Хронический недостаток сна широко распространен в современном обществе, и за последние 100 лет средняя продолжительность сна сократилась у всего человечества с 8 до 6 ч, а в некоторых случаях до 5 ч и менее [1]. Причины этого очень разнообразны — от экстремальных рабочих графиков, до добровольного ограничения сна без видимых социальных причин [2]. Ранее считалось, что хронический недостаток сна можно компенсировать увеличенным временем сна в выходные дни или воспользоваться режимом полифазного сна. Однако эпидемиологические и экспериментальные исследования с участием добровольцев показывают, что недостаточный ежедневный сон приводит к нарушению когнитивных функций и эмоционального поведения [1, 3], повышает риск развития сердечно-сосудистых и нейродегенеративных заболеваний [4—6], сахарного диабета 2-го типа, ожирения [5, 7, 8]. Причины этих нарушений недостаточно изучены.

Во всем мире для борьбы с социально значимыми мультифакториальными заболеваниями развиваются принципы трансляционной медицины, которые направлены на выяснение генной природы и этиологии этих заболеваний. В последнее десятилетие в этом направлении особое внимание уделяется выяснению роли нарушений сна и последствий хронического недосыпания в развитии социально значимых болезней. Активно ведется поиск путей для улучшения качества сна фармакологическими или другими способами, позволяющими снизить риск возникновения когнитивного дефицита, депрессии, сердечно-сосудистых заболеваний и метаболического синдрома. Проведение таких исследований с участием человека ограничено из-за угрозы здоровью. Создание адекватных моделей хронического недосыпания на животных позволит ускорить решение этой важной задачи.

Однако такие модели имеют ряд существенных ограничений. Во-первых, в отличие от человека пролонгирование бодрствования у животных вынужденно и поддерживается изменением условий их содержания (колесо или беговая дорожка, побуждающее животное к движению [9—13], диск над водой [14]), что может вызывать дополнительные изменения, не связанные со сном, такие как повышенная локомоторная активность и стресс. Люди в большинстве случаев поддерживают бодрствование добровольно и не испытывают от этого дополнительного дискомфорта, связанного с условиями окружающей среды [15].

Другой проблемой сопоставления результатов, полученных у грызунов и с участием человека, являются различия в организации цикла сон—бодрствование. У людей хроническое недосыпание рассматривается, как правило, на фоне ежесуточного ограничения сна до 4—6 ч в ночное время [3, 16]. Применение аналогичного режима у грызунов широко распространено в исследованиях [9, 10, 12, 13], но может быть неправомерно, так как у этих животных наблюдается полифазный суточный ритм, а длительность естественного цикла сна обычно колеблется от 20 мин до 2 ч и рассматривается как один из примеров универсального околочасового ритма, характерного для всех живых систем разного уровня организации [17]. Вероятной основой периодики сна, дыхания, сердечных сокращений, пищеварения, активности многих других интегративных функций клеточных и молекулярных систем может быть околочасовой ритм синтеза белка. По этой причине модели недосыпания у грызунов с полифазным режимом ограничения сна [11], имитирующие ультрадианные ритмы сна, являются предпочтительными при исследовании грызунов и их сопоставлении с данными у других гомеотермов и человека. Кроме того, при полифазном режиме ограничения сна есть возможность анализировать гомеостатические механизмы сна и циркадианную динамику цикла сон—бодрствование. В предыдущих исследованиях мы показывали, что метод качающейся платформы эффективен для краткосрочной тотальной депривации сна у крыс (6 ч) [18]. В восстановительный период в ответ на дефицит сна наблюдается характерная для других типов депривации компенсаторная реакция в виде «отдачи сна», связанная с увеличением как времени, так и интенсивности сна. Этот метод при повторном предъявлении не вызывает признаков адаптации к условиям депривации сна и увеличения локомоторной активности.

Цель данной работы — создать модель хронического недосыпания у крыс с применением полифазного режима депривации сна методом качающейся платформы и определить, характерно ли для этой модели нарушение гомеостатических механизмов сна.

Материал и методы

Исследование проведено на 7 крысах-самцах популяции Вистар в возрасте 7—8 мес, массой тела 350—450 г. Животных содержали в одиночных клетках внутри звукоизолированной камеры при температуре 23±1 °C, фотопериоде 12:12 ч (7:00—19:00 — свет) и свободном доступе к воде и пище. Манипуляции с животными осуществляли в соответствии с этическими стандартами, утвержденными правовыми актами РФ, принципами Базельской декларации и рекомендациями, утвержденными биоэтическим комитетом по охране животных ИЭФБ РАН.

