Введение

Развитие молекулярно-биологических методов диагностики принципиально изменило подходы к классификации опухолей головного мозга в такой степени, что морфологическая картина опухоли с базовыми гистохимическими окрасками может иметь меньшее значение, чем выявление определенных альтераций в геноме опухоли. Классическим примером является IDH-статус диффузных астроцитом.

Метилирование ДНК является процессом регуляции работы генов, а распределение метилированных участков в геноме опухоли носит специфичный характер, зависящий от вида новообразования. Это послужило основой для создания классификатора опухолей мозга (https://www.molecularneuropathology.org/mnp) через определение совпадения метиляционного класса с гистологическим. Метиляционный класс объединяет опухоли со сходным уникальным расположением участков метилированной ДНК.

Мы описываем случай 6-летнего ребенка, у которого удаленная опухоль, исходно имевшая признаки эпендимомы, злокачественной глиомы и нейробластомы, была классифицирована как нейроэпителиальная опухоль со слиянием гена PLAGL1 (партнером по слиянию был ген EWSR1) с помощью метиляционного анализа и теста полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данная опухоль, NETPLAGL1, еще не нашла отражения в классификации опухолей мозга Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), но была недавно выделена как отдельно стоящая метиляционная группа. Мы приводим описание магнитно-резонансной томограммы (МРТ), обсуждаем данные литературы о прогнозе заболевания. Данный случай является первым в отечественной литературе.

Клинический случай

Поводом для обследования 6-летней неврологически сохранной девочки послужили приступы замирания с амбулаторными автоматизмами. В течение 8 мес проводился подбор противоэпилептической терапии (левитирацетам, окскарбазепин, топирамат, файкомпа), но приступы сохранялись с частотой до нескольких раз в неделю.

Видеоэлектроэнцефалографический мониторинг показал эпиактивность в правом лобном регионе, а МРТ по эпипротоколу выявила опухоль в проекции правой цингулярной борозды кпереди от колена мозолистого тела. МРТ-характеристики опухоли в большей степени соответствовали глионейрональной опухоли, вероятнее всего, дисэмбриопластической нейроэпителиальной опухоли (ДНЭО) (рис. 1). Учитывая фармакорезистентный характер эпилепсии, вызванной опухолью, было принято решение об ее удалении.

Рис. 1. Магнитно-резонансная томограмма пациентки.

а, д — аксиальный FLAIR выявляет гиперинтенсивное образование в области цингулярных извилин; б, е — Т2-режим показывает мелкокистозную (пузырчатую) структуру опухоли, FLAIR — однородно гиперинтенсивный сигнал; в — Т1-режим с контрастом — изоинтенсивное образование, не накапливающее контраст; г — коронарный FLAIR демонстрирует инфильтрацию медиальных поверхностей цингулярных извилин; ж—и послеоперационные снимки спустя 1 год показывают тотальное удаление опухоли и отсутствие рецидива. Т2-, T1-режим с контрастом.

Из стандартной лобной краниотомии через межполушарный доступ был осуществлен доступ к опухоли, имевшей серый цвет и мягкую консистенцию. Опухоль инфильтрировала как правую, так и левую цингулярные извилины, что соответствовало МРТ-картине. Опухоль была удалена тотально, ребенок в послеоперационном периоде не имел никакого неврологического дефицита. Послеоперационная МРТ показала тотальное удаление опухоли.

По анамнезу и МРТ-картине мы ожидали получить гистологический диагноз глионейрональной опухоли I степени злокачественности: ДНЭО или ганглиоглиомы. Однако диагноз звучал следующим образом: диффузная астроцитарная глиома высокой степени злокачественности (WHO Grade III—IV). Ткань центральной нервной системы (ЦНС) была представлена разрозненными фрагментами неокортекса и белого вещества, в которых визуализировалась неопластическая ткань с диффузным типом роста (рис. 2). Клеточность была вариабельна, местами клетки формировали гиперцеллюлярные скопления, местами были расположены более диффузно. Клетки опухоли были полиморфными, среднего размера, базофильные ядра округлой, овоидной, полигональной, сигаровидной формы, ядрышек не содержали. Цитоплазма клеток при рутинной окраске не визуализировалась, что формировало паттерн так называемых обнаженных ядер, как бы непосредственно лежащих в густом фибриллярном матриксе. Вокруг предсуществовавших нейронов отмечались скопления опухолевых клеток — перинейрональный саттелитоз. Митотическая активность в среднем была умеренной, в гиперклеточных фокусах — высокой. Иммуногистохимически опухоль имела выраженную диффузную положительную экспрессию GFAP, ATRX, CD56, субтотальную S100 с немногочисленными клетками, слабопозитивными с анти-T53. Экспрессия NSE, MAP2, NF, синаптофизина в многочисленных резидуальных аксонах. Клетки опухоли были негативны в реакциях с антителами к SOX10, EGFR, NeuN, OLIG2, EMA, CD34, хромогранину A, CD99, YAP1. Индекс Ki67 суммарно <10%, в гиперклеточных фокусах достигал 20—25%. При исследовании методом FISH амплификации гена N-myc обнаружено не было.

