Влияние реваскуляризации конечности и терапевтического ангиогенеза на уровень ангиогенных факторов

Заболевания периферических артерий нижних конечностей атеросклеротического генеза продолжают оставаться актуальной проблемой для сосудистой хирургии. Частота атеросклеротического поражения артерий нижних конечностей проградиентно увеличивается в соответствии с возрастом пациента и составляет практически 20% среди лиц старше 55 лет. В то же время распространенность перемежающей хромоты (ПХ) как основного симптома поражения артерий нижних конечностей составляет около 4,5% в данной возрастной группе [1].

В связи с относительно легко переносимыми симптомами ПХ большинство пациентов не склонны обращаться за помощью и не воспринимают критично свое состояние здоровья, а при обращении к врачу пациенты с ПХ редко попадают на прием к сосудистому хирургу, зачастую останавливаясь на консультации специалистов широкого профиля и полученной неспецифической терапии. В подавляющем большинстве случаев необходимость специализированной помощи у пациентов данной группы возникает уже при появлении симптомов критической ишемии нижних конечностей (КИНК) (боль в покое и/или язвенно-некротические процессы на стопе). Распространенность КИНК составляет 150 случаев на 100 тыс населения [2].

Согласно Национальным рекомендациям, пациенты с КИНК должны подвергаться незамедлительной оценке и устранению факторов, которые повышают риск ампутации, и рассматриваться кандидатами для прямой реваскуляризации конечности. Своевременно выполненное оперативное вмешательство позволяет быстро купировать явления ишемии и обеспечить адекватную перфузию на уровне микроциркуляторного русла.

К сожалению, даже своевременно выполненное вмешательство не может полностью решить проблемы, связанные с прогрессированием заболевания.

Наиболее эффективным открытым оперативным вмешательством на артериях бедренно-подколенного сегмента является аутовенозное шунтирование, но даже при данной операции 5-летняя проходимость шунтов составляет 60%, а в случае использования в качестве шунта синтетического трансплантата — <35% [3].

Проходимость после баллонной ангиопластики как наиболее распространенного эндоваскулярного вмешательства на артериях бедренно-подколенного сегмента составила 69,5 и 45,1% для баллонов с лекарственным покрытием и без него в течение 3 лет соответственно [4].

Таким образом, существует потребность в поиске новых методик, которые позволили бы улучшить результаты лечения пациентов с КИНК.

Использование проангиогенных факторов роста является перспективным направлением для изучения в контексте данной патологии. Накоплен определенный опыт плацебо-контролируемых исследований в отношении использования сосудистого эндотелиального фактора роста (vascular endothelial growth factor, VEGF165), фактора роста гепатоцитов (hepatocyte growth factor, HGF), фактора роста фибробластов (basic fibroblast growth factor, bFGF), которые помогали снижать болевую симптоматику, улучшать качество жизни, увеличивать дистанцию безболевой ходьбы и показатели лодыжечно-плечевого индекса и транскутанного напряжения кислорода [5—7].

При этом наиболее изученным фактором роста в контексте контролируемых рандомизированных исследований является VEGF. Ограничение силы данных исследований заключается в том, что проангиогенные факторы использовались в них только в составе комплексной терапии и у пациентов с ПХ.

Существует ограниченное количество работ, связанных с использованием факторов роста у пациентов с КИНК, прежде всего по причине того, что терапевтический эффект при данных методиках развивается только через несколько недель после использования, в то время как пациентам с КИНК необходимо срочное улучшение перфузии конечности [8].

Анализ исследований, в которых стимуляция ангиогенеза используется в послеоперационном периоде, также показывает улучшение качества жизни пациентов и инструментальных показателей компенсации кровообращения и позволяет сделать вывод о перспективах данного направления [9].

