Иммунная система плода, являясь одной из регуляторных систем, обеспечивает стабильное состояние внутреннего гомеостаза плода. На антигенные воздействия материнского организма система иммуногенеза плодов реагирует, реализуя при этом свои адаптационные и компенсаторные возможности. Установлено, что такие процессы в иммунной системе, как пролиферация, дифференцировка, миграция, кооперация и апоптоз, генетически детерминированы [1, 2]. В то же время морфоиммуногенез - это сложный процесс взаимодействия клеток-предшественников и незрелых тимоцитов со структурными компонентами стромы, формирующими микроокружение для лимфоцитов [3, 4]. Основным компонентом ретикулярного каркаса тимуса являются полифункциональные эпителиальные клетки. Доказано, что снижение гормонопродуцирующей и цитокиновой функций данных клеток, сопровождающееся их структурными изменениями, реализуется в виде иммунодефицитных состояний [5, 6].

Одной из основных причин высоких показателей перинатальной заболеваемости и смертности детей с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) (масса тела при рождении 500-999 г) являются инфекционные заболевания, развитие и исход которых зависят от морфофункциональной зрелости органов иммунной системы плода и новорожденного. Пролонгированное действие инфекционного агента сопровождается истощением компенсаторных, резервных возможностей тимуса и нарушениями клеточно-тканевой дифференцировки органа. Вместе с тем следует принять во внимание и недостаточную изученность иммунной системы у плодов и новорожденных 22-27 нед гестации, о чем свидетельствуют немногочисленные публикации с довольно противоречивыми сведениями о структурных и функциональных изменениях органов иммуногенеза. Особенно скудно изучена иммунная система плодов в фетальном периоде онтогенеза. Полученные новые знания послужат для диагностики патологии иммунной системы, в первую очередь дисхроний или тканевых пороков развития, составляющих структурную основу иммунодефицитных состояний [7, 8].

Целью настоящего исследования явился анализ патоморфологических изменений в тимусе новорожденных с ЭНМТ, развивавшихся в условиях внутриутробного инфицирования.

Основную группу составили 105 новорожденных с ЭНМТ при рождении. Смерть 72 детей наступила в раннем, 33 - в позднем неонатальном периодах. Основными причинами смерти новорожденных явились следующие заболевания: 56 (53,3%) пациентов умерли от генерализованной вирусно-бактериальной инфекции смешанного генеза, 27 (25,7%) - от врожденной пневмонии, 12 (11,4%) - от двусторонних кровоизлияний в вентрикулярную систему головного мозга, 3 (2,8%) - от врожденного сепсиса и 7 (6,7%) детей - от пороков развития внутренних органов. Этиология воспаления определялась методом прямой и непрямой иммунофлюоресценции на мазках-отпечатках аутопсийного материала с использованием диагностических наборов, содержащих соответствующие моноклональные антитела, меченные флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). У новорожденных основной группы в 41,4% случаев была выявлена герпетическая, в 13,4% - хламидийная, в 36,7% - уреаплазменная и в 8,5% - микоплазменная инфекции, которые в 47,3% случаев сочетались с бактериальной.

В группу сравнения объединены тимусы от 30 умерших детей с ЭНМТ, основной причиной смерти которых явилась асфиксия, развившаяся вследствие острого нарушения маточно-плацентарного кровообращения. Инфекций, передаваемых трансплацентарно, у новорожденных группы сравнения не выявлено. Следует подчеркнуть, что новорожденные основной и группы сравнения сопоставимы по срокам гестации (25-27 нед).

Изучение структурных особенностей тимуса в исследуемых группах осуществлено с использованием комплекса современных методов морфологического исследования, включающего органометрию, обзорную гистологию, элективные методы окраски (по ван Гизону, толуидиновым синим, PAS-реакция), иммуногистохимию с определением экспрессии CD1a, CD3 Т-лимфоцитов на замороженных срезах тимуса, трансмиссионную электронную микроскопию (ТЭМ) и морфометрию.

