Боковой амиотрофический склероз (БАС) — неизлечимое нейродегенеративное заболевание, характеризующееся селективной дегенерацией двигательных нейронов спинного мозга и моторной коры и ствола головного мозга. Клинические признаки болезни выражаются в развитии мышечных атрофий, нарушении речи и глотания и фасцикуляции, изменении рефлексов. Основная причина смерти больных, которая наступает в среднем через 3—5 лет с момента появления первых признаков заболевания, — паралич дыхательных путей. Около 90% всех зарегистрированных случаев БАС имеют неизвестную этиологию и классифицируются как спорадические. Остальные 10% — это наследственные формы БАС, характеризующиеся мутациями в ряде генов, в основном аутосомно-доминантного характера [1, 2]. Ключевыми чертами течения данного заболевания являются эксайтотоксичность [3], окислительный стресс [4], дисфункция митохондрий [5], нейровоспалительные и иммунные реакции [6]. В последнее время интенсивно исследуются механизмы программируемой гибели клеток (апоптоза), который может быть ответствен за дегенерацию двигательных нейронов при этом заболевании [7—9].
Исключительная генетическая изменчивость, ассоциированная с БАС, объясняет сложность заболевания, при котором гетерогенные механизмы приводят к общему патогенезу. В связи с этим большое внимание привлечено к изучению нарушений липидного метаболизма в процессе развития БАС. Липиды играют исключительно важную роль в ЦНС: выполняют структурную функцию, являясь основными компонентами клеточных мембран, служат источником энергии, участвуют в межклеточной коммуникации и передаче клеточных сигналов апоптоза и дифференцировки. Нарушение липидного баланса оказывает негативное влияние на структурные и физиологические свойства мозга, функции нейронов и нейроглии, включая мембранный транспорт и контроль над активностью ферментов [10]. Разрушение клеточной мембраны является характерной чертой нейродегенерации, возникающей при хронических заболеваниях ЦНС [11].
Различные нарушения липидного метаболизма характерны как для спорадической, так и для наследственной формы БАС, наиболее часто наблюдаемые из них — дис- или гиперлипидемия [12].
Регуляторная роль липидов как вторичных мессенджеров выявляется при исследовании воспалительных процессов при БАС, которые сопровождаются активацией микроглии, потерей нейромышечных соединений и последующей дегенерацией мотонейронов. При этом наблюдается повышенное содержание нейротоксичных молекул, таких как цитокины, в регуляции процессов синтеза которых активное участие принимают мессенджеры липидной природы [13].
Среди липидов особое место занимают сфинголипиды, которые являются наиболее важными источниками вторичных мессенджеров, передающих сигналы клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза [14]. Дефекты метаболизма сфинголипидов обнаружены и при таких наследственно-обусловленных метаболических заболеваниях, как болезни Фабри, Нимана—Пика, Гоше, относящихся к лизосомным болезням накопления, нейродегенеративным патологиям — болезням Паркинсона и Альцгеймера [15—19].
В последнее время изучению участия сфинголипидов в патогенезе БАС уделяется особое внимание в связи с множественностью их функций в структуре и физиологии мозга. Особую роль сфинголипиды могут играть в индукции апоптоза, который характерен для данного заболевания [20, 21].
Метаболизм сфинголипидов
ЦНС содержит большое количество сфинголипидов, метаболиты которых выполняют не только структурную роль в мембранах, но и являются источниками вторичных посредников, которые осуществляют передачу многочисленных клеточных сигналов.
Класс сфинголипидов представляет собой высокоактивные биологические соединения, которые участвуют в регулировании клеточной пролиферации, дифференцировки, межклеточных взаимодействиях, миграции клеток, внеклеточной и внутриклеточной передаче сигналов и гибели клеток [14, 22]. Для каждой из этих функций существует свой подкласс сфинголипидов, но внутри каждого подкласса присутствие или отсутствие определенных двойных связей может иметь существенное влияние на их функции [23].
Сфинголипидный метаболизм является чрезвычайно сложным процессом и включает сотни молекулярных видов и метаболических путей [24].
В основе структуры всех сфинголипидов лежит алифатический аминоспирт сфингозин. В состав сфингозина входят заряженные группы, такие как этаноламин, серин или холин, которые через амидную связь связываются с ацильными группами, с жирными кислотами. Церамиды являются простейшими сфинголипидами, состоящими из жирной кислоты, прикрепленной посредством амидной связи к сфингозину. Церамид является предшественником сфингомиелина. Церамиды могут деацилироваться до сфингозина, который, в свою очередь, фосфорилируется, образуя сфингозин-1-фосфат. Гликосфинголипиды также являются производными церамида, к которому добавляется один или несколько сахарных остатков, присоединенных с помощью гликозидной связи к 1 гидроксилу церамида.
