Нейробластома (НБ) представляет собой злокачественное новообразование, возникающее из примитивных клеток симпатической нервной системы [1]. В развитии НБ особую роль играют симпатоадреналовые клетки-предшественники, которые в норме дифференцируются в хромаффинные клетки надпочечников и клетки симпатических ганглиев [2]. В связи с этим чаще всего НБ развивается в мозговом веществе надпочечников, реже — в параспинальных симпатических ганглиях шеи, грудной клетки, брюшной полости или таза [3, 4]. Как правило, опухоль возникает спорадически, однако описаны семейные случаи НБ, доля которых составляет не более 1—2% [5]. НБ является наиболее частой экстракраниальной солидной опухолью у детей и занимает 1-е место по распространенности во всем мире среди детей в возрасте до 15 лет [6—11].

На основании клинических и молекулярно-генетических характеристик (таких как статус гена MYCN и региона 1p) все НБ стратифицируют на группы низкого, среднего или высокого риска [12]. В отличие от стандартной процедуры лечения НБ низкого риска, которая подразумевает наблюдение, а иногда и хирургическое вмешательство, пациентам с высоким риском проводят интенсивную химиотерапию, хирургическое вмешательство, лучевую терапию и иммунотерапию [13]. Несмотря на то что большинство НБ высокого риска первоначально реагируют на лечение, рецидивы и возникающая резистентность к терапии остаются основными клиническими проблемами. Летальность среди пациентов с НБ высокого риска достигает 50%, поэтому существует потребность в более эффективных терапевтических подходах для такой группы пациентов [1].

Успехам в разработке таргетной терапии для пациентов с НБ препятствует отсутствие рекуррентных соматических мутаций в опухолевых клетках. В настоящий момент активирующие мутации гена ALK остаются единственным рекуррентным соматическим вариантом, хотя только 8—10% опухолей имеют данную аберрацию, что ограничивает практическое применение ингибиторов [14, 15]. В отличие от точечных мутаций хромосомные числовые аберрации (copy number variations) встречаются значительно чаще в клетках НБ. Так, например, гемизиготная потеря длинного плеча 11-й хромосомы (11q) наблюдается примерно в 35—45% случаев всех НБ и характеризуется неблагоприятным прогнозом [16—19].

Для выявления хромосомных аберраций в НБ методом выбора является флюоресцентная гибридизация in situ (FISH), однако в руководстве по цитогенетическим исследованиям опухолей предусмотрено применение и других молекулярно-генетических тестов, таких как количественная ПЦР (qPCR), мультиплексная лигазно-зависимая амплификация зондов (MLPA), сравнительная геномная гибридизация (CGH) и секвенирование нового поколения (NGS) [20].

Поскольку НБ характеризуется высоким уровнем гистологической внутриопухолевой гетерогенности, то флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) имеет ряд преимуществ, позволяя направленно исследовать область интереса в срезе. Правило оценки реакции FISH на тканевых срезах подразумевает оценку только опухолевого компонента с игнорированием сигналов от клеток стромы, которые так или иначе могут встречаться в срезе [21]. Однако в случаях, когда стромальный компонент преобладает над опухолевым субстратом, совсем исключить из анализируемого региона сигналы от клеток стромы в рутинной практике не представляется возможным.

В статье представлено два наблюдения нейробластомы с необычными молекулярно-генетическими изменениями. В обоих случаях исследование проводилось на материале парафиновых блоков. Для исследования методом FISH были проведены серийные срезы толщиной 3—4 мкм, для мультиплексной лигазно-зависимой амплификации зондов (MLPA) использовали ДНК, выделенную из материала, залитого в парафиновые блоки.

Подготовку к микродиссекции опухолевого материала из парафиновых блоков проводили под контролем серийного среза, окрашенного гематоксилином и эозином.