Иммуногистохимические исследования проводили на срезах кусочков ткани тимуса, фиксированных 2 ч в 4% растворе параформальдегида и приготовленных на криостате Microm НМ. Инкубация срезов с первичными антителами осуществлялась в течение 18 ч при температуре

4 °С, с вторичными биотинилированными антителами - во влажной камере при комнатной температуре в течение 20 мин. Далее срезы окрашивали диаминобензидином, для идентификации ядер использовали метиловый зеленый, и после дегидратации срезы помещали в бальзам. Дифференцировку лимфоцитов оценивали с помощью специфических моноклональных антител к CD1а, CD2, CD3 Т-лимфоцитам фирмы «DakoCytomation».

Оценку результатов иммуногистохимических реакций осуществляли количественным методом по модифицированному нами способу McCarthy и соавт. (1985).

В десяти полях зрения микроскопа при увеличении в 400 раз подсчитывали 100 клеток с различной интенсивностью окрашивания, которую оценивали от 0 до 3 баллов. Индекс экспрессии (ИЭ) изучаемых факторов определяли по формуле:

ИЭ=ΣP(i)/100,

где i - интенсивность окрашивания в баллах от 0 до 3; P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.

В ряде случаев использовали только качественную оценку и в зависимости от интенсивности окрашивания оценивали как отрицательную (–), слабо- (+), умеренно- (++) и резко положительную (+++). Оценку качества реакции проводили на срезах с позитивным контролем для каждого из определяемых антигенов.

Образцы тимуса для трансмиссионной электронной микроскопии фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида. Постфиксационная обработка материала включала двукратное извлечение фиксатора в 0,1 М буфере Милонинга и дополнительную постфиксацию 1% раствором OsО4 на фосфатном буфере в течение 1-1,5 ч. Дегидратировали образцы в растворах этанола и ацетона восходящих концентраций и заключали в смесь из эпоксидных смол фирмы «Fluka». Полутонкие срезы (1 мкм), приготовленные на ультрамикротоме Leica Ultracut UCN, окрашивали метиленовым синим в сочетании с азур II и фуксином основным. Ультратонкие срезы контрастировали на сетке насыщенным раствором уранилацетата в 100% метиловом спирте, приготовленном в смеси с азотнокислым свинцом. Ультраструктуру тимуса изучали в электронном трансмиссионном микроскопе ЭВМ-100АК.

Полученный цифровой материал обработан методами вариационной статистики с помощью программного обеспечения Statistica. Достоверность различий между вариационными рядами с нормальным типом распределения оценивали с помощью критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при p<0,05.

В ходе комплексного морфологического анализа тимусов 105 новорожденных основной группы, полученных при преждевременных родах в 22-27 нед, выявлены 3 варианта структурных изменений. Тимус 20 (17,1%) новорожденных основной группы имел типичную форму, был представлен двумя долями, соединенными в основании перешейком. В 73,9% случаев левая доля по линейным параметрам превышала правую. В тимусе преобладали дольки средних и мелких размеров с двукратным превышением удельного объема коркового вещества (58,3±0,5%) над мозговым (23,4±0,7%). В субкапсулярной зоне долек определялись 2 типа эпителиальных клеток. Клетки первого типа вытянутой или треугольной формы расположены на непрерывной базальной мембране. Умеренная маргинация хроматина в ядре, развитый гранулярный эндоплазматический ретикулум и большое количество вакуолей с белковым субстратом в просвете являются структурным подтверждением участия данных клеток в синтезе гормонов (рис. 1, а).

Внутренняя кортикальная зона долек тимуса состоит из широкопетлистой сети РЭК. Структурные элементы данной зоны формируют своеобразные лимфоцитарно-ретикулоэпителиальные модули. В центре этих образований определяется светлая РЭК, окруженная средними и малыми лимфоцитами (см. рис. 1, в).

Удельный объем мозгового вещества составляет 30,2%. Многочисленные отростки РЭК создают картину петлистого синцития. В цитоплазме РЭК визуализируются веерообразные тонофиламенты. Отмечается перераспределение тимоцитов с увеличением до 66% малых форм. Т-лимфоциты медуллярной зоны в отличие от лимфоцитов коры в своем большинстве имеют зрелый фенотип и функционально активны. Среди них преобладают Т-лимфоциты с антигенами CD2, CD3.