Ангиогенные факторы стимулируют развитие новых сосудов и восстановление кровотока. VEGF является ключевым регулятором ангиогенеза, активирует эндотелиальные клетки, стимулируя их миграцию, пролиферацию и образование новых капилляров. Фактор роста тромбоцитов (PDGF), который участвует в стабилизации сосудов, привлекая гладкомышечные клетки и перициты, делает сосуды функциональными и долговечными. Сочетание PDGF с VEGF улучшало стабильность и функциональность сосудистых структур, а комбинированная терапия (VEGF+PDGF) демонстрирует синергический эффект в доклинических исследованиях [10, 11].

Гипоксией индуцируемый фактор (hypoxia-inducible factor 1-alpha, HIF1a) является транскрипционным фактором, активирующим экспрессию генов, ответственных за адаптацию к гипоксии, включая VEGF. Таким образом, активация HIF1a рассматривается как стратегия для индукции ангиогенеза в условиях ишемии [12—14].

Данная работа является продолжением нашего исследования ангиогенных факторов в послеоперационном периоде у пациентов с периферическим атеросклерозом, но в отличие от предыдущей работы позволяет оценить влияние генной индукции на вышеизложенные процессы [15].

По данным литературы, уровень проангиогенных факторов у пациентов с критической ишемией повышен относительно здоровых пациентов, что объясняется длительно существующей ишемией конечности и необходимостью образования коллатеральных сосудов для улучшения общей перфузии и снижения степени кислородного голодания тканей [16, 17]. Степень коллатерализации играет важную роль в прогнозе течения заболевания, например позволяя пациентам с подпочечной окклюзией аорты при синдроме Лериша длительное время находиться в стадии ПХ и не переходить в состояние критической ишемии.

При этом в случае оперативного вмешательства и успешно выполненной реконструкции происходит снижение концентрации факторов ангиогенеза вследствие купирования ишемии, процесс ангиогенеза фактически «останавливается» на все время функционирования зоны реконструкции, что было доказано в нашей предыдущей работе [15]. Именно с данным фактом связан регресс ишемии к дооперационному уровню при окклюзии зоны оперативного вмешательства, а при тромботических осложнениях зачастую возникает и более тяжелая ишемия вследствие закрытия ранее функционирующих дополнительных коллатеральных сосудов.

Поэтому длительное течение критической ишемии чаще позволяет сохранить конечность пациента, а дозированная ходьба входит в рекомендации первой линии лечения пациентов с ПХ с уровнем убедительности рекомендаций A и уровнем достоверности доказательств 1 [18]. Дозированная ходьба по факту является методикой ишемического прекондиционирования и за счет данного механизма позволяет улучшить толерантность тканей к гипоксии.

Научная гипотеза нашей работы: у пациентов после успешной реваскуляризации конечности происходит снижение ангиогенных факторов, что приводит к ингибированию ангиогенеза и снижению скорости формирования коллатеральных сосудов. Средних срок функционирования зоны реконструкции составляет менее 5 лет, следовательно, использование генной индукции ангиогенеза в данный период времени позволит увеличить концентрацию ангиогенных факторов и усилить формирование коллатеральных сосудов. Данная методика позволит улучшить результаты лечения пациентов, что было показано в наших предыдущих работах, где использование дополнительных методов терапевтического ангиогенеза в послеоперационном периоде не влияло на проходимость зоны реконструкции, но позволяло уменьшить количество ампутаций [9].

Цель исследования — оценка динамики проангиогенных факторов (HIF1a, VEGF, PDGF) после успешно выполненной реконструкции в сравнении с дополнительной индукцией ангиогенеза.

В исследование были включены 30 пациентов, которым выполняли реконструктивно-восстановительное оперативное вмешательство на артериях нижних конечностей с послеоперационной генной индукцией. Кроме того, проведено ретроспективное сравнение с результатами нашей предыдущей работы, в которой анализировали данные 30 пациентов, прооперированных по поводу КИНК без послеоперационной индукции ангиогенеза.

Все пациенты имели клиническую картину КИНК. От всех пациентов было получено письменное согласие на участие в исследовании и публикацию результатов.