Рис. 2. Гистологический препарат опухоли.

а — Ki 67; б — узловой характер роста; в — кластеры опухолевых клеток; г — нейрофиламенты; д — синаптофизин; е — периваскулярные розетки.

Следующим этапом была проведена диагностика на мутации в генах IDH1/2 H3F3A, HIST1H3B и HIST1H3C, которая выявила дикий тип всех генов. Повторный пересмотр гистологических препаратов свел дифференциальный диагноз к двум опухолям — эпендимоме или нейробластоме. Было проведено полногеномное метилирование на секвенаторе Illumina Next-Seq 550 Sequencing System согласно уже описанной методологии [1]. По предыдущей версии классификатора опухолей мозга (Brain tumor classifier, version 11b4) патологическая ткань не соответствовала ни одному из известных метиляционных классов, в новой версии 12.5 был получен высокий коэффициент соответствия (0,99) для NETPLAGL1. Методом ПЦР в режиме реального времени, используя специфичные праймеры и зонд TaqMan, в РНК опухоли был выявлен описанный в литературе [2] гибридный вариант EWSR1::PLAGL1 (слияние 9-го экзона гена EWSR1 и 5-го экзона гена PLAGL1).

История открытия NETPLAGL1

Метилирование является одним из способов регуляции работы генов и реализуется присоединением метиловой группы к цитозину в составе ДНК. Расположение метилированных участков в генетическом материале опухоли носит специфичный характер, таким образом, полногеномное метиляционное профилирование становится мощным методом диагностики и классификации опухолей.

При наличии большого биобанка опухолей стало возможным провести корреляцию между существующими гистологическими типами опухолей мозга и их метиляционными профилями, что и было реализовано в проекте Braintumorclassifier [1, 3, 4]. Итогом этой работы стало создание проекта классификатора опухолей мозга — программы, позволяющей с помощью статистических алгоритмов определять гистологию опухоли на основе принадлежности к определенному метиляционному кластеру. Версия 12.5 от февраля 2022 г. содержит около 180 метиляционных классов опухолей. Не вдаваясь в математический аппарат анализа, следует сказать, что его итогом является коэффициент, показывающий, насколько точно программа уверена в совпадении метилома опухоли и ее гистологии: надежным коэффициентом считается 0,9. Некоторые метиляционные группы пока еще не имеют своего отражения в гистологической классификации опухолей мозга ВОЗ, но рассматриваются как очевидные кандидаты на внесение в список, в частности нейроэпителиальная опухоль со слиянием гена PLAGL1 (NETPLAGL1) [2].

P. Sievers и соавт. в 2021 г. опубликовали результаты метиляционного анализа образцов опухолей ЦНС из большого биобанка, что позволило выявить уникальную группу из 40 новообразований, объединенных общим паттерном метилирования ДНК [2]. При проведении секвенирования матричной РНК опухолей было обнаружило слияние гена PLAGL1 в подавляющем большинстве случаев. Иммуногистохимически все эти опухоли были GFAP-позитивны и имели негативную экспрессию SOX2 и OLIG2, что наблюдалось и в описанном нами случае. У 25 пациентов ретроспективно проанализированы клинические данные. Средний возраст детей составил 6,2 года (90% опухолей возникли раньше 17 лет), все опухоли располагались супратенториально. Особенностью этого метиляционного класса было выраженное морфологическое разнообразие: среди гистологических диагнозов преобладала эпендимома (19/32 пациента), но также определялись эмбриональная опухоль или глиомы низкой и высокой степени злокачественности, что соответствует типам опухолей, бывших в дифференциальном поиске в нашем случае. Дополнительный анализ метиляционного кластера NET PLAGL1 демонстрирует разделение этой группы на два подкласса. Из 20 случаев, когда проводилось секвенирование ДНК, в большинстве определялось слияние гена PLAGL1 с EWSR1, затем — с FOXO1 и в 1 случае — с EP300, в 1 случае слияния PLAGL1 не определялось. Таким образом, и в метиляционном (эпигенетическом), и в генетическом (партнер PLAGL1 по слиянию) эти опухоли неоднородны.