Вокруг зрелых тимических телец определяется два типа РЭК. Первый тип отличается полигональной формой с маргинально конденсированным хроматином в ядре и большим количеством тонофиламентов. Отличительной чертой клеток второго типа является наличие крупных интрацитоплазматических вакуолей. При данном варианте развития тимуса доминируют тельца Гассаля, соответствующие фазе морфофункциональной зрелости.

Второй вариант патоморфологических изменений, диагностированный в тимусе 67 (61,9%) новорожденных с ЭНМТ, отличался достоверным (р<0,001) снижением органометрических параметров и тимико-массового коэффициента, величина которого составила 0,002 усл.ед.

В 64,4% случаев обнаружены нетипичные формы тимуса в виде дополнительных (2-3) долек (27,1%) и гипоплазии левой доли (5,9%).

Тимусы детей при втором варианте патоморфологических изменений сохраняют дольчатое строение. Вместе с тем дольки разнообразные по форме: многоугольные, округлые и неправильно овальные. Достоверное снижение удельного объема коркового (43,32±0,25%) и мозгового (26,08±0,37%) веществ сопровождается полуторакратным в отличие от группы сравнения увеличением кортико-медуллярного коэффициента (2,57), что свидетельствует о замедленной зональной дифференцировке долек (рис. 2, а).

Интерстициальные прослойки и септы тимуса содержат клеточные инфильтраты, представленные макрофагами с PAS-позитивными включениями или сочетанием макрофагов с различными клетками гранулоцитопоэза (нейтрофильные лейкоциты, эозинофилы, базофилы).

Одним из морфологических подтверждений нарушения дифференцировки лимфоцитов при втором варианте патоморфологических изменений в тимусе является двукратное снижение плотности расположения эпителиальных клеток светлого типа в субкапсулярной зоне долек на фоне достоверного уменьшения удельных объемов как эпителиальных клеток (10,9%), так и лимфоцитов (67%).

Среди эпителиальных клеток наружного слоя встречаются участки «деэпителизации», количество и площадь которых увеличивается в латеральных отделах долек. В этих зонах неравномерно распределены клеточные элементы. Участки резкого разрежения тимоцитов чередуются с групповыми скоплениями клеток. Вокруг изолированных ретикулоэпителиоцитов группируются в виде кольца и полукольца большие лимфоциты и единичные (1-2) лимфобласты. Выявленное снижение пролиферативной активности тимоцитов подтверждается уменьшением до 0,38±0,02 усл.ед. (р<0,05) среднего гистохимического коэффициента ДНК в лимфоцитах субкапсулярной зоны. Единичные лимфобласты, большие и малые лимфоциты окружают капилляры с утолщенной базальной мембраной.

Эпителиальные клетки, расположенные субкапсулярно, слабо экспрессируют цитокератин и содержат мелкие PAS-позитивные включения. В цитоплазме РЭК наряду с уменьшением количества вакуолей, лизосом, объема гранулярного эндоплазматического ретикулума прогрессирует деструкция крист митохондрий. Ядра клеток с субмембранной локализацией крупноглыбчатого гетерохроматина. Кариолемма РЭК формирует глубокие инвагинаты.

Ультраструктурные перестройки в РЭК сопровождаются снижением индекса экспрессии СD1а, CD3 Т-лимфоцитов. Помимо эпителиальных клеток и лимфоцитов, в субкапсулярной зоне присутствуют единичные макрофаги и тучные клетки, а в паренхиме определяются очаговые скопления липоцитов, занимающие 1/8-1/10 площади дольки.