Исследование проведено на базе клиники ФГБОУ ВО «РязГМУ» Минздрава России в соответствии с Хельсинкской декларацией. Предварительно работа была одобрена локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «РязГМУ» для исследований с участием человека (протокол №6 от 06.02.2015).

Набор пациентов в группу осуществляли по следующим критериям: лица мужского или женского пола в возрасте от 40 до 80 лет, имеющие клиническую картину КИНК, подтвержденную инструментальными методами диагностики (лодыжечно-плечевой индекс <0,5; транскутанное напряжение кислорода и/или пальцевое артериальное давление <30 мм рт.ст.), и пригодное для реконструкции периферическое артериальное русло по данным МСКТ или периферической аортоартериографии, планируемое оперативное вмешательство, приверженность пациента лечению и готовность находиться под наблюдением в течение всего периода исследования.

Критериями исключения из исследования являлись: планируемая непрямая реваскуляризация конечности, неудовлетворительное для реконструкции периферическое русло (отсутствие хотя бы одной целевой артерии для реваскуляризации, что по шкале Рутерфорда соответствовало 7,5—10 баллам), наличие срочных показаний к ампутации (влажная гангрена), в том числе к малой ампутации одномоментно с реваскуляризацией или в раннем послеоперационном периоде; наличие в анамнезе онкологических заболеваний, беременность, отсутствие приверженности пациента лечению.

После предварительного отбора пациентов производили забор венозной крови в предоперационном периоде и проводили открытое оперативное вмешательство. Далее осуществляли наблюдение за пациентами в раннем послеоперационном периоде на протяжении 5—7 сут для оценки ранних послеоперационных осложнений. При отсутствии последних проводили геннотерапевтическую индукцию ангиогенеза препаратом в виде сверхскрученной формы плазмиды pCMV-VEGF165, содержащим сосудистый эндотелиальный фактор роста человека под контролем промотора (управляющего участка ДНК), в дозировке 1,2 мкг. Введение препарата осуществляли внутримышечно в ишемизированную конечность (5 инъекций в группу переднеберцовых мышц и икроножную мышцу). Данную манипуляцию проводили дважды с интервалом в 14 сут. Далее в течение 1 года проводили наблюдение за пациентами.

Оценку концентрации в крови основных проангиогенных факторов (VEGF, PDGF, HIF1a) проводили на контрольных точках: до операции, через 5—7 сут после введения первой дозы препарата и далее через 1, 3, 6 мес и 1 год (рис. 1).

Рис. 1. Дизайн исследования.

В окончательную статистику были включены данные только тех пациентов, у которых в течение 1 года наблюдения не зарегистрировано осложнений после оперативных вмешательств, а также оставалась проходимой зона реконструкции. При возникновении раннего (тромбоз протеза, кровотечение) или позднего (тромбоз протеза вследствие гиперплазии интимы, критический стеноз анастомоза, гнойно-септические осложнения) послеоперационного осложнения пациенты выбывали из исследования, их данные не включали в обработку. Таким образом, удалось получить выборку пациентов, у которых в течение всего срока наблюдения были купированы проявления ишемии, так как последние в свою очередь могли бы повлиять на срез полученных данных и их интерпретацию.

Средний возраст пациентов составил 67±5 лет. В исследовании приняли участие 23 (77%) мужчины и 7 (23%) женщин. Из сопутствующих заболеваний наиболее часто выявлялись гипертоническая болезнь (25 (83%) человек), сахарный диабет (12 (40%)), ишемическая болезнь сердца (10 (33,3%)), хронические болезни легких (7 (23%)).

Анализ данных и их статистическую обработку проводили с помощью средств ЭВМ, программ MS Word, MS Exel, Statistica 10. Для определения нормальности распределения признака в исследуемой группе производили анализ распределения признака с помощью критерия Шапиро—Уилка. Внутригрупповой анализ полученных данных для зависимых групп выполняли с помощью t-критерия Стьюдента при нормальном распределении признака и критерия Вилкоксона при ненормальном распределении.

