Гепатоцеллюлярный рак (ГЦР) занимает одно из ведущих мест по уровню заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей [1, 2]. Основными методами лечения являются резекция и трансплантация печени, при этом выживаемость больных зависит от времени установки диагноза [3—5]. Более того, в большинстве случаев опухоль нерезектабельна [6].
В этой связи ГЦР относится к новообразованиям с быстрыми темпами роста и плохим прогнозом. Важная роль в развитии и прогрессировании ГЦР отводится процессам васкуляризации, т. е. образованию новых кровеносных сосудов и особенностям кровоснабжения, а к потенциальным способам лечения — разработка антиангиогенных препаратов. Поэтому выяснение механизмов развития, прогрессирования и коррекции заболевания, связанных с процессами ангиогенеза, является актуальной задачей [7, 8].
Цель настоящего обзора — анализ данных литературы о процессах ангиогенеза в ГЦР, морфологической их оценке и клинической значимости.
Опухолевыми сосудами в широком смысле слова называют все кровеносные сосуды, расположенные в толще опухоли, т. е. два типа сосудов. Во-первых, это кровеносные сосуды, пораженные в процессе роста опухолевой ткани, и, во-вторых, появившиеся в процессе онкогенеза. В узком специфическом значении опухолевый сосуд отражает проявление процессов ангиогенеза и обозначает новообразованные сосуды.
Известно, что процессы ангиогенеза необходимы для быстрого роста и увеличения размера опухолевой ткани, обеспечивая соответствующее поступление питательных веществ и кислорода [9]. В экспериментальных исследованиях установлено, что опухоли размером менее 1 мм являются, как правило, аваскулярными и поэтому растут очень медленно из-за недостатка кислорода и питательных веществ [10]. В случае развития ангиогенеза в ткани новообразования отмечается достаточно быстрое увеличение его размера [11]. С другой стороны, в результате ангиогенеза опухолевые клетки могут попадать в общий кровоток с последующим развитием отдаленных гематогенных метастазов [12].
Наиболее характерными признаками опухолевого ангиогенеза в ткани ГЦР считаются капилляризация синусоидов и артериализация ткани [8].
Капилляризация синусоидов представляет собой преобразование фенестрированных печеночных синусоидов в нефенестрированные капилляры с одновременным отложением ламинина и коллагена в перисинусоидном пространстве Диссе, приводящее к формированию базальной мембраны между эндотелием и гепатоцитами [13].
Нарушения структуры синусоидов, в частности фенестрации эндотелиальных клеток, описаны при первичном раке печени и наличии в ней метастазов как у животных, так и у человека. Значительное уменьшение количества фенестр в клетках синусоидов выявлено в экспериментах по моделированию опухолей путем введения опухолевых клеток меланомы B16F10, карциномы легкого Lewis и аденокарциномы толстой кишкой [14, 15]. Дефенестрация синусоидов в ткани ГЦР установлена и при изучении операционного материала больных [16].
К сожалению, до настоящего времени не выяснены основной механизм дефенестрации и ее клиническое значение. Вместе с тем в экспериментах на животных T. Nagura и соавт. [15] установили, что уменьшение числа фенестр в клетках синусоидов печени происходит при введении опухолевых клеток через брыжеечную вену, а не подкожно. Другие исследователи считают, что опухолевая дефенестрация обусловлена местными условиями и взаимодействиями с другими синусоидными клетками, поскольку уменьшение количества и размеров фенестр происходило в основном в III зоне печеночных ацинусов [14].
Уменьшение количества пор и участков типа решета в эндотелии синусоидов в ГЦР было продемонстрировано при электронно-микроскопическом исследовании [17]. Нами ранее было показано истончение отростков, а также уменьшение числа митохондрий, профилей цитоплазматической сети и пиноцитозных вакуолей [18]. Кроме этого, в эндотелиальных клетках в толще ГЦР имелись тельца Вейбеля—Палада (Weibel—Palade), характерные для эндотелия сосудов, но отсутствующие в нормальных печеночных синусоидных эндотелиоцитах [19].