Наиболее существенное снижение удельного объема (69,8%) и плотности расположения лимфоцитов (27,7 клетки) выявлено во внутренней кортикальной зоне долек. За счет гнездной убыли тимоцитов визуализируются оптически пустые ячейки, сформированные отростками РЭК. В зонах «опустошений» располагаются немногочисленные макрофаги и лимфоциты. Снижается количество сформированных лимфоцитарно-эпителиальных модулей, что является морфологическим подтверждением нарушения дифференцировки лимфоцитов во внутренней кортикальной зоне долек тимуса. Нарушено формирование средними и большими лимфоцитами структур типа «сплошного» кольца вокруг светлых эпителиальных клеток. В данных структурах преобладают средние лимфоциты. Темные эпителиальные клетки расположены вокруг капилляров в виде очагов. Наряду с эпителиальными клетками к сосудам примыкают и лимфоциты. В перивенулярных пространствах, кроме единичных эпителиальных клеток темного типа, встречаются средние и малые лимфоциты (см. рис. 2, б).

На фоне резкого количественного снижения лимфоцитов в мозговом веществе тимических долек появляются немногочисленные макрофаги и интердигитирующие клетки. Доминирующими в мозговом веществе долек тимуса являются эпителиальные клетки. Гипертрофированные эпителиальные клетки светлого типа участвуют в формировании телец Гассаля. Вокруг формирующихся тимических телец располагаются эпителиальные клетки двух типов. Клетки первого типа со светлой цитоплазмой, с округлым ядром диаметром до 15 мкм и очаговой маргинацией хроматина в нем. Отличительным морфологическим признаком эпителиальных клеток второго типа является обнаружение в цитоплазме вакуолей, свидетельствующих о сохранении секреторной функции этого типа клеток.

Тельца Гассаля отличаются количественной, качественной и топографической вариабельностью. При втором варианте нарушения развития тимуса единичные тимические тельца контактируют с базальной мембраной капилляров и посткапиллярных венул. В мозговом веществе в 1,5 раза уменьшена удельная доля молодых телец на фоне увеличения до 36,3% количества окруженных волокнистой капсулой кистозно-трансформированных телец Гассаля. В центре последних определяются пылевидные петрификаты и фрагменты РЭК, лимфоцитов и нейтрофильных лейкоцитов. За счет повышенного образования кератогиалина диаметр отдельных тимических телец увеличивается и достигает 46-52 мкм.

У 18 (17,1%) новорожденных с ЭНМТ диагностирован третий вариант патоморфологических изменений тимуса. Центральный орган иммунной системы в 73,6% случаев аномальный по форме с нетипичной локализацией. Из аномалий формы органа выявлены такие отклонения от вариантов нормы, как трилистник, гипоплазия правой доли и наличие гипоплазированных долек в основании органа. У троих детей диагностирована эктопия ткани вилочковой железы в щитовидную. Аномалии формы сочетались с достоверным снижением органометрических параметров тимуса в основном за счет уменьшения объема паренхимы (53,18±0,34%; p<0,05). Из паренхимы в гипоплазированных тимусах сформированы округлые или овальные по форме мелкие дольки диаметром от 78 до

115 мкм.

К структурным особенностям вилочковой железы в третьей подгруппе следует отнести нарушение кортико-медуллярной дифференцировки, достоверное снижение количества лимфоцитов во внутренней кортикальной (61,4%) и двукратное - в медуллярной (37,9%) зонах долек. Количественное уменьшение лимфоцитов в дольках тимуса сочетается с двукратным уменьшением их плотности на единице площади. Показатель плотности клеток в субкапсулярной зоне составил 13,9, во внутренней кортикальной - 23,3 клетки. Количество лимфоцитов в мозговом веществе долек колебалось от 5 до 25 клеток. В субкапсулярной зоне отсутствуют пре-Т-лимфоциты, что свидетельствует о нарушении миграции предшественников лимфоцитов из красного костного мозга.

Результатом замедленного и незавершенного формирования долек является снижение удельного объема септ (2,13±0,13%) с расположением последних только в пределах субкапсулярной зоны. При данном варианте дисхроний тимуса удельный объем междольковой соединительной ткани увеличивается до 28,89±0,31%, что в 14 раз превышает аналогичный показатель в группе сравнения (см. рис. 2, в).

