Важным этапом прогрессии эпителиальных опухолей является эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП), приводящий к утрате эпителиальной дифференцировки и повышению миграционной способности клеток [1]. Данный процесс характеризуется разрушением адгезионных межклеточных контактов (с нарушением локализации и экспрессии Е-кадгерина и β-катенина) и повышением продукции мезенхимальных маркеров [2—8]. Такие клетки приобретают локомоторный фенотип [9], что повышает их способность к инвазии и метастазированию [10]. Повышенная подвижность опухолевых клеток связана с динамической реорганизацией цитоскелета и адгезионных структур [11]. В немышечных клетках актиновый цитоскелет представлен двумя функционально различными цитоплазматическими изоформами β и γ [12, 13]. β-Актин преобладает в стресс-фибриллах, кольцевых пучках, сократительных митотических кольцах и в зонах адгезионных межклеточных контактов, γ-актин образует кортикальную сеть, а также связан с плотными контактами [13, 14]. Ранее нами было показано, в том числе и на модели опухоли толстой кишки, что смещение баланса цитоплазматических актинов за счет уменьшения доли β-актина может приводить к ЭМП и усилению злокачественных характеристик опухолевых клеток [15].

Целью настоящей работы явилось выявление корреляций между клиническими характеристиками, уровнем риска прогрессии и рецидивирования аденокарцином толстой кишки (АТК) человека и опухолевыми маркерами, ассоциированными с ЭМП.

Материалом послужили образцы опухолевой ткани пациентов, оперированных в отделении хирургической онкологии ФГАУ «Лечебно-реабилитационный центр» Минздрава России с/без предварительной химиотерапии в 2014—2015 гг. В ходе исследования проанализировано 50 образцов АТК. Стадирование распространенности опухолевого процесса проводили в соответствии с классификацией TNM 7-го пересмотра. В качестве контроля (нормы) анализировали образец условно нормальной ткани (слизистого слоя кишки) того же пациента.

По прогнозу течения заболевания больных стратифицировали в 4 группы в соответствии с критериями, предложенными L. Gunderson и соавт. [16]: с низким, промежуточным, умеренно высоким и высоким риском развития рецидива заболевания после радикального лечения (табл. 1).

Для исследования использованы архивные образцы фиксированного формалином парафинового материала. Срезы депарафинировали, демаскировку антигенов проводили в растворе 0,01 M трис/0,001M ЭДTA; pH 9,0, в течение 20 мин при 95 °C. Срезы инкубировали со следующими антителами: мышиными, моноклональными к β-актину (MCA5775GA, «AbD Serotec»), γ-актину (MCA5776GA, «AbD Serotec»), Е-кадгерину (205602, «Calbiochem»), кавеолину-1 (AF5736, «R&D Systems») и β-катенину (М3539, «Dako»). В качестве вторых антител использованы антимышиные антитела козы, конъюгированные с флюорохромами AlexaFluor488, AlexaFluor546 («Invitrogen»). Образцы анализировали с помощью микроскопа Axioplan с использованием объектива 40х/0.75 Plan-Neofluar («Carl Zeiss», Германия). Оценку интенсивности флюоресценции проводили с помощью программы Image J. Интенсивность флюоресценции опухолевых клеток была нормирована относительно фона и сравнивалась с флюоресценцией условно-нормальных клеток слизистого слоя толстой кишки того же пациента.

Сначала был проведен предварительный скрининг и дана характеристика образцов, относящихся к различным группам (стадиям) заболевания (табл. 1, 2, 3, 4, 5, 6). Первичный отбор признаков для дальнейшей статистической обработки проводился по данным количественной оценки снижения/повышения экспрессии белков-маркеров. Результаты иммунофлюоресцентного анализа представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего по результатам как минимум трех независимых экспериментов (случаев) для каждого значения G (табл. 7). Результаты оценки наиболее перспективных маркеров проанализированы для каждой группы попарно по сравнению с предыдущей группой с помощью непараметрического U-критерия Манна—Уитни. Проанализированные данные исследований представлены на диаграммах как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для каждой группы данных. Значения p<0,05 и p<0,01 считались статистически достоверными для выявления различий в расположении двух выборок.

Образцы опухолевой ткани разделены на 4 группы в зависимости от риска развития рецидива или прогрессии заболевания. Отдельно рассматривались опухоли IV стадии (отдаленные метастазы). Все образцы оценены по степени дифференцировки (Grade: G1, G2 и G3 — высоко-, умеренно- и низкодифференцированные соответственно), как показано в табл. 2, и по критерию Т(табл. 3).