Превращение нормальных фенестрированных синусоидов печени в нефенестрированные капилляры сопровождается появлением в эндотелиальных клетках положительной экспрессии CD34 [20]. Считается, что эндотелиальные клетки синусоидов нормальной ткани печени не реагируют с CD34. Однако, по данным отдельных исследователей [21, 22], в синусоидах нормальной печени хотя и редко, но отмечается положительная экспрессия CD34. Более того, капилляризация синусоидов и положительная реакция с антителами CD34 наблюдаются при формировании цирроза печени [23].
Развитие процессов капилляризации синусоидов обусловлено, по мнению M. Kin и соавт. [13], изменениями кровоснабжения в виде увеличения доли притока артериальной крови. В подтверждение авторы приводят данные о признаках капилляризации синусоидов в толще очаговой узловой гиперплазии и в ткани гиперпластических узелков при алкогольном циррозе печени, полагая, что они вызваны локальным увеличением притока артериальной крови из-за аномально расположенных сосудов [24].
Процессы капилляризации синусоидов взаимосвязаны и со степенью злокачественности новообразования. В участках высокодифференцированного ГЦР встречаются как обычные синусоиды, так и микрососуды капиллярного типа, а при низкодифференцированной форме — только капилляры [25]. При этом синусоиды в высокодифференцированном ГЦР характеризуются неполной капилляризацией: положительные реакции на CD34 и ламинин являются слабыми и только местами. В процессе дедифференцировки отмечается увеличение участков с CD34-положительной реакцией и развитие признаков полной капилляризации, как это отмечается в умереннодифференцированном ГЦР.
Следует также добавить, что, по мнению M. Kojiro [17], вышеописанные изменения синусоидов в ткани ГЦР целесообразней называть синусоидоподобными пространствами или опухолевыми синусоидами.
Артериализацией или артериогенезом ткани ГЦР обозначают образование новых коллатеральных артерий, выстланных гладкими мышечными клетками, из ранее существовавших [26]. В нормальной ткани печени печеночные артерии проходят в портальных трактах и сопровождаются желчными протоками. Опухолевые артериальные сосуды расположены в толще опухоли и не сопровождаются желчными протоками, вследствие чего их называют непарными артериями. Наличие таких непарных артерий используется для дифференциальной диагностики опухолевых узелков от участков регенерации при циррозе печени [27].
Для выявления таких непарных артерий рекомендуется иммуногистохимическое окрашивание с антителами гладкомышечного актина альфа [28]. При этом толщина гладкомышечного слоя коррелирует с калибром сосуда. Более отчетливо они визуализируются при двойном иммунном окрашивании с антителами гладкомышечного актина альфа и CD34. В отличие от нормальных артерий в непарных сосудах наблюдаются лишь отдельные эластические волокна или полное их отсутствие, что предполагает их функциональные отличия.
Примечательно, что количество непарных артерий постепенно увеличивается по мере озлокачествления от диспластических узелков со слабой дисплазией к узелкам с выраженной дисплазией, наибольшее их количество отмечается в ткани ГЦР. В процессе онкогенеза ГЦР непарные артерии образуются в виде ветвей печеночных артерий вокруг портальных трактов в толще опухоли. В процессе роста новообразования внутриопухолевые портальные тракты подвергаются инвазии и уменьшаются в количестве, вследствие чего артериальные опухолевые сосуды начинают прорастать в опухоль от печеночных артерий, расположенных вокруг опухоли. При этом количество непарных артерий на единицу площади опухолевой ткани на ранней стадии (менее 1,5 см в диаметре) развития новообразования составляет порядка 60% от показателей выраженного ГЦР [17].
Вышеописанные нарушения структуры синусоидов и формирование новых сосудов в процессе развития ГЦР закономерно приводят к изменениям кровоснабжения опухолевого узла.