Ограничение сна (ОС). Хронический недостаток сна у крыс вызывали методом циклического ОС: чередование 3 ч депривации сна и 1 ч покоя в течение 5 сут (рис. 1). Депривацию сна осуществляли качанием клетки с частотой 170—180 оборотов/мин на орбитальном шейкере S-3.02L.A20 («ELMI», Латвия). В периоды покоя шейкер автоматически останавливался. Регистрация полисомнограмм (ПСГ) проводилась в течение 24 ч до начала проведения процедуры ОС (контрольные сутки), в период ОС в 1 (OC1), 3 (OC3) и 5-е (ОС5) сутки, а также в период восстановления после окончания процедуры ОС в 1-е (В1) и 2-е (В2) сутки.

Рис. 1. Схема эксперимента по хроническому ограничению сна в течение 5 сут.

Ш — периоды депривации длительностью 3 ч (шейкер работает); П — периоды покоя длительностью 1 ч (шейкер отключен). 24-часовые записи ПСГ в контрольные сутки до ОС (контроль), в ОС1, ОС3, ОС5 и В1, В2. Режим освещения: первые 12 ч светлая фаза, вторые 12 ч темная фаза.

Регистрация и анализ данных. Регистрация ПСГ осуществлялась в условиях свободного поведения животных с помощью телеметрического оборудования Dataquest A.R.T. System («DSI», США). Под общим наркозом (Zoletil; внутримышечно, 70 мг/кг) крысе вживляли подкожно телеметрический модуль 4ET («DSI», США) для регистрации электроэнцефалограммы (ЭЭГ), электроокулограммы глазных мышц (ЭОГ), электромиограммы (ЭМГ) шейной мышцы. Послеоперационный период реабилитации составлял не менее 2 нед. Анализ ПСГ проводили в программе Sleep_Pro. В записях выделяли 4 стадии цикла сон—бодрствование: бодрствование — высокий тонус мышц или двигательная активность на ЭМГ, на ЭЭГ нет выраженного преобладания медленноволновой активности; дремота — на ЭЭГ преобладание медленноволновой активности составляет не более 50% времени регистрации, наблюдаются сонные веретена и низкий тонус мышц на ЭМГ и отдельные вздрагивания; медленноволновый сон (МВС) — на ЭЭГ преобладает медленноволновая активность, низкий тонус мышц на ЭМГ; парадоксальный сон (ПС) — на ЭЭГ преобладает тета-ритм, на ЭМГ развивается атония, быстрые движения глаз на ЭОГ. Эпоха анализа составляла 10 с, эпизоды МВС и ПС выделялись, только если содержали не менее двух последовательных эпох анализа, более кроткие эпизоды относили к дремоте, так как они обычно включали признаки переходного состояния. Для каждого состояния рассчитывалось общее время состояния, средняя длительность и количество эпизодов.

Спектральный анализ ЭЭГ выполняли быстрым Фурье преобразованием для каждого 8-секундного фрагмента записи. Каждый фрагмент записи относили к 1 из 4 состояний, фрагменты, попадающие на границу состояний, не учитывали. Спектральную плотность мощности ЭЭГ усредняли для следующих диапазонов: дельта-ритм — 0,5—4,5 Гц; тета-ритм — 5—8,5 Гц; сигма-ритм — 9—13,5 Гц; бета-ритм — 14—29,5 Гц; гамма-ритм — 30—60 Гц аналогично K. Maloney и соавт. [19]. Значения для каждого состояния и диапазона усредняли за 12 ч светлого и темного времени суток. Для каждого животного значения нормировались на среднесуточный уровень сигнала каждого состояния. Глубокий медленноволновый сон (гМВС) определяли как 30% всех эпох МВС в контрольных сутках с наибольшим преобладанием медленноволновой активности, т.е. время сна с максимальной амплитудой дельта-ритма относительно уровня других частот.