Ген PLAGL1 (Pleomorphic Adenoma Gene-Like 1) кодирует одноименный белок, имеющий характерный структурный элемент так называемых цинковых пальцев, что позволяет ему связываться с ДНК, регулируя транскрипцию. EWSR1 — ген, кодирующий белок, фактор транскрипции, его транслокация характерна для саркомы Юинга, по которой он и получил свое название (Ewing sarcoma breakpoint region 1). Исследование прогноза NETPLAGL не входило в задачи работы P. Sievers и соавт., хотя авторы сообщают, что у 11 пациентов с катамнезом безрецидивный период составил 35 мес. Также не исследовалась принадлежность к подклассу в самом метиляционном кластере или ген-партнер PLAGL1 по слиянию, и МРТ-картина этих новообразований не была приведена.

В 2023 г. были описаны МРТ-признаки данной опухоли в рамках единичного наблюдения [5]. МРТ-характеристики данного новообразования совпадают с таковыми у ДНЭО: локализация в коре головного мозга, четкие границы, отсутствие выраженного накопления контраста, мелкокистозная (пузырчатая) структура (см. рис. 1). Спустя 5 мес после операции рецидива отмечено не было. Представленный ранее случай имел ту же МРТ-картину, но локализация была в теменной доле, при этом исходно отмечен доброкачественный характер опухоли (GFAP+, OLIG2—, EMA точечно+ и Ki 67 <1%), в отличие от нашего случая, когда в начале речь шла о злокачественной глиоме. Интересно, что в другой работе 2021 г. была описана морфологическая картина 5 случаев паренхиматозных опухолей мозга со слиянием гена EWSR1, в одном из случаев партнером по слиянию был ген PLAGL1 [6]. Опухоль была удалена у 4-летнего ребенка, располагалась в лобной доле, имела выраженную положительную реакцию с GFAP и была диагностирована как неспецифическая глионейрональная опухоль. Метиляционный анализ этой опухоли не выявил принадлежности к известным кластерам, однако на тот момент в старой версии метиляционного классификатора еще не было категории нейроэпителиальной опухоли со слиянием PLAGL1. МРТ-картины данной опухоли приведено не было, но за время наблюдения в 84 мес рецидива не отмечалось.

Следует отметить, что одно лишь подтверждение слияния гена не может считаться достаточным для диагностики NET PLAGL1. В одной из работ была описана рецидивирующая опухоль со слиянием EWSR1-PLAGL1, вместе с тем опухоль не была GFAP-позитивной [7], а ее метиляционная принадлежность не исследовалась, т.е. вопрос о типе опухоли остался открытым.

Немаловажным является тот факт, что, помимо метиляционнного кластера нейроэпителиальной опухоли со слиянием PLAGL1, существует отдельно стоящий метиляционный класс, выявленный в 2023 г. Эта группа опухолей имеет другую генетическую сигнатуру в виде амплификации (увеличения копий) генов PLAGL1 и PLAGL2 [8]. Опухоли имеют эмбриональные морфологические черты и не экспрессируют GFAP: класс этих недоброкачественных по течению новообразований получил название ET PLAGL — эмбриональная опухоль с амплификацией PLAGL.

Нами представлена клиническая и рентгенологическая картина нейроэпителиальной опухоли со слиянием PLAGL1, новым типом опухоли, выделенным на основе метиляционного анализа. Морфологически опухоль GFAP-положительная и имеет черты эпендимомы, а также глиомы и нейробластомы. ПЦР-анализ показал положительный результат на наличие слияния генов PLAGL1 и EWSR1. Спустя 1 год после операции у пациентки не определяются признаки рецидива опухоли, отсутствуют эпиприступы, отменена противосудорожная терапия.