Известно, что в нормальных условиях печень получает двойное кровоснабжение: 75—80% крови поступает по воротной вене, 20—25% — по печеночной артерии. Аналогичным образом происходит кровоснабжение регенеративных и диспластичных узелков [20, 29]. В узлах ГЦР основной приток крови осуществляется по печеночной артерии для обеспечения кислородом прогрессирующего роста опухолевых клеток. В результате изучения особенностей гемодинамики ГЦР методом компьютерно-томографической (КТ) артериопортографии O. Matsui и соавт. [30] установили, что в опухолях отмечается тенденция прогрессирующего снижения портального кровоснабжения и увеличения поступления артериальной крови по мере повышения степени злокачественности.
По данным Т. Yamamoto и соавт. [25], высокодифференцированные ГЦР размером менее 3 см достаточно часто кровоснабжаются преимущественно портальной венозной кровью, тогда как во всех наблюдениях умеренно- и низкодифференцированного рака кровоснабжение осуществляется печеночной артерией. В то же время большинство опухолевых узлов ГЦР размером более 3 см, включая высокодифференцированные формы, имеет преимущественно артериальное кровоснабжение. На основании проведенных нами компьютерно-томографических и морфологических сопоставлений показано, что наиболее васкулярным образованием среди изученных форм ГЦР является высокодифференцированный, а наименее васкулярным — низкодифференцированный вариант рака [31].
В основе подобных изменений лежит прогрессирующее уменьшение количества внутриопухолевых портальных трактов, отражающее процессы опухолевой дедифференцировки. Действительно, характерной особенностью высокодифференцированного раннего ГЦР является наличие портальных трактов в пределах опухоли, означающее, что опухоль кровоснабжается не только через новообразованные непарные артерии, но и ветвями печеночной артерии и воротной вены, проходящими в портальных трактах. Однако количество внутриопухолевых портальных трактов уменьшается по мере увеличения размера новообразования от 0,155 в 1 мм в опухолях диаметром 1,1—1,5 см до 0,058 мм в узлах размером 1,6—2,0 см [24].
Кровоснабжение периферических участков опухолей, не имеющих четкой капсулы, возможно через соустья между синусоидоподобными пространствами опухолевой ткани и синусоидами прилежащей ткани печени [17]. Видимо, данное обстоятельство и объясняет жизнеспособность периферически расположенных участков ГЦР после артериальной химиоэмболизации.
Необходимо добавить, что повышение плотности узла ГЦР при КТ с использованием контрастного вещества коррелирует с количеством микрососудов в его ткани, определяемым на иммуногистохимических препаратах [8, 32]. При этом увеличение степени васкуляризации в процессе опухолевой прогрессии ГЦР сопровождается изменениями и характеристик КТ [33, 34]. В связи с этим особое значение приобретают неинвазивные методы оценки васкуляризации для дифференциальной диагностики и определения эффективности лечения ГЦР.
Существенным моментом при морфологическом изучении биопсийного и операционного материала является четкая оценка васкуляризации ткани опухоли. В онкоморфологии в качестве показателя выраженности процессов ангиогенеза чаще всего используется плотность микрососудов (ПМС), определяемая на иммуногистохимических препаратах с использованием маркеров эндотелиальных клеток [35]. Сначала на препаратах при малом увеличении микроскопа определяют так называемые горячие точки, представляющие участки ткани с максимальной васкуляризацией (наибольшим числом сосудов). Затем в них при большом увеличением микроскопа проводят подсчет количества сосудов в поле зрения [36].
В качестве маркеров эндотелиоцитов в ткани ГЦР используются CD34, CD31 и фактор Виллебранда [37, 38]. Однако иммуногистохимические маркеры синусоидальных эндотелиальных клеток по-разному экспрессируются в нормальной и пораженной паренхиме.
Так, по данным иммуногистохимического исследования, эндотелиальные клетки при циррозе печени и в диспластических узелках характеризуются отрицательной реакцией с антителами CD31, CD34 и BNH9, но экспрессируют их в ткани ГЦР [23]. Однако при экспериментальном моделировании цирроза печени путем перевязки желчного протока было отмечено повышение уровня экспрессии CD31 в эндотелиоцитах, на основании чего авторы высказали предположение о развитии ангиогенеза при предопухолевых поражениях [39].