В рамках данной работы методика FISH была реализована как на полноразмерных гистологических срезах, так и на срезах диссектированного материала. Для выявления делеции хромосомного региона 1p проводили FISH с использованием ДНК-зонда XL 1p36/1q25 del (Metasystems, Германия), для определения делеции региона 11q применялся ДНК-зонд KMT2A/CCP11 (Cytotest, США). Пробоподготовку гистологических срезов выполняли с помощью наборов для FISH-анализа в гистологии (Dako, Дания) согласно инструкции производителя. Для визуализации результатов FISH-реакции использовали флюоресцентный микроскоп Olympus BX63 с тройным фильтром DAPI/ORANGE/GREEN и встроенной цифровой камерой Olympus DP80. В каждом образце анализировали не менее 100 интерфазных ядер с четкими сигналами. За границу отсечки аномальных сигналов для зондов XL 1p36/1q25 del и KMT2A/CCP11 принимали значение 33% (согласно рекомендациям протокола NB2004).

Исследования методом MLPA проводили с использованием наборов SALSA MLPA P251, P252 и P253 (MRC-Holland, Нидерланды), содержащих зонды к хромосомным регионам, изменения числа копий которых значимы для определения прогноза при НБ. Капиллярный электрофорез продуктов амплификации осуществляли на генетическом анализаторе GeneStudio (Thermo Fischer Scientific, США), анализ данных и визуализацию результатов — с помощью программного обеспечения Coffalyzer.NET (MRC-Holland, Нидерланды).

Все исследования осуществляли в соответствии с требованиями этического комитета учреждения и с подписанием информированного добровольного согласия законных представителей пациентов.

Наблюдение 1

Девочка, 3 года 10 мес, диагноз: «дифференцирующаяся нейробластома» (рис. 1). При исследовании методом FISH в незрелом компоненте хромосомных аберраций не обнаружено (MYCN, 1p и 11q в норме, см. рис. 1, е), однако в стромальном компоненте выявлено соотношение сигналов от локуса 11q23 к контрольному региону в сторону уменьшения, что соответствует делеции 11q (см. рис.1, в). Для валидации результатов FISH был выбран метод MLPA. Предварительно из исследуемого материала с помощью микродиссекции были выделены незрелый и стромальный компоненты опухоли, которые были отправлены на молекулярно-генетическое исследование методом MLPA. Молекулярно-генетическое исследование подтвердило наличие делеции 11q23 в клетках шванновской стромы при отсутствии аномалий числа копий генов и хромосомных регионов в незрелом компоненте (рис. 2).

Рис. 1. Дифференцирующаяся нейробластома. (Наблюдение 1).

а — общий вид диссектированного стромального компонента опухоли; б — микрофотография стромального компонента; окраска гематоксилином и эозином, ×200; в — результат FISH-исследования хромосомного региона 11q23 в клетках опухолевой стромы. Стрелки — аномальные сигналы — 1R2G, ×600, ДНК-зонд KMT2A (11q23)/CCP11; г — общий вид диссектированного незрелого компонента опухоли; д — микрофотография незрелого компонента; окраска гематоксилином и эозином, ×200; е — результат FISH-исследования хромосомного региона 11q23 в нейробластах. Соотношение сигналов сохранено 2R2G/3R3G, ×600, ДНК-зонд KMT2A (11q23)/CCP11).

Рис. 2. Результаты MLPA. (Наблюдение 1).

а — результат исследования цельного образца опухоли, выявлена делеция региона 11q22.1-11q23.3; б — результат исследования диссектированного опухолевого компонента, делеция региона 11q22.1-11q23.3 не выявлена; в — результат исследования диссектированного стромального компонента, выявлена делеция региона 11q22.1-11q23.3.

Наблюдение 2

Мальчик, 3 года 4 мес, диагноз: «смешанная ганглионейробластома» (рис. 3). В исследуемом гистологическом материале объем шванновской стромы многократно превышал таковой незрелого компонента. При исследовании методом FISH в незрелом компоненте также не обнаружено амплификации гена MYCN и хромосомных аберраций регионов 1p и 11q (см. рис. 3, е). В то же время в клетках опухолевой стромы отмечено соотношение сигналов от локуса 1p36 к контрольному региону в сторону уменьшения, что соответствовало делеции региона 1p36 (см. рис. 3, в). Как и в предыдущем случае, для валидации полученных результатов FISH использовался метод MLPA. Молекулярно-генетическое исследование подтвердило наличие делеции 1p36 в стромальном компоненте опухоли при отсутствии аномалий числа копий генов и хромосомных регионов в незрелом компоненте (рис. 4).