Метаболизм сфинголипидов осуществляется посредством многочисленных ферментов. Синтез церамида de novo осуществляется на эндоплазматическом ретикулуме. У млекопитающих ацильная цепь церамида содержит от 16 до 26 углеродных атомов в зависимости от типа церамидсинтазы, участвующей в синтезе церамида. В настоящий момент известно 6 церамидсинтаз (CerS1-CerS6). CerS1 включает жирную кислоту C18, CerS2: C20-C26, CerS3: C18 и C24, CerS4: C18 и C20, CerS5: C16, CerS6: C14 и C16. Однако, кроме перечисленных церамидсинтаз, в синтезе церамида участвуют и другие ферменты, в частности сфингомиелиназы и церамидазы [25].
Сфингомиелиназы (SMase) гидролизуют сфингомиелин до церамида и фосфохолина [26]. SMase характеризуются определенными различиями по pH до оптимума активности (кислая — aSMase, щелочная — alkSMase и нейтральная — nSMase), локализацией в клетке и зависимостью от ионов металлов. Кислая aSMase является Zn2+-зависимой и преимущественно локализуется в лизосомах, хотя встречается и секретируемая форма [27]. Кислая aSMase активно и в больших количествах экспрессируется в клетках мозга, равномерно на всем протяжении его развития. Недостаток этого фермента в лизосомах клеток мозга приводит к болезни Ниманна—Пика.
Семейство нейтральных SMase, наивысшая активность которых проявляется при pH 7,4, представлено 3 видами, различающимися локализацией в клетке и зависимостью от ионов. nSMase1 является Mg2+-зависимой с молекулярной массой 47,5 кДа и локализуется в эндоплазматическом ретикулуме, а nSMase2 — в аппарате Гольджи [26]. nSMase3 можно обнаружить в аппарате Гольджи, эндоплазматическом ретикулуме и плазматической мембране [21]. Так же как и кислая SMase, нейтральная изоформа фермента активно экспрессируется в клетках мозга, особенно ее экспрессия активизируется при нейрональном развитии [26, 28].
В настоящий момент твердо установлено, что nSMase2 имеет отношение к нейродегенеративным заболеваниям, таким как болезнь Альцгеймера, деменция при СПИДе, хорея Гентингтона, рассеянный склероз, БАС и др. В патогенезе этих заболеваний имеются общие черты, связанные с усиленным нейрональным апоптозом или оксидативным стрессом [26].
Церамид превращается в сфингомиелин путем переноса с помощью фосфатидилхолин трансферазы фосфохолиновой группы из фосфатидилхолина на церамид. Такой тип фосфатидилхолинтрансферазы называется сфингомиелинсинтазой (SMS). Обнаружено два типа фермента — SMS1 и SMS2. У человека SMS1 локализуется в аппарате Гольджи, в то время как SMS2 первоначально появляется на плазматической мембране [29].
Кроме участия церамида в синтезе сфингомиелина церамид может превращаться в сфингозин и жирные кислоты при действии церамидаз [30]. Подобно SMase церамидазы также различаются по pH оптимуму их ферментативной активности и локализации в клеточном пространстве. К настоящему времени известно 5 церамидаз [30]. Кислая церамидаза локализована в лизосомальных компартментах, нейтральная церамидаза преимущественно находится в плазматической мембране, 3 щелочных церамидазы обнаружены в аппарате Гольджи и плазматической мембране.
Сфингозин превращается с помощью сфингозин киназы в антиапоптотический агент — сфингозин-1-фосфат [31—33]. Ганглиозиды представляют собой обширное семейство сфинголипидов, которые в большом количестве содержатся в мозге человека и животных. В состав ганглиозидов входят гликосфинголипиды, состоящие из церамидов и олигосахаридов, и одной или более сиаловых кислот, прикрепленных к сахаридной цепи. В настоящий момент известно >40 ганглиозидов, различающиеся, главным образом, положением и количеством остатков сиаловых кислот. Ганглиозиды — важные структурные элементы мембран нервных клеток и составляют приблизительно 6% от общего содержания липидов в клетках мозга. Глюкозилцерамидсинтаза, известная также как глюкозилцерамидтрансфераза, катализирует первую стадию гликозилирования в биосинтезе гликосфинголипидов [34]. Различные виды ганглиозидов неравномерно распределены в нервных клетках. Например, ганглиозид GD1a присутствует в большем количестве в гранулярных клетках, чем в клетках Пуркинье. Для ганглиозида GT1a характерно противоположное распределение [35].