В нашем исследовании удалось проанализировать концентрацию трех проангиогенных факторов в крови пациентов, получавших генную индукцию ангиогенеза в послеоперационном периоде и в течение 1 года, а также оценить динамику изменения их концентрации в крови.

Наиболее интересной представляется оценка изменения концентраций факторов ангиогенеза в раннем послеоперационном периоде в связи с увеличением перфузии конечности и перестройкой тканевых процессов метаболизма, купированием явлений ишемии, увеличением общего объема циркулирующей крови, открытием «молчащих» участков капилляров на уровне микроциркуляции. Также интересной представляется оценка количества проангиогенных факторов в ответ на терапевтическую стимуляцию ангиогенеза. В ходе исследования нами были получены результаты лечения пациентов (табл. 1), которые также были сопоставлены с результатами предыдущей работы (табл. 2).

Таблица 1. Динамика проангиогенных факторов со стимуляцией ангиогенеза

Примечание. Здесь и в табл. 2, 3: * — статистически достоверные различия.

Таблица 2. Динамика проангиогенных факторов без стимуляции ангиогенеза

В двух приведенных выше таблицах и далее на графиках мы видим изначально различные концентрации трех факторов по причине использования в двух работах реактивов разных фирм-производителей, так как работы выполнялись последовательно, а не параллельно, и в ходе исследования возникла необходимость замены ушедших с российского рынка поставщиков реактивов. При этом методология определения концентрации метаболитов в обоих случаях была идентичной (иммуноферментный анализ).

Индуцированный гипоксией фактор является одним из главных метаболитов, который в первую очередь реагирует на изменение концентрации кислорода в тканях.

Исходная концентрация HIF1a в группе с генной индукцией до операции составила 0,2433±0,34 нг/мл. Далее в раннем послеоперационном периоде после первой процедуры стимуляции ангиогенеза происходило незначительное снижение концентрации до 0,2377±0,02 нг/мл, что может быть обусловлено началом купирования ишемических явлений и повышением концентрации кислорода. При дальнейшем наблюдении после второй процедуры индукции ангиогенеза концентрация HIF1a повышалась до 0,2644±0,04 нг/мл, что может быть связано с опосредованным влиянием репликации плазмидной ДНК в клетках пациента, выделением VEGF165 и протеканием процессов ангиогенеза в тканях за счет терапевтической генной стимуляции.

К 3 мес наблюдения концентрация гипоксией индуцируемого фактора снижалась до 0,2286±0,07 нг/мл, что являлось статистически значимым снижением по сравнению с визитами как через 10—14 сут, так и через 1 мес (p<0,05). Данное снижение можно объяснить окончанием выделения генов VEGF плазмидой, которая, по данным производителя, способна реплицироваться в клетках на сроках до нескольких недель, а также удовлетворительной концентрацией кислорода в тканях в условиях функционирующей реконструкции и, как следствие, отсутствием явлений ишемии как главного индуктора повышения концентрации HIF1a.

Далее на сроках наблюдения в 6 мес и 1 год наблюдается повышение концентрации данного фактора до 0,2315±0,02 и 0,2707±0,04 нг/мл соответственно. Динамика повышения концентрации фактора для визита в 6 мес является статистически значимой относительно 3 мес наблюдения (p<0,05), а для 1 года — относительно 6 мес (p<0,05). При этом не получено значимых различий относительно исходного уровня (табл. 3).

Таблица 3. Внутригрупповое сравнение между всеми визитами (p) при стимуляции ангиогенеза

Данные колебания концентрации HIF1a можно объяснить тем фактом, что происходит восстановление потенциальных возможностей ангиогенеза в связи с окончанием перестройки и ремоделирования тканей и сосудов микроциркуляторного русла после перенесенного вмешательства. Также данные изменения могут свидетельствовать о прогрессировании заболевания, поражении сосудов атеросклеротическим процессом и началом снижения общей перфузии конечности и нарастанием явлений гипоксии. Сильное повышение концентрации данного фактора в теории может рассматриваться как предиктор неблагоприятного течения атеросклероза и неблагоприятного прогноза по сохранению проходимости зоны реконструкции.