В табл. 4 приведены значения количественного соотношения образцов опухолей с молекулярными нарушениями в зависимости от риска развития рецидива и/или прогрессии заболевания после хирургического удаления первичной опухоли. Среднее количество случаев изменения экспрессии выбранных маркеров рассчитывали как отношение образцов с измененной экспрессией маркеров к общему количеству образцов для каждой группы риска.

Как следует из табл. 4, количество молекулярных нарушений в образцах первичных опухолей было минимальным (35%) в группе с низким риском прогрессии заболевания.

В нормальном эпителии либеркюновых крипт и на ранних стадиях опухолевой прогрессии Е-кадгерин локализован в зонах межклеточных контактов, снижение его экспрессии связывают с прогрессией заболевания. При анализе образцов опухолевых тканей обнаружено снижение экспрессии Е-кадгерина и нарушение структуры межклеточных адгезионных контактов по сравнению с нормальной тканью (рис. 1, а, б). В опухолевых клетках части образцов наблюдалось слабое диффузное окрашивание Е-кадгерина в зонах межклеточных контактов и в редких случаях — в цитоплазме. Выраженность таких отклонений увеличивалась на более поздних этапах опухолевой прогрессии (см. рис. 1, в; табл. 5).

Характерные для опухолей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) изменения гена Е-кадгерина (СDH1) приводят к нарушению межклеточных адгезионных контактов, которое сопровождается сменой локализации β-катенина и повышением его транскрипционной активности, в результате чего запускается ряд сигнальных каскадов, стимулирующих деление клеток и увеличение их способности к инвазии [7, 9, 17]. Окрашивание опухолевых образцов выявило снижение мембранной локализации (см. рис. 1, д) и в некоторых случаях ядерную локализацию β-катенина (см. рис. 1, е) в опухолях G2—G3 по сравнению с нормальной тканью (см. рис. 1, г; см. табл. 5). Мы выявили тенденцию к увеличению доли опухолей с измененной локализацией Е-кадгерина по мере увеличения степени инвазии (критерий Т, табл. 6). Интересно отметить, что доля образцов с синхронным нарушением локализации E-кадгерина и β-катенина увеличивалась по мере снижения уровня дифференцировки клеток (50% образцов G3, см. табл. 5).

Кавеолин-1 является одним из ключевых белковых компонентов кавеол (разновидность рафт-структур). Роль кавеолина-1 в канцерогенезе обусловлена его способностью к формированию сигналосом и регуляции пролиферации, миграции и других процессов, важных при злокачественной трансформации клеток. Известно, что изменение экспрессии кавеолина-1 зависит от гистогенетического типа опухоли и стадии заболевания [18]. Поэтому, вероятно, снижение уровня его экспрессии и изменение локализации могут способствовать потере стабильной эпителиальной базоапикальной поляризации и приобретению мезенхимального фенотипа. В ходе исследований мы не выявили ни одного случая нарушения локализации и/или снижения экспрессии белка кавеолин-1 в опухолях с низким уровнем риска прогрессии заболевания (см. табл. 4, см. рис. 1, ж, з); а на более продвинутых стадиях заболевания этот параметр коррелировал с дифференцировкой опухолей (см. табл. 5, см. рис. 1, и). Наши данные об увеличении доли опухолей с нарушениями локализации и/или снижения экспрессии кавеолина-1 в опухолевых клетках по мере увеличения степени инвазии (критерий Т) согласуются с работой A. Kitowska и соавт. [19].

Мы полагаем, что изменения локализации и/или снижения экспрессии белков Е-кадгерина, кавеолина-1 и β-катенина могут служить комплексными факторами неблагоприятного прогноза при АТК и дополнительными критериями злокачественности при оценке прогноза заболевания после хирургического вмешательства, а также при решении вопроса о необходимости назначения больному адъювантной химиотерапии. Данное предположение требует дальнейшего подтверждения на больших выборках пациентов, а также анализа отдаленных результатов лечения.

В ходе данного исследования провели количественную оценку экспрессии β- и γ-актинов в опухолевых клетках по сравнению с нормальными клетками слизистого слоя толстой кишки. По нашим данным, эти две цитоплазматические немышечные изоформы актина могут регулировать злокачественные характеристики неопластических клеток. Смещение баланса в сторону преобладания γ-актинa приводит к усилению свойств ЭМП и ускоренному росту ксенографтов рака толстой кишки in vivo [15].

Мы наблюдали 1,5-кратное увеличение количества γ-актина по сравнению с нормой в 12 из 36 исследованных образцов опухолей, причем на IV стадии заболевания данные изменения зафиксированы в половине образцов (рис. 2, а—в; см. табл. 4), что подтверждает нашу гипотезу о роли γ-актина в формировании злокачественного фенотипа опухолей.