К настоящему времени стало очевидно, что такие простые сфинголипиды, как церамид, сфингозин, сфингозин-1-фосфат и гликозилцерамид играют решающую роль в нейрональной функции благодаря регулированию скорости роста, дифференцировки и смерти клеток ЦНС. Нарушение баланса содержания различных классов сфинголипидов приводит к нарушению нейрональной функции и апоптозу клеток мозга.
Все перечисленные классы сфинголипидов претерпевают значительные изменения в ходе развития БАС и, как в настоящее время установлено, участвуют в патогенезе данного заболевания.
Сфинголипиды в патогенезе БАС
Нарушение метаболизма сфинголипидов играет важную роль в патогенезе нейродегенеративных заболеваний, включая хорею Гентингтона [36], болезнь Альцгеймера [15, 37], паркинсонизм и др. [21, 38]. Изменения обмена сфинголипидов могут быть проявлением БАС как спорадической, так и семейной формы и влиять на скорость развития заболевания. Эти изменения касаются как общего содержания церамидов, сфингомиелина, гликосфинголипидов, так и их определенных молекулярных видов [15, 39].
Церамиды при БАС
Церамид играет ключевую роль в метаболизме сфинголипидов [40] и является гидрофобной основой для сфинголипидов других классов, в том числе сфингомиелина, глюкозилцерамидов, галактозилцерамидов, ганглиозидов, сульфатидов и др. У млекопитающих церамид входит в состав сотен различных молекул, и его метаболизм контролирует несколько десятков ферментов [29, 30]. Причиной ряда нервномышечных заболеваний являются мутации в генах, которые регулируют метаболизм церамида. Наследственная сенсорная нейропатия типа I связана с мутациями в субъединице 1 длинной цепи серинпальмитоилтрансферазы (SPT) (фермент, лимитирующий скорость синтеза церамида de novo), что приводит к повышению активности SPT, содержания церамида и дегенерации моторных нейронов [41]. Мутация гена, кодирующего 3-кетодигидросфингозинредуктазу (FVT1), которая катализирует вторую ступень синтеза церамида de novo, является причиной спинальной мышечной атрофии (СМА) крупного рогатого скота [42]. Мутации в гене кислой сфингомиелиназы (ASAH1) (фермент лизосомального гидролиза церамида) определяют целый спектр заболеваний моторных нейронов: от болезни Фарбера, смертельного заболевания раннего детского возраста, характеризующегося снижением активности ASAH1 более чем на 90%, до нетипичных форм СМА со снижением активности ASAH1 на 70% [43]. Следовательно, любые изменения уровня церамида могут быть критической детерминантой выживаемости моторных нейронов.
В пионерской работе R. Cutler и соавт. [44] у больных спорадической формой БАС и трансгенных мышей линии SOD1G93A, модель семейной формы БАС, обнаружено повышение содержания двух молекулярных видов церамида (C16:0 и C24:0) и сфингомиелина C16:0 в поясничном отделе спинного мозга. Причем накопление церамида C16:0 у животных определяется еще на досимптомной стадии БАС. Данные изменения в изученные сроки не затрагивают шейный отдел спинного мозга мышей SOD1G93A, что указывает на уязвимость именно нижних моторных нейронов. Авторы также показывают, что причиной повышения содержания сфинголипидов может быть окислительный стресс, который является ранним событием при развитии БАС, а церамид в свою очередь может непосредственно воздействовать на митохондрии и усиливать окислительные процессы в клетках [43].
В последующем исследовании J. Dodge и соавт. [39] образцов серого и белого вещества шейного отдела спинного мозга больных спорадической формой БАС показано значительное увеличение общего содержания церамида и его молекулярных видов C18:0, C24:1 и C24:0-OH. Повышение содержания церамида при этом не связано с уменьшением активности ферментов, которые опосредуют его деградацию (что характерно для группы болезней с нарушением лизосомального обмена). Активность ферментов, отвечающих за образование церамида из гексозилцерамидов, глюкоцереброзидаз 1 и 2 (GBA1 и GBA2) и галактозилцерамидазы (GALC), увеличивается при кислых значениях pH, а активность GBA2 и GALC увеличивается и при нейтральных значениях pH, что указывает на возможность интенсификации гидролиза сфинголипидов и в лизосомах, и в плазматической мембране клетки, и в органеллах, в которых происходит синтез сфинголипидов [38]. В моторных нейронах больных БАС также наблюдается снижение экспрессии субъединицы 2 длинной цепи SPT [45], что также указывает на преимущественное образование церамида по катаболическим путям, а не в результате синтеза de novo.
