version 12.5 of the brain classifier. В обеих опухолях был выявлен метиляционный класс опухоли MC Glioblastoma, IDH-wildtype, RTK1 subtype с коэффициентом соответствия 0,99991. Количественные изменения на хромосомах в обеих опухолях были идентичны: добавка хромосомы 7, гомозиготная делеция CDKN2A и делеция хромосомы 10. В одной из опухолей имелась дополнительная аберрация — делеция 8р. MGMT метилирован в обеих опухолях.

Клиническое наблюдение №2

Пациентку М., 47 лет, беспокоили жалобы на головные боли и частые приступы замирания длительностью несколько мес. На МРТ головного мозга с контрастным усилением в апреле 2022 г. был выявлен очаг изменения плотности в медио-базальных отделах правой височной доли. Ранее в июле 2020 г. было проведено микрохирургическое удаление новообразования правой височной доли головного мозга с применением нейрофизиологического мониторирования. Была верифицирована IDH1-мутантная олигодендроглиома, WHO grade 2 с коделецией 1p19q. Был проведен курс лучевой терапии и 6 курсов химиотерапии темозоломидом. Через 1 год на контрольной МРТ головного мозга на фоне отсутствия признаков прогрессирования опухоли в правой височной доле отмечено ее появление в левой теменной доле головного мозга. Пациентка была оперирована повторно, проведено микрохирургическое удаление новообразования левой теменной доли головного мозга с нейрофизиологическим мониторингом.

Рис. 1. МРТ снимки пациентки 47 лет с олигодендроглиомой правой височной доли и глиобластомой левой теменной доли.

а—г — МРТ-снимки перед первой операцией. В области медиальных отделов правой височной доли определяется диффузная опухоль, не накапливающая контрастное вещество; д—з — МРТ-снимки перед второй операцией. В области правой височной доли определяются послеоперационные изменения. Удален полюс и крючок височной доли, а также головка гиппокампа. В задних отделах гиппокампа определяются остатки опухоли, которые уменьшились на фоне химиолучевой терапии. В левой теменной доле определяется диффузная опухоль, неоднородно накапливающая контрастное вещество и не связанная с первичным очагом. Опухоль пока еще не имеет типичной зоны некроза, характерной для глиобластомы. а, б, в, д, е, ж — МРТ-снимки в режиме Т2 Flair; г, з — Т1 с контрастным усилением.

Гистологическое исследование выявило злокачественную глиому с многочисленными фигурами митозов, микроваскулярной пролиферацией, очагами некрозов с тенями клеток, ‘псевдопалисадными’ структурами, фокусами кровоизлияний. Методом флуоресцентной гибридизации in situ была выявлена делеция 1p и полисомия 19q (рис. 2). Дважды методом секвенирования по Сэнгеру были исследованы мутации генов IDH1 и IDH2, выявлен дикий тип генов. Исследование мутационного статуса IDH повторно проведено и в первичной опухоли правой височной доли (рис. 3). Продолжено исследование методом флуоресцентной гибридизации in situ обеих опухолей, выявлены гомозиготная делеция CDKN2A и амплификация EGFR в материале от опухоли левой теменной доли.

Рис. 2. Гистологическое строение и результаты флуоресцентной гибридизации in situ олигодендроглиомы и глиобластомы.

а — олигодендроглиома, более клеточная часть. Окраска гематоксилином и эозином, ув. 100; б — олигодендроглиома, участок сочетающий и олиго- и астроцитарную дифференцировки. Окраска гематоксилином и эозином, ув. 100; в — типичная олигодендроглиома с тонкими сосудами. Окраска гематоксилином и эозином, ув. 100; г — глиобластома с плотным расположением клеток, микроваскулярной пролиферацией и очагами некрозов. Окраска гематоксилином и эозином, ув. 100; д, е — выявленная флуоресцентной гибридизацией in situ коделеция 1p19q в олигодендроглиоме: д — проба к 1р, е — проба к 19q; ж — сбалансированный профиль хромосомы 7 с отсутствием амплификации EGFR в олигодендроглиоме; з — делеция 1р на фоне небольшой до 3 сигналов добавки 1q в глиобластоме; и — полисомия (повышение количества сигналов до 3—4 в каждом ядре) хромосомы 19 в глиобластоме; к — амплификация EGFR — множественное бессчетное количество красных равномерно распределенных сигналов в каждом ядре в глиобластоме.

Рис. 3. Мутационный анализ генов IDH1 и IDH2 в олигодендроглиоме и глиобластоме.