Данный случай иллюстрирует сложности диагностики опухолей, ассоциированных с длительно текущей эпилепсией, гистологическая классификация которых может быть нетривиальной задачей для патоморфолога, когда завышение степени злокачественности ведет к лишнему адъювантому лечению, а занижение — к несвоевременному его назначению [9]. Базовые методы окраски и иммуногистохимии дали вначале широкий спектр недоброкачественных гистологических диагнозов, не укладывающихся в клиническую и МРТ-картину опухоли, которая предполагала глионейрональную опухоль низкой степени злокачественности (в частности, ДНЭО). Сохранение диагноза злокачественной опухоли диктовало бы необходимость лучевой и химиотерапии для ребенка, но анализ метилома позволил реклассифицировать опухоль и с учетом радикального удаления выбрать выжидательную тактику, которая на момент 1-го послеоперационного года оправдалась.

Таким образом, оценка метиляционного профиля является важным методом диагностики опухолей, особенно в случае неоднозначной морфологической картины. В этом отношении наш случай подтверждает пользу метиляционного анализа в принятии верной стратегии лечения на основе реклассификации опухоли — в литературе описаны случаи, когда такая перемена диагноза была фундаментальной, например из глиобластомы в ДНЭО [10]. Детальная рентгенологическая картина и катамнестические данные представлены впервые в отечественной литературе и дополняют уже описанные ранее случаи.

Заключение

Морфологическая картина NETPLAGL1 имеет черты эпендимомы и злокачественной глиомы, но ее классификационная принадлежность определяется характерным метиляционным классом. Данные о прогнозе заболевания пока неясны, однако нами не было выявлено рецидива опухоли спустя 1 год после тотального хирургического удаления. Благодаря работе команды патоморфологов удалость избежать проведения лучевой и химиотерапии у ребенка, что в целом отражает важную роль метиляционного анализа в современной нейроонкологии, особенно в случае расхождения клинико-рентгенологической и патоморфологической картин. Несмотря на доброкачественное течение в нашем случае, следует учитывать, что в литературе есть указание на риск рецидива опухолей этого метиляционного класса, что диктует необходимость в периодическом МРТ-контроле.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Копачев Д.Н., Рыжова М.В.

Сбор и обработка материала — Копачев Д.Н., Рыжова М.В., Кисляков А.Н., Шайхаев Е.Г.

Статистический анализ данных — Копачев Д.Н.

Написание текста — Копачев Д.Н., Рыжова М.В., Семенова Ж.Б.

Редактирование — Желудкова О.Г., Кумирова Э.В., Мещеряков С.В., Власов П.А., Шкатова А.М., Семенова Ж.Б., Гуща А.О.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Комментарий

Статья посвящена крайне сложной и актуальной проблеме — диагностике опухолей ЦНС у детей. Авторы представили редчайшее наблюдение ребенка с нейроэпителиальной опухолью со слиянием гена PLAGL1 — диагнозом, который невозможно поставить рутинными методами исследования. Эта нозологическая единица до настоящего времени не включена в текущую версию классификации опухолей ЦНС ВОЗ 2021 г. Отличие этой уникальной опухоли состоит в гистологическом многообразии ее морфологических признаков, в том числе в нередком содержании фокусов высокой степени злокачественности. Только точная диагностика, проведенная с помощью метиляционного анализа в представленном наблюдении, сыграла решающую роль в постановке правильного диагноза и избавила ребенка от ненужного адъювантного лечения. Важность наблюдения состоит еще и в том, что клиническая картина и МРТ-характеристики соответствовали опухоли низкой степени злокачественности, предположительно, ДНЭО, а гистологическая картина убедительно демонстрировала злокачественные признаки: гиперклеточность, митотическую активность, высокий пролиферативный потенциал, и даже после дополнительно проведенного молекулярно-генетического исследования дифференциальный диагноз включал высокозлокачественные опухоли (эпендимому, нейробластому). Только проведенное полногеномное метилирование позволило правильно диагностировать эту опухоль с высоким коэффициентом соответствия — 0.99. Диагностика опухолей ЦНС на современном этапе требует интегрированного гистологически-молекулярного диагноза. Представленное наблюдение еще раз доказывает высокую значимость анализа профиля метилирования ДНК в диагностической практике, особенно у детей. Статья имеет высокую практическую значимость и представляет несомненный научный интерес как для нейроонкологов, нейрохирургов, патоморфологов, так и для специалистов по нейровизуализации опухолей ЦНС.

Л.В. Шишкина (Москва)