Апоптотическая гибель моторных нейронов мышей SOD1G93A сопровождается генерацией церамида и активацией фермента нейтральной сфингомиелиназы, гидролизующей сфингомиелин до церамида [46]. Изменение содержания церамида и других сфинголипидов в поясничном отделе спинного мозга мышей SOD1G93A принципиально зависит от стадии БАС. В работе [38] на терминальной стадии болезни обнаружено незначительное повышение уровня церамида С24:0-OH по сравнению с контролем. Однако на более ранних стадиях заболевания понижен уровень церамида C24:1 и большинства сложных гликосфинголипидов. Это может объясняться снижением синтеза церамида de novo: уровни мРНК субъединиц 1, 2 и 3 длинной цепи SPT и FVT1 значительно снижены; а также дерегуляцией его образования из гексозилцерамидов: активности GBA1 и GBA2 и GALC снижены на симптоматических стадиях развития БАС у мышей SOD1G93A. Снижение уровня церамида на ранних стадиях БАС может как происходить в ходе развития патогенеза БАС, так и являться частью компенсаторного ответа, направленного на предотвращение синтеза токсичных количеств церамида [38].
Сфингоидные основания при БАС
Сфингоидные основания — сфингозин и сфинганин обладают яркими проапоптотическими свойствами. Их проапоптотическое действие связывают со способностью этих сфинголипидов взаимодействовать с ДНК, оказывать влияние на активность ферментов репликации и транскрипции [47] и на ДНК-связывающие свойства ряда регуляторных белков, включая транскрипционные факторы и топоизомеразы [48, 49].
Напротив, сфингозин-1-фосфат обладает антиапоптотическими свойствами и пролиферативными эффектами. Особую роль в этих процессах играет фермент сфингозинкиназа, которая снижает уровень сфингозина в клетке, тем самым спасая ее от гибели [50, 51].
Обладая яркими проапоптотическими свойствами, сфингозин и сфинганин могут принимать непосредственное участие в гибели клеток ЦНС в процессе развития БАС.
Однако участие сфингоидных оснований в гибели двигательных нейронов при БАС практически неизвестно.
В нашей работе практически впервые продемонстрирована резко выраженная дисрегуляция в метаболизме сфингоидных оснований, включая сфингозин, сфинганин и сфингозин-1-фосфат у трансгенных мышей линии FUS (1-359), моделирующих БАС [52]. Резкое повышение проапоптотических сфингозина и сфинганина обнаружено преимущественно в спинном мозге мышей, в то время как содержание этих сфинголипидов оказывается на низком уровне и практически не меняется в структурах головного мозга в процессе развития БАС. Это может определяться поражением именно двигательных нейронов при данном заболевании. При этом резко снижается отношение антиапоптотического агента — сфингозин-1-фосфата к проапоптотическим сфингозину и сфинганину, что указывает на резкую интенсификацию гибели клеток в структурах спинного мозга.
Также обнаружены значительные нарушения в экспрессии генов метаболизма сфинголипидов на разных стадиях развития БАС преимущественно в спинном мозге. Из 4 изученных генов, кодирующих церамидазу, повышается уровень мРНК кислой церамидазы Asah1, локализованной в лизосомах, тогда как уровень экспрессии нейтральной церамидазы Asah2, которая находится на поверхности плазматической мембраны, достоверно снижается в ходе прогрессии FUS-опосредованной протеинопатии. Кислая церамидаза (ASAH1) лизосом гидролизует C10-C14-церамиды с насыщенными связями или C18:1- и C18:2-церамиды с ненасыщенными связями. Субстратами ASAH2 являются C16-C22-церамиды или C26-C36-церамиды. Таким образом, сфингозин генерируется лизосомальной церамидазой из церамидов с более короткими жирными кислотами. Изменение активности лизосомальной церамидазы может указывать на развитие «лизосомального» апоптоза. Резкий скачок экспрессии гена сфингозин-1-фосфатлиазы на терминальной стадии заболевания демонстрирует падение антиапоптотических резервов клеток двигательных нейронов и стремительное развитие апоптоза на терминальной стадии заболевания [52].
Лактозилцерамиды и галактозилцерамиды при БАС
Образование лактозилцерамида C18:0 наблюдается в спинном мозге на терминальной стадии болезни у пациентов, страдающих БАС. Это происходит на фоне повышенной активности α-галактозидаз (ферментов синтеза лактозилцерамида) как при кислых значениях pH, так и при нейтральных [38]. Образование лактозилцерамида может способствовать развитию заболевания, поскольку является медиатором воспаления и апоптоза [53] и активирует микроглию по сигнальному пути NF-κB [54], который вовлечен в процесс гибели моторных нейронов при БАС [55]. Содержание формы галактозилцерамида C24:1 повышено в белом веществе шейного отдела спинного мозга больных спорадической формой БАС [38]. Избыток галактозилцерамида в клетках также может усугублять течение болезни. Например, нарушение метаболизма галактозилцерамида из-за мутаций в GALC приводит к болезни Краббе, характеризующейся тяжелой моторной недостаточностью [56].