а — стрелкой показана мутация гена IDH1-R132H в олигодендроглиоме (исследование с прямым праймером); б — стрелкой показана мутация гена IDH1-R132H в олигодендроглиоме (исследование с обратным праймером); в — исследование мутационного статуса гена IDH2 в олигодендроглиоме (исследование с прямым праймером), выявлен дикий тип гена, стрелкой показаны позиции, в которых возникают типичные замены при мутациях гена IDH2; г — исследование мутационного статуса гена IDH2 в олигодендроглиоме (исследование с обратным праймером), выявлен дикий тип гена, стрелкой показаны позиции, в которых возникают типичные замены при мутациях гена IDH2; д, е — исследование мутационного статуса гена IDH1 в глиобластоме, стрелкой показана позиция, в которой возникают типичные замены при мутациях гена IDH1, отсутствие наложения пиков в указанных позициях говорит о диком типе гена IDH1: д — исследование с прямым праймером; е — исследование с обратным праймером; ж, з — исследование мутационного статуса гена IDH2 в глиобластоме, стрелкой показаны позиции, в которых возникают типичные замены при мутациях гена IDH2, отсутствие наложения пиков в указанных позициях говорит о диком типе гена IDH2: ж — исследование с прямым праймером; з — исследование с обратным праймером.

Обе опухоли исследованы на наличие мутации гена TERT: в правой височной доле мутация гена TERT выявлена в варианте C250T, в то время как в опухоли левой теменной доли мутация гена TERT выявлена в другом варианте с заменой C228T (рис. 4).

Рис. 4. Мутационный анализ гена TERT в олигодендроглиоме и глиобластоме.

Вверху стрелкой показана мутация гена TERT в варианте C228T в глиобластоме, внизу стрелкой показана мутация гена TERT в варианте C250T в олигодендроглиоме.

Учитывая наличие мутации IDH1 в правой височной доли и отсутствие мутации IDH1 в левой теменной доле, а также разные позиции выявленной мутации гена TERT, стало понятно, что речь идет о двух различных глиомах, поэтому принято решение об исследовании принадлежности материала методом изучения коротких тандемных последовательностей (чтобы убедиться, что материал получен у одной и той же пациентки и исключить ошибку в сборе материала). Доказано, что обе опухоли принадлежат пациентке (рис. 5).

Рис. 5. Мультиплексный ПЦР-анализ коротких тандемных последовательностей. Верхние четыре электофореграммы опухолевый материал от глиобластомы; нижние четыре электофореграммы опухолевый материал от олигодендроглиомы. Короткие тандемные последовательности в обеих опухолях идентичны.

Редкость последовательно развившихся глиом сподвигла нас на изучение метиляционного профиля опухолей путем анализа структуры метилирования ДНК обеих опухолей с применением набора Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip kit (Illumina, Inc., США) и анализом результатов на платформе molecularneuropathology.org с использованием Version 12.5 of the brain classifier.

В результате было выявлено, что опухоль правой височной доли имела метиляционный класс IDH-глиома, подкласс олигодендроглиома с коделецией 1p/19q. Количественные изменения на хромосомах — делеция короткого плеча хромосомы 1 и делеция длинного плеча хромосомы 19. MGMT метилирован.

Опухоль левой теменной доли, в свою очередь, имела метиляционный класс глиобластома, подтип RTK2. Количественные изменения на хромосомах — небольшая делеция на 1p, гомозиготная делеция CDKN2A, делеция хромосомы 10, небольшая делеция на 12q и 14q, добавка хромосомы 7 с амплификацией EGFR. MGMT метилирован (рис. 6).

Рис. 6. Количественные изменения на хромосомах.

а — в олигодендроглиоме. Отсчет добавок и делеций ведется относительно тонкой основной линии напротив показателя 0,0: выше линии, зеленый цвет — добавка; ниже линии, красный цвет — делеция. Нижняя линия обозначает хромосомы от 1 до 22 (chr1-chr22), каждая хромосома вертикальной линией поделена на плечи р и q. В данной опухоли имеются: делеция целого плеча 1р и делеция 19q; б — в глиобластоме: тонкая делеция 1р, добавка 7 хромосомы, гомозиготная делеция CDKN2A, делеция хромосомы 10, делеция 14q.