Рис. 3. Ганглионейробластома. (Наблюдение 2).

а — общий вид диссектированн,ого стромального компонента опухоли; б — микрофотография стромального компонента, окраска гематоксилином и эозином, ×200; в — результат FISH-исследования хромосомного региона 1р36 в клетках опухолевой стромы; стрелки —аномальные сигналы — 1R2G, ×600, ДНК-зонд 1p36/1q25; г — общий вид диссектированного незрелого компонента опухоли; д — микрофотография незрелого компонента, окраска гематоксилином и эозином, ×200; е — результат FISH-исследования хромосомного региона 1р36 в нейробластах. Соотношение сигналов сохранено 2R2G/3R3G, ×600, ДНК-зонд 1p36/1q25.

Рис. 4. Результаты MLPA. (Наблюдение 2).

а — результат исследования цельного образца НБ, выявлена делеция региона 1p36.32-1p36.33; б — результат исследования диссектированного опухолевого компонента, делеция региона 1p36.32-1p36.33 не выявлена; в — результат исследования диссектированного стромального компонента, выявлена делеция региона 1p36.32-1p36.33.

Обсуждение

Биологическое поведение НБ определяется структурой и характеристиками незрелого опухолевого компонента. В связи с чем используемая в настоящее время система градации степени злокачественности НБ базируется на критериях, применяемых именно к незрелому компоненту. Обнаруженные сегментарные хромосомные аберрации в стромальных клетках НБ не описаны в доступных источниках литературы и не укладываются в привычную диагностическую картину.

В настоящее время многие придерживаются теории, согласно которой нейробластома берет свое начало из эмбриональных стволовых клеток нервного гребня. Являясь мультипотентными, стволовые клетки нервного гребня в норме образуют клетки-предшественники (клетки нервного гребня, шванновские и симпатоадреналовые предшественники), которые на этапе эмбрионального развития организма мигрируют, а также дифференцируются в клетки симпатической нервной системы и хромаффинные клетки надпочечника [22]. Однако ряд экспериментов на мышах показал, что хромаффинные клетки надпочечников возникают в основном из популяции шванновских предшественников [23]. На данный момент доподлинно неизвестно, какие именно из стволовых клеток-предшественников участвуют в инициации опухолевого процесса и какие генетические события за этим стоят. Результаты исследований природы НБ разнятся: согласно статьям 2017 г., клетки НБ происходят как минимум из 2 типов клеток — это мезенхимальные клетки и клетки нервного гребня [24, 25]; в масштабном исследовании 2021 г. для НБ был описан чистый хромаффинно-клеточный фенотип [26]. В то же время вышеописанные экспериментальные данные не исключают возможность развития НБ из мигрирующих клеток-предшественников нервного гребня или более поздних предшественников шванновских клеток, поскольку в эмбриогенезе данные клеточные популяции способны давать начало хромаффинным клеткам [27]. Также с помощью секвенирования РНК были получены данные о том, что НБ с высоким уровнем транскриптов шванновских предшественников имеют более благоприятное течение вне зависимости от стадии и генетических аберраций [28]. Многочисленные мультидисциплинарные исследования позволяют углубиться в происхождение НБ, но по-прежнему неизвестно, на каком этапе развития опухоли происходит разделение популяции клеток-предшественников, дающих начало опухолевой шванновской строме и популяции нейробластов, и какие молекулярно-генетические события за этим стоят [29].

Заключение

В данной статье описано 2 наблюдения НБ с нетривиальными молекулярно-генетическими находками и неизвестным на данный момент потенциалом. Поэтому для определения значимости описанных аберраций необходимо аккумулирование атипичных образцов НБ с целью проведения в дальнейшем более масштабных исследований с учетом гистологических, молекулярно-генетических и клинических данных.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.