Глюкозилцерамиды при БАС
Анализ гомогенатов шейного отдела постмортального спинного мозга больных БАС показывает повышенное содержание глюкозилцерамидов C18:0 и C24:1. Анализ образцов спинного мозга мышей линии SOD1G93A, выделенного на разные сроки болезни, также показывает повышение содержания метаболита глюкозилцерамида C24:1 на терминальной стадии БАС [38]. При изучении мышей линии SOD1G86R A. Henriques и соавт. [57] обнаружили существенные изменения в составе сфинголипидов уже на предсимптомной стадии БАС, и не только в ЦНС, но и в мышцах трансгенных животных. Тогда как уровни большинства изученных авторами глюкозилцерамидов снижены в спинном мозге предсимптомных и симптоматических мышей, уровни многих из этих глюкозилцерамидов увеличены в мышцах на тех же стадиях БАС. Анализ образцов спинного мозга показывает также связанное с возрастом снижение общего количества глюкозилцерамидов как у мышей SOD1G86R, так и у животных контрольной группы. В мышечной ткани возрастных изменений уровня глюкозилцерамидов не наблюдается [57].
Контроль содержания глюкозилцерамидов и соответственно первой стадии биосинтеза сложных гликосфинголипидов осуществляется глюкозилцерамидсинтазой (GCS), трансмембранным белком комплекса Гольджи [58]. Уровень экспрессии мРНК GCS значительно увеличен в мышцах на бессимптомной и симптоматической стадии БАС у мышей SOD1G86R. В спинном мозге уровень мРНК GCS не меняется, как нет и изменений содержания глюкозилцерамидов. Повышение уровня мРНК GCS на ранних сроках авторы рассматривают как событие, предшествующее началу открытого моторного заболевания. Данные вестерн-блоттинга и иммунногистохимического анализа мышц показали также увеличение количества белка GCS, что согласуется с наблюдениями, описанными выше. Важно отметить, что при БАС белок GCS колокализован с белком TDP-43, основным компонентом белковых включений, образование которых характеризует мышечную патологию БАС человека [57].
Эксперименты с использованием ингибиторов GCS подтверждают предположение о защитной роли глюкозилцерамидов при БАС. Добавление в пищу мышам SOD1G93A ингибитора GCS GENZ-667161 усугубляет течение заболевания, значительно ускоряя наступление паралича и уменьшая продолжительность жизни животных [38]. Интраперитонеальное введение ингибитора GCS AMP-DNM мышам SOD1G86R понижает концентрацию глюкозилцерамидов и блокирует экспрессию ряда генов, критичных для развития окислительных процессов, сопровождающих денервацию. Так, AMP-DNM значительно снижает уровень экспрессии PGC1α, основного регулятора биогенеза митохондрий, и PPARα, активатора катаболизма липидов, а также липопротеинлипазы, гидролизующей триглицериды. Кроме того, ингибирование GCS приводит к замедлению восстановления моторных функций, что указывает на критическую роль GCS при реакции на мышечную дегенерацию [57].
Увеличение активности GCS (т.е. интенсификация образования глюкозилцерамида из церамида) является известным отрицательным регулятором апоптоза, вызываемого церамидом [59], что еще раз указывает на возможность защитной роли глюкозилцерамида при БАС, в том числе вследствие ослабления токсического действия церамида. Ингибирование GBA2, фермента, образующего церамид из глюкозилцерамида, ожидаемо дает эффект, противоположный ингибированию GCS. Эпоксид кондуритола B, ингибитор GBA2, увеличивает уровень глюкозилцерамида, значительно ослабляя дерегуляцию генов, вовлеченных в патогенез БАС, а также сохраняет функциональность нервно-мышечного соединения и спасает моторные нейроны от смерти в мышиной модели БАС [60]. Кроме того, интенсификация образования глюкозилцерамида из церамида может оказывать благоприятное действие на течение заболевания и замедлять развитие БАС, инициируя синтез сложных нейротрофических сфинголипидов ганглиозидов, которые способствуют росту нейронов и развитию аксонов [61].
Ганглиозиды при БАС
Указания на отклонения в гомеостазе ганглиозидов при БАС появились в литературе еще в конце прошлого века. Были обнаружены уникальные ганглиозиды [62], антитела к ганглиозидам GM2 и GM1 [63, 64], повышение уровня GM2 в моторной коре головного мозга пациентов, страдающих БАС [65]. Исследования последних лет показывают, что общее содержание нейротрофического ганглиозида GM3, а также содержание его молекулярных видов C18:0 и C24:1, значительно увеличено на разные сроки течения БАС у модельных мышей SOD1G93A [38]. Это может замедлять развитие болезни путем стимуляции дифференцировки олигодендроцитов, нарушенной при БАС [66, 67]. На симптоматической стадии БАС в спинном мозге мышей SOD1G86R происходит значительное повышение содержания GM1a, основного ганглиозида ЦНС, а для мышц характерно значительное увеличение содержания ганглиозидов GM3 и GM2 [57].