Обсуждение

Периодически в нашей рутинной практике мы сталкиваемся со множественными глиальными опухолями, и в настоящий момент у нас появилась возможность эпигенетического молекулярного исследования подобных новообразований. Мы проанализировали структуру метилирования ДНК в четырех опухолях у двух пациенток 47- и 59-летнего возраста и построили на основе метиляционных профилей тепловую карту (рис. 7), на которой четко видно сходство одновременно диагностированных RTK1-глиобластом у 59-летней пациентки и полную противоположность последовательно развившихся опухолей у женщины 47 лет. В первом случае мы обнаружили две гистологически и молекулярно идентичные опухоли с незначительными различиями (в частности, в одной из опухолей имелась делеция 8p). Выявленные нами нарушения — дикий тип генов IDH1/2, добавка хромосомы 7, гомозиготная делеция CDKN2A и делеция хромосомы 10 — являются типичными молекулярными особенностями глиобластом, ранее условно называвшихся первичными глиобластомами de novo. В то время как для второго случая механизм возникновения метахронной опухоли остается неясным. Таким образом, через 1 год после IDH1-мутантной олигодендроглиомы, WHO grade 2 с коделецией 1p19q правой височной доли, в левой теменной доле развилась RTK2-глиобластома, в которой также имелась небольшая делеция на 1p и появились характерные для глиобластом аберрации: гомозиготная делеция CDKN2A, делеция хромосомы 10, добавка хромосомы 7 с амплификацией EGFR.

Рис. 7. Тепловая карта (heatmap), полученная на основе микрочиповых данных Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip и отражающая индивидуальные профили метилирования ДНК образцов опухолей.

В столбцах карты отмечены номера образцов ДНК, в ее строках по горизонтали — позиции 10 тыс. наиболее вариабельных CpG-участков ДНК на микрочипе. Цвета ячеек карты кодируют значения метилирования ДНК по шкале от 0 до 1 (где 0 (синий) — полное отсутствие метилирования в данном участке, а 1 (красный) — полное метилирование). Можно видеть значительное сходство общей структуры метилирования ДНК в образцах 1/3947/22 и 2/3947/22, полученных из одновременно диагностированных глиобластом правой и левой лобных долей у пациентки №1, в то время как образцы двух опухолей пациентки №2 — 7796/21 2020 (олигодендроглиома) и 7796/21 2021 (глиобластома) — имеют совершенно различное расположение метилированных и неметилированных участков ДНК.

При гистологическом сравнении препаратов от обеих операций, проведенных с разницей в один год, ничто не казалось подозрительным, наблюдалось типичное постепенное озлокачествление опухоли с появлением большого количества митозов, микроваскулярной пролиферации и некротических изменений. Однако выявленный дикий тип гена IDH1 во 2-й опухоли заставил нас сомневаться в методах и результатах работы. Мы несколько раз повторили исследование мутационного статуса генов IDH1 и IDH2 в ходе секвенирования по Сенгеру, каждый раз получая идентичные результаты: типичнейшая каноническая [7] мутация IDH1-R132H и дикий тип IDH2 в первичной опухоли, дикий тип генов IDH1 и IDH2 во второй опухоли. В нашей практике мы всегда наблюдали сохранение мутации (той же самой мутации с определенным вариантом замены аминокислот) в рецидивах и метастатических очагах, встречались с появлением и исчезновением амплификаций генов, но никогда не видели исчезновения мутаций при локальной или дистантной прогрессии опухоли, как никогда не видели возникновения другого варианта мутации того же самого гена. Для исключения путаницы с опухолевым материалом была определена его принадлежность и осуществлено сравнение опухоли от двух операций. Мы выполнили мультиплексный ПЦР-анализ 19 локусов, содержащих короткие тандемные повторы (STR-локусы), и локуса гена амелогенина человека с последующим фрагментным анализом путем капиллярного электрофореза.

Повторы в ДНК бывают разного размера и по этому параметру классифицируются на мини- и микросателлиты. Минисателлиты — это области ДНК с повторами протяженной длины, от 9 до 80 нуклеотидов, количество которых в разных ДНК-локусах существенно отличается. Микросателлиты — это ДНК-локусы, которые содержат 2—7 нуклеотидов. Их также называют SSR (simples sequence repeats — простые повторы) или STR (short tandem repeats — короткие тандемные последовательности). На протяжении последних 20 лет STR-локусы используются для идентификации личности.

В результате многократно проведенных сравнительных анализов в человеческой популяции было обнаружено, что количество повторов в определенных локусах в высокой степени индивидуально. Подобранные группы локусов содержат индивидуально-специфичное для каждого человека число повторов, и являются своеобразным ‘отпечатком’, по которому можно идентифицировать отдельного субъекта и принадлежность образца ткани. Кроме того, длина STR-локусов сравнительно невелика, что имеет ряд существенных преимуществ: легко и быстро анализировать с помощью ПЦР, более короткие фрагменты ДНК с большей вероятностью сохраняются в разрушенных и деградированных образцах биоматериала.

Из 19 анализируемых STR-локусов 13 составляют стандартную панель COrDIS (системы комбинированного индекса ДНК): D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, CSF1PO, FGA, TH01, TPOX и VWA); 5 локусов рекомендованы Европейской сетью судебно-экспертных учреждений (ENFSI) для расширения европейских национальных баз данных: D1S1656, D2S441, D10S1248, D12S391 и D22S1045; и локус SE33 — наиболее полиморфный из известных STR-маркеров. Локус амелогенина не является STR-маркером, однако продукты амплификации этого локуса для хромосом X и Y различаются по длине [8].