При анализе 43 образцов ткани ГЦР интенсивное окрашивание синусоидных сосудов отмечалось во всех наблюдениях при использовании антител CD34. В то же время положительная реакция фактора Виллебранда имелась в синусоидах единичных наблюдений и в крупных сосудах 18 образцов [37]. В связи с этим для оценки онкогенеза в опухолях печени наиболее часто используются антитела CD34. Несмотря на то что CD34 относится к панэндотелиальным маркерам и не является специфическим маркером неоангиогенеза, данная реакция используется для дифференциальной диагностики новообразований печени и определения прогноза заболевания [40].
По данным литературы [44], показатели ПМС, выявленные при помощи антител CD34, в ткани раннего ГЦР (0,043±0,027) превышают таковые в регенеративных (0,007±0,006) и диспластичных (0,011±0,009) узелках гепатоцитов. Аналогичные результаты были получены I. Chebib и соавт. [22]. Вышеуказанные изменения подтверждают приведенные ранее данные об изменении иммунофенотипа эндотелиальных клеток в процессе гепатоканцерогенеза. Согласно нашим проведенным выше исследованиям, степень васкуляризации ГЦР зависит от степени его гистологической дифференцировки: при уменьшении степени дифференцировки ГЦР отмечается прогрессирующее снижение числа кровеносных сосудов [41].
При помощи множественного регрессионного анализа установлено, что среди изученных параметров ГЦР только размер опухоли коррелировал с показателями плотности CD34-положительных сосудов. Так, средние значения ПМС в узлах диаметром менее 5 см (316/0,74 мм) более чем в 2 раза превышали таковые (146/0,74 мм) в опухолях размером более 5 см (<0,001) [38].
Следует также отметить, что максимальные значения ПМС отмечаются в периферических участках ГЦР [38]. Показатели ПМС в ткани ГЦР, развившегося на фоне гепатита С (54±13,8), превышают соответствующие значения для ГЦР, обусловленного гепатитом В (38±8,9) [42]. Кроме того, у детей, страдающих ГЦР, ПМС значимо больше по сравнению со взрослыми пациентами (36,94 и 26,52; <0,05), однако не имеет значимых различий с другими детскими злокачественными новообразованиями [43].
Более специфичным иммуногистохимическим показателем процессов ангиогенеза по сравнению с CD34 считается эндоглин (CD105), являющийся гомодимерным мембранным гликопротеином, способным взаимодействовать с трансформирующим фактором роста β1 и β3 и усиливать пролиферацию эндотелиоцитов. По мнению J. Paschoal и соавт. [44], СD105 экспрессируется в активированных эндотелиальных клетках, маркируя тем самым только участки неоангиогенеза.
Практически при всех сравнительных иммуногистохимических исследованиях сосудов в ткани ГЦР отмечаются более низкие уровни экспрессии CD105 по сравнению с CD34 [21, 45]. При этом наибольшее количество сосудов в поле зрения установлено нами при умереннодифференцированном ГЦР, а наименьшее — при низкодифференцированной форме [41].
Эндотелиоциты синусоидов нормальной ткани печени характеризуются отрицательной реакцией с антителами CD105 [21]. В то же время при изучении ГЦР, развившегося на фоне цирроза печени, максимальные значения плотности CD105-положительных микрососудов (191,12) наблюдались в ткани печени на значительном (более 5 см) отдалении от узла ГЦР, в периопухолевых (в 2 см от опухоли) участках показатели были несколько ниже (153,12), минимальные значения (19,0) отмечались в узле ГЦР [45]. Примечательно, что у больных циррозом печени зарегистрировано значительное повышение концентрации CD105 в сыворотке крови по сравнению со здоровыми лицами [46].
Появление положительной экспрессии CD105 в эндотелии при циррозе печени объясняют тем, что в условиях гипоксии, повреждения и регенерации гепатоцитов эндотелиальные клетки синусоидов приобретают иммунофенотип новообразованных сосудов [47]. Кроме того, положительная реакция с эндоглином, степень повышения которой сочеталась с прогрессированием процессов фиброза печени у пациентов, страдающих хроническим гепатитом С [48], описана в звездчатых клетках.