Статистическая обработка. Результаты анализировали в программе Statistica 7.0. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартной ошибки среднего. Различия между днями регистрации проверяли тестом rANOVA для зависимых выборок, множественные сравнения по отношению к контрольным суткам проведены по критерию Даннета, различия между днями с ограничением сна — по критерию Тьюки. Различия между светлым и темным временем суток оценивали с помощью t-критерия Стьюдента для зависимых выборок с учетом поправки Бонферрони на количество дней сравнения. Полученные различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

В результате депривации сна в периоды работы шейкера время бодрствования в ОС1 составило 16,5±0,4 ч (92% от 18 ч). К ОС3 этот показатель снизился до 14,4±0,5 ч (80%, p<0,05 от ОС1), к ОС5 еще снизился до 13,5±0,5 ч (75%, p<0,01 от ОС1) (рис. 2, а). В оставшееся время регистрировались дремота и МВС (рис. 2, б, в). Доля МВС увеличивалась от ОС1 (0,34±0,09 ч, 1,8%) к ОС5 (1,1±0,12 ч (6%, p<0,05 от ОС1). Такой результат может указывать на умеренную адаптацию животных к условиям депривации. ПС в периоды депривации не регистрировался в течение всех суток ОС.

Рис. 2. Общее время разных состояний в часах.

а — общее время бодрствования; б — общее время дремоты; в — общее время МВС; г — общее время ПС. Записи ПСГ в контрольные сутки до ограничения сна (К); ОС1, ОС3, ОС5 и В1, В2. Общее время депривации и покоя (Ш/П) схематично показано на рис. 2: а * — p<0,05 отличие от контроля (критерий Даннета). Знаки над колонкой — отличие за 24 ч; знаки внутри колонок — отличие за 12 ч соответствующего времени суток; ^# — p<0,05 отличие от ОС1 (критерий Тьюки). Знаки над колонкой — отличие за 24 ч; знаки внутри колонок — отличие за 3 ч покоя соответствующего времени суток.

В периоды покоя ОС1 преобладал МВС, составляя 3,2±0,4 ч (53% от 6 ч покоя), к ОС5 его время снизилось до 2,3±0,3 ч (38%, p<0,05 от ОС1) преимущественно за счет темного (активного) времени суток (см. рис. 2, в). Это может указывать на снижение давления МВС. Сходным образом уменьшалась представленность ПС в темное время суток, однако в светлое время суток его доля увеличивалась (рис. 2, г), вследствие этого общее время ПС за сутки не отличалось по своим значениям в ОС1—ОС5 и составляло 45% от исходного уровня. Общее время дремоты незначительно менялось в период ОС, снижение наблюдалось только в ОС1 (см. рис. 2, б).

Таким образом, общее время потери МВС за весь период ОС составило 61%, а общее время потери ПС — 55% по сравнению с исходным контрольным уровнем. После окончания процедуры ОС в восстановительный период не наблюдалось компенсаторного увеличения времени МВС за сутки, однако в темное (активное) время суток представленность МВС возрастала (см. рис. 2, в). Вместе с тем время бодрствования в темное время суток снижалось, а в светлое — увеличивалось (см. рис. 2, а). Эти изменения частично сохранялись и в В1. При анализе ПС выяснено, что его представленность возрастала на 30% (p<0,01) по сравнению с контролем только в В2. При этом прирост ПС отмечался как в темное, так и в светлое время суток (см. рис. 2, г).

В периоды покоя во все сутки хронического недосыпания поддержание МВС было связано с увеличением длительности эпизодов МВС в светлую и темную фазы суток по сравнению с контролем. При сопоставлении длительности эпизодов МВС в ОС5 по сравнению с ОС1 выявлено снижение (рис. 3, а). В отличие от МВС длительность эпизодов ПС возрастала преимущественно в темное время суток (рис. 3, б). В период восстановления после окончания процедуры ОС возрастание представленности МВС в темную фазу суток происходило преимущественно за счет увеличения длительности эпизодов МВС. Увеличение общего времени ПС, которое отмечалось в В1, было связано с возрастанием количества эпизодов ПС на 30%.

Рис. 3. Средняя длительность эпизодов сна в секундах.

а — средняя длительность МВС; б — средняя длительность ПС.

Записи ПСГ в контрольные сутки до ограничения сна (К); ОС1, ОС3, ОС5 и В1, В2. * — p<0,05 отличие от контроля в то же время суток (критерий Даннета); ^# — p<0,05 отличие от ОС1 (критерий Тьюки); ^$ — p<0,05 отличие светлого и темного времени суток (t-критерий с учетом поправки на множественные сравнения).

Во время ОС гМВС присутствовал в периоды покоя, но не во время работы шейкера. В ОС1 время гМВС сократилось в 2 раза по сравнению с контролем. На ОС1 и ОС5 потеря гМВС еще больше увеличилась и к ОС5 была в 4 раза ниже контрольных значений. Потерянное время гМВС не было компенсировано в восстановительный период после окончания процедуры ОС; отмечалась отрицательная динамика (рис. 4, а).