В результате была выявлена идентичность материалов от обеих опухолей и доказано, что они принадлежат одному человеку.

Проведенный анализ структуры метилирования ДНК продемонстрировал наличие двух независимых глиальных опухолей (олигодендроглиомы и глиобластомы) у пациентки. Кроме того, данное исследование позволило также определить принадлежность материала путем генотипирования обеих опухолей (рис. 8). В нашей рутинной практике при множественных опухолях мы сталкивались с различной степенью малигнизации опухолей, но не с разными типами глиом. Можно ли считать истинными множественными опухолями одновременно выявляемые астроцитарные и олигодендроглиальные опухоли? Не будет ли правильным считать вторичной индуцированную лечением глиобластому, возникшую спустя год после лечения олигодендроглиомы? Можно ли предсказать развитие множественных опухолей у пациента? C. Wei и соавт. продемонстрировали, что это возможно. В апреле 2022 г. они опубликовали работу [9], в которой выявили аберрантную экспрессию гена ALKBH5 при различных видах множественных злокачественных опухолей, включая и глиомы. Они доказали прогностическую роль любых нарушений (включая мутации, дупликации и амплификации) гена ALKBH5, а также значительную связь с инфильтрацией иммунных клеток в микроокружении опухоли и иммунотерапевтический ответ при множественных опухолях. Таким образом, можно предположить, что ALKBH5 является многообещающим прогностическим биомаркером и потенциальным предиктором чувствительности к иммунотерапии при некоторых множественных злокачественных опухолях и глиомах. В то же время описанный нами случай возникновения у пациентки глиом в разных полушариях с различными классификационными и генетическими характеристиками — очень редкий вариант мультицентрических глиом (мы не нашли описания подобного наблюдения в научной литературе), и причины такого биологического развития событий остаются неясными [10]. Поскольку количество публикаций о первичных синхронно-множественных или метахронно-множественных глиомах головного и/или спинного мозга увеличивается, это становится поводом к пересмотру классификационных подходов к глиомам вообще: в настоящее время мы опираемся только на морфолого-молекулярно-генетическую классификацию Всемирной организации здравоохранения опухолей ЦНС, а клинико-анатомическая классификация глиом и опухолей ЦНС, в частности, остается неформатированной.

Рис. 8. Генотипирование и кластеризация образцов по точкам однонуклеотидного полиморфизма эррэя EPIC (n=53) для подтверждения принадлежности материала пациенткам.

Благодарности

Авторы сердечно благодарят коллег, принимавших участие в лечении пациенток и исследованиях опухолей: нейрохирургов Д.И. Пицхелаури, С.А. Маряшева, Р.Э. Ишкинина, А.В. Косырькову, Я.А. Латышева. Врачей и биологов патологоанатомического отделения: Д.С. Ким, Е.Г. Шайхаева, Г.П. Снигиреву, Р.В. Сычеву, А.О. Лавринович и Д.В. Старовойтова.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение №075-15-2020-809) (вн. номер 13.1902.21.0030).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Рыжова М.В., Галстян С.А., Кобяков Г.Л.

Сбор и обработка материала — Ходжаев А.И.

Анализ данных — Рыжова М.В., Галстян С.А., Кобяков Г.Л., Телышева Е.Н., Петрова Е.И.

Написание текста — Рыжова М.В., Галстян С.А., Кобяков Г.Л., Телышева Е.Н., Петрова Е.И.

Редактирование — Рыжова М.В., Галстян С.А., Кобяков Г.Л.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комментарий

Согласно данным CBTRUS от 2021 г., диффузные глиомы составляют почти 20% всех опухолей ЦНС и возникают с частотой 4,52 на 100 тыс. населения. Будучи первично злокачественными новообразованиями, нередко в клинической практике приходится сталкиваться с ситуациями множественных глиом, в том числе с последующим метастазированием как внутри ЦНС, так и за ее пределами (что происходит реже).

В данной статье авторы описывают интересные случаи: в одном — синхронная первично множественная глиома с изолированным поражением обоих полушарий, во втором — также изолированное поражение двух полушарий, однако метахронное и с двумя различными диффузными глиомами. Второй случай представляет особый интерес ввиду диагностических сложностей верификации различных опухолей, в чем авторы, безусловно, преуспели. Кроме того, интерес вызывает и кардинальная смена тактики лечения и прогноза у пациента.

Публикация таких наблюдений позволяет делиться опытом, а также накапливать данные для дальнейших системных исследований редких первично множественных опухолей и улучшения тактики ведения этих уникальных пациентов.

А.С. Бекяшев (Москва)