Справедливости ради следует отметить, что, несмотря на выявленные различия в уровнях экспрессии CD105 в регенеративных (ПМС=0,131), диспластичных (ПМС=0,087) узелках гепатоцитов и в участках ГЦР (ПМС=0,037), J. Paschoal и соавт. [44] не рекомендуют использовать это для дифференциальной диагностики.
В то же время показатели ПМС советуют использовать для оценки прогноза течения заболевания. Так, при анализе 43 образцов ткани ГЦР было установлено, что ПМС, выявленных при помощи антител CD34, является независимым фактором прогноза выживаемости больных после резекции ГЦР [17]. Однако при сравнительном анализе ПМС на иммуногистохимических препаратах с CD34 и фактором Виллебранда лишь последний коррелировал с полным излечением больных после резекции ГЦР [49]. В другом аналогичном исследовании 40 пациентов, перенесших резекцию печени по поводу ГЦР, отсутствовали корреляции между плотностью CD34-положительных сосудов и клиническими показателями опухолевой прогрессии (стадией новообразования и инвазией в воротную вену) [50].
Высокие значения ПМС, выявленные при помощи антител к фактору Виллебранда, сочетались с ранним развитием рецидивов после резекции ГЦР [51]. В двух независимых исследованиях больных, перенесших резекцию печени по поводу ГЦР размером не более 5 см, было установлено, что бóльшие значения плотности CD34-положительных микрососудов ассоциируются с меньшим периодом безрецидивного течения [52]. Трехлетняя выживаемость больных ГЦР размером менее 5 см также зависела от степени васкуляризации: при низких значениях ПМС выжило 74% пациентов, при высоких — лишь 13%. При этом плотность сосудов, выявленных при помощи фактора Виллебранда, в крупных и мелких новообразованиях не коррелировала с прогнозом заболевания [38].
Несмотря на неоднозначность имеющихся данных, а порой и их противоречивость, мы согласны с мнением, что выраженность ангиогенеза в ткани ГЦР может явиться дополнительным критерием для оценки прогноза заболевания и назначения дополнительных лечебных мероприятий.
Следует отметить основные недостатки при использовании ПМС для оценки опухолевого ангиогенеза. Во-первых, это необходимость выбора так называемых горячих точек. Во-вторых, отсутствие единого протокола исследования, в частности, в отношении используемого маркера и увеличения микроскопа. В-третьих, возможность субъективных ошибок при подсчете количества микрососудов. Поэтому оценку ПМС рекомендуется проводить при помощи автоматизированных систем анализа изображений, существенно повышающих воспроизводимость и точность исследования [53].
Именно это, на наш взгляд, и является основной причиной поиска других показателей выраженности процессов ангиогенеза в новообразованиях вообще и в ГЦР в частности. Перспективным методом оценки является определение уровня экспрессии ангиогенных факторов роста. Для этого используется определение мРНК и/или белка определенного фактора роста в ткани или конкретных клетках. Дополнительно могут оцениваться концентрации ангиогенных факторов в сыворотке крови, поскольку в большинстве своем они являются растворимыми белками, секретированными в повышенных количествах при злокачественных новообразованиях [54]. В отношении ГЦР на сегодняшний день имеется целый ряд полноценных обзоров литературы, посвященных анализу механизмов действия про- и противоангиогенных факторов [8, 55].
Таким образом, нарушения васкуляризации в виде капилляризации синусоидов и образования непарных артерий играют важную роль в развитии и прогрессировании ГЦР. Морфологическим показателем выраженности процессов ангиогенеза является ПМС, выявляемых иммуногистохимическими методами. Повышение степени злокачественности ГЦР сопровождается изменениями ее васкуляризации и сочетается с прогрессирующим увеличением доли крови, поступающей по печеночной артерии, и соответственно уменьшением притока по системе воротной вены. При этом ПМС рекомендуется использовать в качестве дополнительного критерия для определения прогноза заболевания, а также при разработке таргетных антиангиогенных препаратов и оценке эффективности проводимой терапии.
Конфликт интересов отсутствует.