Рис. 4. Анализ данных по гМВС.

а — общее время (часы) гМВС за сутки; б — относительная представленность гМВС в МВС. Записи ПСГ в контрольные сутки до ограничения сна (К); ОС1, ОС3, ОС5 и В1, В2. Пунктирные линии показывают соответствующий контрольный уровень. * — p<0,05 отличие от контроля (критерий Даннета); ^# — p<0,05 отличие от ОС1 (критерий Тьюки); ^$ — p<0,05 отличие светлого и темного времени суток (t-критерий с учетом поправки на множественные сравнения).

В нашем исследовании также оценивали относительную представленность гМВС во всем времени МВС как меру интенсивности МВС. В ОС1 интенсивность МВС возросла как в темное, так и в светлое время суток. В ОС1 и ОС5 интенсивность МВС опустилась ниже контрольного уровня в светлое время суток и оставалась пониженной в течение 2 дней восстановления (рис. 4, б). При анализе ЭЭГ во время бодрствования, дремоты, МВС и ПС отмечался прирост в бета- и сигма-ритмах, который был наиболее выражен на ОС1 и ОС5 по сравнению с контролем (см. таблицу). Повышенные уровни бета- и сигма-ритмов сохранялись в В1 и возвращались к контрольному уровню в В2.

Обсуждение

По продолжительности воздействия различают острую (<24 ч), промежуточную (1—4 дня) и хроническую (>4 дней) потерю сна. Способы нарушения сна у животных варьируют от бережного подбуживания экспериментатором до применения вращающихся барабанов, дисков над водой, беговых колес или дорожек, которые заставляют животное периодически двигаться и бодрствовать. Для каждой методики есть свои преимущества и недостатки.

Для имитации у грызунов (крыс, мышей) ежедневного недосыпания с учетом их полифазного режима сна наиболее популярным является метод депривации сна с применением беговых колес или дорожки в режиме 3/1 в течение 4 сут или 4/2 в течение 3 сут [11, 12]. Одним из недостатков этого метода является принудительная локомоция в колесе или беговой дорожке, которая может внести определенный вклад в изменение временных и спектральных характеристик сна и бодрствования. Кроме того, применение этого подхода не позволяет моделировать у крыс хроническую (>4 дней) потерю сна из-за высокого уровня поведенческой сонливости на ОС5 [11].

Предложенная нами методология ограничения сна у животных с помощью применения полифазного режима депривации сна (3/1 в течение 5 сут) методом качающейся платформы лишена этих недостатков и оказалась эффективной для хронического ОС. На это указывают возрастание времени бодрствования (от 92 до 75% к 5-м суткам), значимое сокращение представленности МВС (от 1,8 до 6% к 5-м суткам) и полное отсутствие ПС в периоды работы шейкера в течение 5 сут. Так как среднее время сна у крыс Вистар составляет 14,5 ч за 24-часовой период, то 6 ч покоя в день недостаточно для получения нормального количества сна, что приводит к хроническому его недостатку. За этим 5-дневным протоколом ОС следует 2 дня сна ad libitum для изучения процессов восстановления.

Данная модель позволила нам исследовать влияние хронического ОС на гомеостатические механизмы сна и паттерны ЭЭГ, равномерно распределенные в неактивную (светлую) и активную (темную) фазы суток во время хронического недосыпания и в период восстановления после окончания процедуры хронического ОС. Используемый в этом исследовании 5-дневный протокол может показаться относительно коротким по сравнению с длительностью хронического недосыпания у людей. Однако данные, имеющиеся в литературе, свидетельствуют, что даже несколько дней недосыпания могут привести к снижению когнитивного функционирования у людей [16, 20], а у грызунов привести к активации генов FosB/ΔFosB (маркеры хронической нейрональной активации) в структурах головного мозга, отвечающих за сон, функции лимбической системы, адаптацию к стрессу [21], снижению аденозинового сигналинга в гиппокампе [12] и повышению содержания BDNF в головном мозге [22]. Кроме того, грызуны могут быть более чувствительны к потере сна, чем люди, поскольку у крыс более высокий уровень метаболического обмена, более короткий период жизни и более короткие циклы сна [23].