В образцах АТК человека мы выявили снижение количества β-актина в опухолевых клетках по сравнению с нормальным эпителием (в 32 из 36 исследованных образцов опухолей) в среднем на 30% (см. табл. 4, см. рис. 2, г—е). Количество β-актина в опухолевой ткани было снижено по сравнению с нормальным эпителием (р<0,05), более того, уменьшение иммунофлюоресцентного окрашивания коррелировало со снижением дифференцировки опухолей (табл. 7).

Таким образом, методом ИГХ-анализа мы оценили продукцию и локализацию белков цитоскелета β- и γ-актинов, Е-кадгерина, β-катенина и кавеолина-1 в опухолевых клетках образцов АТК по сравнению с нормальными клетками слизистого слоя толстой кишки. По крайней мере, часть исследованных маркеров (Е-кадгерин, β-катенин и β-актин) связана со злокачественными характеристиками опухолей и ассоциирована с ЭМП.

Наименьшее количество молекулярных нарушений на одного пациента выявлено в группе наиболее благоприятного прогноза. Доля опухолей с измененными мембранными белками в целом увеличивается по мере увеличения риска прогрессии, однако точные и статистически достоверные данные по этим маркерам будут получены после увеличения выборки и оценки отдаленных результатов лечения. Изменения Е-кадгерина выявлены в небольшом количестве образцов опухолей, несмотря на то что мутации и полиморфизмы СDH1 оказывают влияние на риск развития новообразований ЖКТ [20].

Вопреки нашим ожиданиям мы не выявили четких корреляций между увеличением количества γ-актина в опухолевых клетках и клиническими характеристиками опухолей. Тем не менее снижение количества β-актина в опухолях подтвердило нашу гипотезу о смещении баланса этих белков по мере проявления признаков злокачественности опухолевых клеток и опухолевой прогрессии.

Наши результаты согласуются с опубликованными данными, полученными на основании экспериментов на других типах опухолевых клеток и тканей. Ранее было показано, что в опухолевых клетках соотношение цитоплазматических изоформ актина нарушается. Значительное уменьшение ИГХ-окраски на β-актин наблюдалось в клетках карцином молочной железы по сравнению с доброкачественными пролифератами [21]. Исключение составляли редкие формы инфильтративного рака молочной железы (так называемые базально-подобные), в которых экспрессия β-актина была снижена только в инвазирующих участках [22].

При ИГХ-исследовании образцов опухолевой ткани шейки матки также выявлено снижение окрашивания на β-актин в структурах рака in situ и инвазивного рака по сравнению с нормальной тканью экзоцервикса и интраэпителиальными неоплазиями [23]. При экзогенном увеличении экспрессии γ-актина клетки становятся более инвазивными и демонстрируют ускоренный рост. Сдвиг баланса в сторону преобладания β-актина в опухолевых клетках имеет обратный эффект, приводящий к нормализации фенотипа, снижению пролиферации и подавлению инвазии. Таким образом, γ-актин можно рассматривать как слабый онкоген, а β-актин — как опухолевый супрессор [15, 24].

При ИГХ-анализе парафиновых срезов нормальной и опухолевой тканей, полученных от пациентов с АТК, была подтверждена наибольшая выраженность признаков ЭМП на поздних стадиях опухолевой прогрессии, а именно — снижение экспрессии эпителиального маркера Е-кадгерина и реорганизация β-катенина. Также выявлено изменение соотношения цитоплазматических изоформ актина: гиперэкспрессия γ-актина и снижение экспрессии β-актина, ассоциированные с распространением и дифференцировочным статусом опухоли. Дальнейшее исследование данных маркеров при АТК, а также отслеживание отдаленных результатов лечения позволят подтвердить выявленные в данной работе тенденции.

Своевременная диагностика и выявление изменений в экспрессии различных онкомаркеров на ранних стадиях опухолевой прогрессии значительно облегчают процесс лечения. Выявление корреляции между изменениями экспрессии онкологических маркеров с течением заболевания в первичных и вторичных очагах опухоли поможет детально понять процессы онкогенеза на каждом этапе опухолевой прогрессии, что облегчит разработку более эффективной противоопухолевой терапии.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (соглашение № 14−15−00467).

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: П.Б.К., А.В.К., В.А.Р.

Сбор и обработка материала: С.Ю.Б., В.А.Р., М.В.Н., А.В.К.

Статистическая обработка: М.В.Д., В.Б.Д., В.А.Р.

Написание текста: М.В.Н., В.А.Р.

Редактирование: В.К.Л., Н.В.Х., А.В.К., В.Б.Д.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.