Анализ экспрессии генов мышей SOD1G93A показывает, что количество мРНК гексозаминидазы (HEX), фермента, метаболизирующего GM2 в GM3, увеличено в моторных нейронах спинного мозга как на бессимптомной стадии, так и на симптоматической стадии болезни [68, 69]. Также в спинном мозге мышей SOD1G93A и пациентов со спорадической формой БАС повышена активность HEX [70]. Продолжительное увеличение активности HEX не приводит к улучшению течения болезни, что можно связать с недостатком эндогенного субстрата (GM2) для HEX. В соответствии с этим предположением интравентрикулярная инфузия экзогенного GM3 мышам линии SOD1G93A задерживает наступление паралича и увеличивает продолжительность жизни животных [38].
Связь метаболизма холестерина и сфинголипидов
В клеточной мембране холестерин совместно со сфинголипидами образует особые микродомены — липидные рафты, которые включают и специфические белковые молекулы (рецепторы, ионные каналы, ферменты). Липид-белковые комплексы липидных рафтов вовлечены в процессы мембранного транспорта, трансдукции сигналов, формирования синаптических везикул в пресинаптических нервных окончаниях. Холестерин выполняет как роль структурного компонента — усиливает жесткость синаптической мембраны, поддерживает формирование искривления мембран при формировании везикул, так и регуляторную роль при экзоцитозе в процессе высвобождения нейромедиатора при синаптической передаче [71].
Существуют 2 молекулярные модели рафтов, объясняющие их природу и поведение. В первой модели в структуру рафта в качестве липидной компоненты включены холестерин и сфинголипиды, которые ассоциированы с белками. В таких рафтах основным компонентом сфинголипидов является церамид или сфингомиелин, который состоит из гидрофобного церамида и гидрофильной головки фосфорилхолина. Тесное взаимодействие между стерольным кольцом холестерина и церамидной последовательностью сфингомиелина обеспечивает латеральное взаимодействие между сфингомиелином и холестерином, образуя специфический домен. В этих микродоменах холестерин выполняет стабилизирующую функцию, заполняя пустоты между большим объемом сфинголипидов. Холестерин-сфингомиелиновое взаимодействие определяет переход этих доменов в жидко-упорядоченную или желеобразную фазу, что является уникальной характеристикой рафтов. Другие же домены клеточной мембраны существуют в более дезорганизованных жидких фазах из-за отсутствия холестерин-сфингомиелиновых взаимодействий [72].
В настоящий момент исследованы множественные перекрестные пути биосинтеза холестерина и сфинголипидов как на генетическом уровне, так и их структурное взаимодействие в составе рафтов. Содержание холестерина в мембране четко коррелирует с содержанием сфинголипидов [73, 74]. При снижении уровня сфингомиелина и церамида содержание холестерина также падает. Не исключено, что первопричиной накопления холестерина может быть увеличение уровня сфингомиелина. Установлено, что катаболизм сфинголипидов связан с катаболизмом холестерина. Однако точный механизм этого взаимодействия до сих пор неизвестен [75]. Известно, что нарушения в одном из них четко отражаются на катаболизме другого липида. Например, гидролиз сфинголипидов влияет на метаболизм холестерина. Активация SMase, фермента, осуществляющего гидролиз сфингомиелина до церамида, ускоряет этерификацию холестерина без увеличения пула клеточного холестерина [76]. При этом сфингозин, который является продуктом ферментативной деградации церамида, ингибирует этерификацию холестерина [77]. Тесная взаимосвязь метаболических путей холестерина и сфингомиелина подтверждается и при патологии БАС: при исследовании больных БАС и мутантных животных моделей отмечено повышенное содержание эфиров холестерина на фоне повышения сфингомиелина и его метаболита церамида в спинном мозге. Было показано, что ингибирование синтеза сфинголипидов предотвращало не только накопление сфингомиелина, но и эфиров холестерина [44].