Чтобы оценить, как гомеостатические механизмы регуляции сна реагируют на протокол хронического ОС (3/1), мы изучили изменения сна во время периодических 1-часовых периодов отдыха в течение 5 сут ОС и паттерны сна в течение 2 дней ad libitum восстановления после протокола ОС. Проведенный анализ ПСГ выявил нарушение гомеостатических механизмов регуляции гМВС как в период краткосрочных 1-часовых периодов отдыха в течение ОС, так и во время восстановительного периода после окончания процедуры ОС. Это проявлялось постепенным снижением представленности гМВС во время 1-часовых периодов отдыха в течение 5 сут (см. рис. 4) одновременно с увеличением мощности спектра на ЭЭГ в диапазоне бета- и сигма-ритмов во время МВС, что может свидетельствовать о развитии поверхностного МВС (см. таблицу).

Относительные изменения спектральной мощности ЭЭГ во время бодрствования, дремоты, МВС и ПС при хроническом ОС у крыс

Примечание. Значения приведены в % от среднесуточного значения в контрольной записи. * — p<0,05 отличие от контроля в то же время суток (критерий Даннета); ^# — p<0,05 отличие от ОС1 (критерий Тьюки); ^$ — p<0,05 отличие светлого и темного времени суток (t-критерий с учетом поправки на множественные сравнения).

Необходимо отметить, что в наших опытах увеличение бета- и сигма-ритмов на ЭЭГ было верифицировано также в состояниях бодрствования, дремоты и ПС. В течение 2 сут восстановительного периода компенсаторная отдача МВС была ослаблена и не превышала исходного уровня, а время гМВС было ниже контрольных значений. В то же время отдача ПС сохранялась, на что указывает повышение представленности этого состояния на 30% в 1-е сутки. Сходный результат демонстрируют и другие исследования, моделирующие недосыпание у крыс [9—11], что может свидетельствовать о сохранении гомеостатических механизмов регуляции ПС при ОС.

В совокупности полученные результаты указывают, что при хроническом недосыпании страдают преимущественно гомеостатические механизмы, направленные на компенсацию потерянного МВС и гМВС. Однако исследования, проведенные с участием добровольцев, показывают противоречивые результаты — отсутствие гомеостатической реакции сна [24, 25] и ее наличие [26, 27]. Ослабление гомеостатических механизмов регуляции МВС при хроническом недосыпании может быть связано с нарушением как нервных сетей, так и клеточно-молекулярных механизмов, участвующих в формировании МВС и других состояний цикла бодрствование—сон. В соответствии с данными литературы, ОС и вследствие этого длительное бодрствование вызывает устойчивое нарушение в источниках внеклеточного аденозина (уменьшение АТФ, высвобождаемого из астроцитов), что приводит к снижению уровня аденозинового сигналинга через A1R рецепторы, вовлеченные в отдачу МВС, в том числе гМВС, после недосыпания [12, 28].

Ослабление гомеостатических механизмов «отдачи» гМВС и появление высокочастотных составляющих (сигма, бета) на ЭЭГ, характерных для более легких стадий сна, в условиях хронического недосыпания и в восстановительный период является опасным симптомом, который может способствовать ослаблению восстановительных процессов и повреждению мозга из-за накопления токсических продуктов обмена при хроническом недосыпании и их угнетающем действии на глимфатическую систему [29]. У людей с бессонницей также наблюдается повышение амплитуды бета- и гамма-ритмов [30]. Снижение представленности гМВС, в котором, очевидно, происходит ускорение синтеза белков [31], ранее найдено на начальном этапе развития нейродегенерации у крыс в модели доклинической стадии болезни Паркинсона [32, 33]. В нашем исследовании наряду с ослаблением гомеостатической регуляции МВС при хроническом недосыпании отмечены признаки нарушения циркадианного ритма, на что указывало снижение времени бодрствования одновременно с увеличением представленности МВС в активное время суток восстановительного периода.

Заключение

Таким образом, результаты исследования показали, что применение полифазного режима депривации сна (3/1 в течение 5 сут) методом качающейся платформы позволяет моделировать хроническое недосыпание у крыс. Выяснено, что хроническое недосыпание приводит к нарушению гомеостатических механизмов, направленных на компенсацию потерянного МВС при хроническом ОС. Создание адекватной модели хронического недосыпания у животных ускорит выяснение роли сна в патогенезе социально значимых мультифакториальных болезней. Данная модель может оказаться пригодной и для поиска путей фармакологической коррекции для улучшения качества сна.

Работа выполнена в рамках государственного задания (№АААА-А18-118012290427-7) при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.