При сравнении изменений концентрации HIF1a с пациентами контрольной группы стоит обратить внимание, что при генной индукции ангиогенеза не происходило настолько значимого снижения концентрации по сравнению с контрольной группой (снижение от исходного на 2,3% в исследуемой группе и на 27% в контрольной группе). Это может быть опосредованно связано с увеличением концентрации VEGF вследствие его репликации (рис. 2, а).

Рис. 2. Динамика изменения ангиогенных факторов.

а — гипоксией индуцируемый фактор (HIF1а); б — фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); в — фактор роста тромбоцитов (PDGB).

Сосудистый эндотелиальный фактор роста является одним из наиболее изученных проангиогенных факторов и считается наиболее значимым для любых процессов, связанных с ростом сосудов, будь то неоангигонегез, ангиогенез или артериогенез. VEGF первым под воздействием HIF активирует процессы миграции и пролиферации клеток эндотелия, увеличивает экспрессию активаторов плазминогена и сосудистую проницаемость. Также VEGF обеспечивает вазодилатацию капилляров, притягивает моноциты и стимулирует мобилизацию из костного мозга прогениторных клеток-предшественников.

В нашей работе именно VEGF являлся точкой приложений генной терапии, поэтому динамика изменения его концентрации является наиболее интересной. Исходная концентрация VEGF составила 103,6±15,7 пг/мл. Далее в послеоперационном периоде и после первой процедуры стимуляции ангиогенеза данный показатель составил 148,3±22,9 пг/мл. Таким образом, уже в раннем послеоперационном периоде мы видим повышение концентрации данного фактора, хотя логично было бы предположить уменьшение концентрации в связи с отсутствием ишемии в тканях. На следующем контрольном визите после второй процедуры терапевтического ангиогенеза концентрация VEGF увеличилась еще больше и составила 155,4±17,9 пг/мл, что уже явилось статистически значимым приростом относительно исходного уровня (p<0,05). Учитывая повышение концентрации VEGF в течение данного периода наблюдения, можно провести прямую параллель с проведением терапевтического ангиогенеза и его влиянием на данный показатель. К 3 мес наблюдения концентрация VEGF начинает снижаться до 138,6±18,8 пг/мл, но еще не падает до исходного уровня, что, по нашему мнению, связано с окончанием репликации VEGF165 в клетках. Через 6 мес концентрация данного фактора продолжает снижаться, достигая 90,6±11,3 пг/мл, что значимо меньше показателя через 1 мес и относительно предыдущего визита (p<0,05). К 1 году наблюдения концентрация VEGF становится минимальной (79,0±6,6 пг/мл), данный уровень также является значимо меньшим по отношению к концентрации на визите в 1 мес (см. табл. 3). Кривая концентрации VEGF в организме человека показывает положительный ответ на генную индукцию ангиогенеза в раннем послеоперационном периоде. Уменьшение концентрации на сроках от 3 мес до 1 года, по-видимому, обусловлено отсутствием гипоксии и ишемии как основных пусковых факторов для выработки эндогенного VEGF. Также в пользу данной теории говорит снижение концентрации HIF1a на визитах в 3 и 6 мес, которые были рассмотрены ранее.

При сопоставлении данных результатов с группой контроля получены наиболее видимые различия. Концентрация VEGF в группе контроля достигала минимума к 1-му месяцу наблюдения (от 728 пг/мл исходно до 552,2 пг/мл на 10—14-е сутки и 480,7 пг/мл к 1-му месяцу, p=0,025), что в относительных цифрах составило 33%. Далее на протяжении всего срока наблюдения данный параметр не возвращался к исходному уровню, а оставался сниженным. В группе исследования данный показатель не падал, а возрастал, и к 1-му месяцу наблюдения прирост составил 50,5% (рис. 2, б).