Нарушения тканевой дифференцировки сосудов, расположенных в интерстициальной ткани, проявляются гипоплазией мышечных и эластических структур в стенке стенозированных артерий. Венозное русло расширено, особенно в областях локализации полнокровных тонкостенных венозных коллекторов. В 38,7% случаев в межуточной ткани визуализируются очаговые скопления липоцитов, примыкающие к долькам тимуса. Жировая трансформация паренхимы субкапсулярных зон долек тимуса диагностирована в 27,8% случаев.

Форма, объем, диаметр и топографическая локализация телец Гассаля в тимусах третьей подгруппы отличались вариабельностью. Удельный объем тимических телец составил 2,63±0,09%. Параметры по сравнению с контрольной группой с тенденцией к снижению. Средний диаметр телец Гассаля колебался от 33 до 48 мкм и в среднем составил 36,7 мкм. Увеличение диаметра тимических телец связано с их кистозной трансформацией и формированием вокруг телец капсулы волокнистого типа. В единичных случаях объединение 2-3 телец в единое образование приводило к увеличению их диаметра от 480 до 750 мкм. Помимо мозгового вещества, тельца Гассаля располагаются и в периферических отделах долек (см. рис. 2, г).

Таким образом, в тимусах новорожденных с ЭНМТ, развивавшихся внутриутробно в условиях инфицирования, выявлены три варианта структурных изменений: нормопластический, ретардантный и диспластический. Нормопластический вариант развития тимуса характеризуется доминированием долек с завершенной зональной дифференцировкой, количественным увеличением телец Гассаля молодого и зрелого типов и преобладанием во внутренней кортикальной зоне средних форм лимфоцитов, формирующих рецепторы к антигенам CD1a, CD2, CD3. Достоверное (p<0,05) снижение органометрических параметров тимуса с уменьшением диаметра долек до

35 мм и менее, превалирование удельного объема коркового вещества (57,45%) над мозговым, отсутствие кортико-медуллярной дифференцировки в 36,4% долек, снижение до 69,8% удельного объема лимфоцитов, а также индекса экспрессии CD1а, CD3 Т-лимфоцитов и сформированных лимфоцитарно-эпителиальных модулей составляют структурную основу ретардантного типа дисхронии развития тимуса.

Дополнительными морфологическими признаками ретардантного типа дисхронии тимуса служат достоверное увеличение удельного объема интерстициальной ткани до 6,13±0,21%, низкое содержание в медии и базальной мембране крупных сосудов гликогена и нейтральных мукополисахаридов.

Подтверждением гормональной недостаточности и нарушения клеточного микроокружения тимоцитов при ретардантном варианте дисхроний развития тимуса являются двукратное снижение плотности расположения РЭК, уменьшение количества вакуолей и удельного объема гранулярного эндоплазматического ретикулума на фоне деструкции крист митохондрий, а также снижение количества и размеров телец Гассаля (менее 75 мкм). Вместе с тем основная масса телец соответствует фазе морфофункциональной зрелости.

К диагностическим морфологическим признакам диспластического варианта развития тимуса следует отнести аномалии формы (73,6%), эктопию и гипоплазию органа, двукратное уменьшение паренхиматозно-стромального коэффициента за счет преобладания мелких долек, окруженных широкими прослойками незрелой соединительной ткани. Отсутствие кортико-медуллярной дифференцировки в дольках, достоверное снижение количества и плотности расположения тимоцитов во всех морфофункциональных зонах, кистозная трансформация телец Гассаля на фоне достоверного снижения их удельного объема являются структурным подтверждением нарушения пролиферации и дифференцировки тимоцитов и истощения компенсаторных возможностей их клеточного окружения. Ретардация и диспластический варианты дисхроний развития тимуса диагностируются у 87,6% новорожденных с ЭНМТ, развивавшихся в условиях внутриутробного инфицирования.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Л.П.П., Л.В.К.

Сбор и обработка материала: Л.В.К.

Редактирование: С.Б.Н.

Конфликт интересов отсутствует.