Транскриптомный анализ экспрессии генов метаболизма сфинголипидов
В 2017 г. впервые на модели мышей SOD1G86R был одновременно проведен транскриптомный и липидомный анализ образцов спинного мозга. Помимо значительного изменения содержания метаболитов сфинголипидов, наиболее выраженного для церамида (d18:1/22:0) и сфингомиелина (d18:0/26:1), была обнаружена четкая дифференциальная картина экспрессии генов метаболизма сфинголипидов HexB, Asah1, CerK, Glb1, подтвержденная также анализом ПЦР. Анализ взаимосвязи уровней экспрессии генов и метаболитов сфинголипидов показывает достоверную корреляцию между мышечной силой животных (ослабление которой является характерным признаком БАС) и уровнем экспрессии генов Ugt8a (кодирует GCS) и Sgpp2 (кодирует сфингозин-1-фосфат (сфингозин-1-фосфат) фосфатазу 2, фермент, дефосфорилирующий сфингозин-1-фосфат с образованием сфингозина), а также обратную зависимость мышечной силы животных от уровня экспрессии Sphk1 (кодирует сфингозинкиназу 1, фермент, фосфорилирующий сфингозин с образованием сфингозин-1-фосфата) и содержания метаболитов сфингозина и церамида (d18:1/26:0) [78].
Перспективы применения финголимода — синтетического аналога сфингозина, для лечения БАС
Типичным признаком БАС, обнаруживаемым в нервной системе и периферических биологических жидкостях, является нейровоспаление [79]. Хотя развитие БАС — результат медленной и прогрессирующей дисфункции и потери моторных нейронов, важную роль в развитии болезни играют ненейрональные клетки центральной и периферической нервной системы, в том числе иммунные [80, 81]. Распространение и активация микроглии и астроглии являются характерными гистологическими особенностями спинного мозга и моторной коры больных БАС и обнаруживаются in vivo позитронно-эмиссионной томографией [82, 83]. На мышиных моделях БАС показано, что активация микроглии и приток T-лимфоцитов в ЦНС происходят на ранних стадиях заболевания или еще до появления его признаков, а степень выраженности воспаления коррелирует с развитием симптомов БАС [80, 84].
В патогенезе БАС можно условно выделить 2 стадии: раннюю нейропротекторную (микроглия характеризуется фенотипом M2, а T-лимфоциты представлены популяциями Th2 и Tregs) и позднюю нейротоксическую (микроглия характеризуется фенотипом M1, а T-лимфоциты представлены популяциями Th1 и Th17) [85]. Попытки использования иммунодепрессантов широкого спектра действия для лечения БАС не доказали их эффективность [86—88]. Возможно, потому что исследованные агенты подавляли как защитные, так и цитотоксические популяции клеток [89]. Более целенаправленное действие на иммунную систему достигается в случае применения структурного аналога сфингозина, препарата финголимод, проникающего через гематоэнцефалический барьер [90]. Биологическая активность сфингозина была впервые показана в 1986 г., когда Y. Hannun и соавт. обнаружили, что сфингозин ингибирует протеинкиназу Ц (PKC) [91]. Сфингозин вовлечен в процессы остановки клеточного цикла и апоптоза путем модуляции протеинкиназ и других сигнальных путей [92].
Эндогенные сфингозинкиназы фосфорилируют финголимод, что приводит к образованию финголимод-фосфата, аналога сфингозин-1-фосфата, обладающего антиапоптотическими свойствами, который связывает рецепторы S1PR [93], эффективно модулируя их уровень на поверхности клетки. В отличие от традиционных иммуносупрессорных препаратов финголимод не подавляет активность T- и B-лимфоцитов [94, 95], а уменьшает миграцию патогенных лимфоцитов в ЦНС. Финголимод также увеличивает количество циркулирующих в крови Tregs, вызывая перераспределение, а не истощение лимфоцитов [96].
Текущее терапевтическое использование финголимода при БАС основано на его иммуномодулирующей активности, хотя потенциально при БАС финголимод способен индуцировать программу экспрессии генов в нейронах, которая модифицирует их фенотип и может уменьшить потерю нейронных связей, наблюдаемую в ходе нейродегенеративных нарушений [97]. Препарат улучшает неврологический фенотип и увеличивает продолжительность жизни мышей SOD1G93A с симптомами БАС. Благоприятный эффект финголимода связан с модуляцией нейровоспалительных и защитных генов (CD11b, Foxp3, iNOS, IL-1β, IL-10, Arg1 и Bdnf) в моторной коре и спинном мозге животных. Анализ экспрессии генов, ассоциированных либо с фенотипом M1 (iNOS, IL-1β), либо с фенотипом M2 (Arg-1, IL-10), обнаруживает повышенную экспрессию противовоспалительных маркеров Arg1 и IL-10 и нейротрофического фактора BDNF, а также сопутствующее снижение экспрессии iNOS и IL-1β у мышей, получающих финголимод. Кроме того, финголимод вызывает повышение экспрессии транскрипционного фактора FoxP3 [84], индикатора увеличения популяции клеток Treg [98]. Финголимод также значительно снижает экспрессию мРНК CD11b в поясничном отделе спинного мозга и моторной коре, в то время как в шейном отделе спинного мозга таких изменений нет, что указывает на области избирательного подавления активации микроглии препаратом [84].