Тромбоцитарный фактор роста содержится в α-гранулах тромбоцитов и освобождается при их активации. Он играет важную роль в ангиогенезе в связи со способностью стимулировать пролиферацию клеток гладкой мышечной ткани. PDGF также увеличивает продукцию компонентов соединительной ткани, таких как гликозаминогликаны и коллаген. Таким образом, данный фактор участвует в стабилизации новообразованных сосудов и помогает их «созреванию», превращая полую трубку, выстланную эндотелием, в полноценный функционирующий сосуд. Кроме того, PDGF принадлежит роль в предупреждении неконтролируемого патологического ангиогенеза.

В нашем исследовании исходная концентрация PDGF составила 2839,8±93,3 пг/мл. В раннем послеоперационном периоде и на визите в 1-й месяц наблюдения его концентрация постепенно снижалась до 2585,1±135,9 и 2665,8±61,8 пг/мл соответственно. Это, на наш взгляд, также обусловлено отсутствием гипоксии в тканях и влияния селективной экспрессии VEGF165 в клетках организма на продукцию PDGF. К 3 мес наблюдения уровень тромбоцитарного фактора роста незначительно повышался до 2742,5±73,7 пг/мл, но не достигал исходных значений. Повышение концентрации PDGF к 3 мес наблюдения может быть обусловлено отсроченной ответной реакцией на активную стимуляцию ангиогенеза в раннем послеоперационном периоде и образованием большого количества новых коллатералей, для укрепления которых данный фактор является необходимым. При дальнейшем наблюдении концентрация данного фактора снова начала снижаться, достигнув минимальных значений к 1 году (6 мес — 2655,2±48,6 пг/мл, p<0,05; 1 год — 2543,7±23,6 пг/мл, p<0,05). При этом для обоих визитов были получены статистически значимые снижения показателей относительно исходного уровня, а для 1 года также значимым оказалось снижение относительно визита в 3 мес наблюдения (см. табл. 3).

При сопоставлении результатов с контрольной группой по PDGF была получена схожая динамика. Концентрация данного метаболита в обеих группах снижалась в раннем послеоперационном периоде (на 9% в исследуемой группе, на 18% в группе контроля) с последующим незначительным приростом, но при этом оставалась ниже исходного уровня в обеих группах на всех сроках наблюдения (рис. 2, в).

Таким образом, при анализе всех 3 проангиогенных факторов можно сделать заключение о том, что генная индукция ангиогенеза в раннем послеоперационном периоде помогает избежать выраженного снижения концентрации VEGF в связи с купированием ишемии и гипоксии в послеоперационном периоде, что мы можем наблюдать в контрольной группе. Это опосредованно влияет и на HIF, который снижается в значительно меньшей степени по сравнению с контрольной группой. Однако повышение уровня VEFG не позволило избежать снижения концентрации PDFG, который является жизненно необходимым для образования стойких коллатеральных сосудов и их длительного функционирования. В то же время стоит отметить, что гипоксия и ишемия тканей являются очень сложным процессом. Они влияют не только на эндогенную экспрессию отдельных факторов ангиогенеза, но также способны запускать процессы воспаления, повреждения и репарации непосредственно в самих клетках и тканях, влиять на состояние микроциркуляторного русла и непосредственно скелетной мускулатуры. Необходимы дальнейший поиск путей внедрения различных ангиогенных факторов в организм человека и их комбинирование между собой для достижения наилучшего терапевтического эффекта.

Использование индукции VEGF в послеоперационном периоде при лечении хронической ишемии нижних конечностей позволяет избежать стойкого снижения концентрации данного фактора на ранних сроках после реконструкции. Высокая концентрация VEGF дает возможности для продолжения развития коллатералей, улучшения микроциркуляции, снижения общего периферического сопротивления сосудов, что в конечном итоге может улучшить результаты лечения пациентов. Репликация VEGF в организме человека замедляет снижение концентрации HIF1a в послеоперационном периоде, что также является положительным эффектом.

В то же время повышение VEGF не привело к приросту показателей PDGF, который также является важным звеном в ангиогенезе, в связи с чем необходимы дальнейшие поиски путей индукции PDGF.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.