Следует отметить, что эффективность терапии финголимод у мышей SOD1G93A доказана на симптоматической стадии БАС, при диагностируемой двигательной дисфункции, что позволяет рассматривать применение финголимода как исключительно важный подход к лечению спорадической формы БАС [84]. В настоящее время финголимод является единственным препаратом сфинголипидной природы, проходящим клинические испытания безопасности фазы II для лечения БАС [89].
Заключение
В обзоре представлены наиболее популярные модели, используемые для изучения механизмов БАС. Среди них акцент сделан на моделях БАС с использованием различных видов грызунов, включая мышей и крыс с экспрессией мутантных изоформ SOD1. Наиболее популярными стали мышиные модели, сверхэкспрессирующие человеческие мутанты SOD1. Также были разработаны мышиные модели, экспрессирующие множественные копии мутанта мышиного SOD1 с ранним смертельным заболеванием моторных нейронов. Кроме мышиных моделей были созданы линии трансгенных крыс со сверхэкспрессией SOD1, оказавшиеся особенно полезными для оценки терапевтических исследований в связи с преимуществами в размере животных, особенно при введении терапевтических препаратов, например непрерывной интраспинальной доставке терапевтических средств.
В связи с тем, что у большинства пациентов с БАС патология была вызвана нарушениями в метаболизме РНК, были созданы модели с мутациями в белках, обеспечивающих метаболизм РНК, например TDP-43 и FUS. Белки FUS и TDP-43 имеют сходную доменную структуру и выполняют в клетке аналогичные функции — участвуют в регуляции процессинга и транспорта мРНК [39—42]. В Институте физиологически активных веществ РАН совместно с Институтом биологии гена РАН была создана и охарактеризована линия трансгенных мышей FUS, воспроизводящая внутриклеточные FUS-положительные накопления в нервных тканях, характерные для пациентов с БАС.
Представленные в настоящем обзоре многочисленные исследования, как на различных моделях БАС, так и в клинике, демонстрируют резко выраженную дисрегуляцию в метаболизме различных классов липидов. Значительные нарушения в содержании и синтезе липидов обнаружены на разных стадиях развития БАС. Некоторыми исследователями определено, что состав жирных кислот общих липидов в крови пациентов может отражать патологическое состояние при БАС. На основании изменений содержания некоторых жирных кислот в процессе развития БАС, а именно пальмитолеата (16:1) и олеата (18:1), которые коррелируют с показателями функциональной шкалы при БАС (ALSFRS-R), предлагается использование изменения соотношения этих кислот в качестве независимого прогностического фактора. Кроме изменений в составе жирных кислот обнаружено различие в содержании фосфолипидов между пациентами с БАС и контролем, так же, как и между трансгенной БАС-моделью и контролем.
В последнее время особое внимание исследователей обращено к изучению роли сфинголипидов в развитии БАС. Интенсивно изучаются на моделях БАС животных и у пациентов с БАС изменения в сфингомиелинах, церамидах, глюкозилцерамидах, галактозилцерамидах, ганглиозидах и др. Применение метода масс-спектрометрии позволило изучить специфические различия в спектре молекулярных видов сфинголипидов в процессе развития БАС по сравнению с контролем. Результаты этих исследований обсуждаются в данном обзоре, приводится описание механизмов нарушений метаболизма сфинголипидов при БАС.
Более глубокое понимание биологических путей, регулирующих метаболизм различных сфинголипидов при развитии БАС, позволяет прийти к идентификации мишеней для лекарственных препаратов. В качестве таких мишеней могут выступить ферменты метаболизма сфинголипидов, участвующие в патогенезе БАС. Особый интерес в качестве потенциального лекарственного средства для лечения БАС представляет препарат финголимод — синтетический аналог сфингозина, который в организме фосфорилируется и оказывает влияние, характерное для сфингозин-1-фосфата, антиапоптотического метаболита сфингомиелинового цикла.
Таким образом, детальное изучение изменений в метаболизме липидов при БАС позволит более четко понять патологические аспекты БАС и создать новые лекарственные средства для лечения данной нейродегенеративной патологии.
Работы по моделированию протеинопатий в трансгенных животных и поиску потенциальных нейропротекторов выполнены в рамках госзадания ИФАВ РАН, тема №0090-2019-0005, и программы РАН «Биомедицинские технологии: инновационные разработки». Исследования по свойствам липидов в нейропатологиях выполнены в рамках госзадания ИБХФ РАН тема №44.4 (Гос. Регистрации 01201253310).
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.