Возникновение и развитие карцином являются результатом генетических изменений, определяющих процесс пролиферации клеток, что может проявляться либо в виде ускорения их деления, либо ингибирования механизмов клеточной гибели. Особое значение и роль в подобных генетических модификациях имеют гены-супрессоры опухолевого роста, разрушение обоих аллелей таких генов будет иметь фенотипический эффект [1].
Согласно предложенной в 1997 г. классификации K.W. Kinzler и B.Vogelstein, выделяют два типа генов-супрессоров: гены «хранители клеточного цикла» («gatekeepers») и гены «общего контроля» («caretakers»). Нарушения функций генов «gatekeepers», возникающие вследствие мутаций и структурных изменений, способствуют развитию новообразования, в свою очередь различные перестройки и дефекты в генах «caretakers» сопровождаются увеличением частоты мутаций, что приводит в итоге к нестабильности генома и соответственно оказывает влияние на ускорение трансформации нормальной клетки в злокачественную неопластическую [2, 3].
Для поддержания и защиты стабильности генома клеткам необходимо множество подобных генов с наличием особых высокоорганизованных и координированных механизмов регуляции, обеспечивающих взаимосвязь транскрипции генов, репликации, репарации ДНК и контрольных точек клеточного цикла [1, 4]. Гены системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (система мисматч-репарации, или Mismatch Repair system, MMRs) относятся к группе генов «caretakers», они являются основными для реализации адекватного и полноценного функционирования механизмов поддержания целостности генома, соответственно возникающие в них нарушения приводят к гипермутабельности и развитию феномена, который называют «микросателлитная нестабильность» (microsatellite instability, MSI) [5—7].
Определение микросателлитной нестабильности (дефицит или недостаточность функции системы мисматч-репарации), изначально описанной при синдроме Линча [8], в настоящее время является актуальным при колоректальном раке (КРР) для выявления пациентов, у которых может иметь эффект терапия ингибиторами иммунных контрольных точек [6, 9, 10]. В литературе [9, 11] представлены результаты исследований, указывающие, что дефицит системы мисматч-репарации (deficiency Mismatch Repair, dMMR) регистрируется примерно в 5% случаев метастатического и в 15% неметастатического рака толстой кишки. J. Rios-Valencia и соавт. [12] в своей работе при изучении когорты пациентов с КРР обнаружили dMMR-статус опухоли в 27% (39/144), при этом все карциномы имели местно-распространенный характер, правостороннюю локализацию, муцинозный фенотип и выраженную, подобную таковой при болезни Крона лимфоидную инфильтрацию (Crohn’s-like lymphoid reaction). При раннем КРР с установленным dMMR-статусом была показана высокая эффективность применения в качестве адъювантной терапии ингибиторов иммунных контрольных точек, имеющих ведущее значение, более широко изученными среди которых являются PD-L1 (Programmed cell Death Ligand 1) и CTLA4 (Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4) [9, 10, 13—19]. LAG3 (lymphocyte activating gene 3; CD223) является менее изученной, но одной из наиболее перспективных иммунных контрольных точек после PD-L1 и CTLA4, роль и значение этого маркера при КРР остаются неоднозначными и неясными до конца на сегодняшний день [20—22]. J. Xu и соавт. [23] представили результаты исследования образцов опухолевой ткани КРР, в которых отметили наличие позитивной экспрессии белка LAG3 в 20,7% случаев. Экспрессия маркера регистрировалась в инфильтрирующих опухоль лимфоцитах (Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs), была также ассоциирована с метастазами в лимфатических узлах (p<0,001), со стадией заболевания по системе TNM (p=0,024) и с высоким уровнем MSI (MSI-High) (p=0,035), что определяло плохой прогноз. D.I. Abdelrahman и соавт. [24] при изучении 206 образцов ткани КРР показали, что позитивная экспрессия LAG3 на поверхности TILs в строме опухоли тесно коррелировала с большим размером первичного узла и более высоким грэйдом (high grade), с наличием некрозов, лимфоваскулярной инвазии, метастатического поражения лимфатических узлов, а также с показателями безрецидивной и общей выживаемости.
Таким образом, интерпретация сложного клеточного опухолевого микроокружения в сочетании с инфильтрирующими опухоль иммунными клетками и возможностью определения микросателлитной нестабильности злокачественного новообразования стала иметь критически важное значение при появлении новых иммунотерапевтических подходов к лечению карцином, в том числе при КРР. На сегодняшний день данные исследования являются крайне актуальными с точки зрения определения и оценки новых прогностических и предиктивных показателей течения заболевания.
Цель нашего исследования — изучить особенности экспрессии белков иммунных контрольных точек PD-L1, CTLA4 и LAG3 в микроокружении аденокарциномы кишки в зависимости от MMR-статуса.
Материал и методы
В исследование было включено 32 пациента с морфологически подтвержденным диагнозом рака толстой кишки, проходивших лечение в НИИ онкологии Томского НИМЦ в период с 2019 по 2022 г. Исследование было одобрено этическим комитетом НИИ онкологии Томского НИМЦ в соответствии с рекомендациями надлежащей клинической практики и Хельсинкской декларацией, все участники исследования или их законные представители подписали информированное согласие. Критерии исключения: факт проведения неоадъювантной терапии, наличие аутоиммунных заболеваний и/или ВИЧ, отказ от исследования.
Всем пациентам был выполнен оперативный этап лечения в объеме гемиколонэктомии или резекции кишки, в случае наличия отдаленных метастазов произведена их интраоперационная резекция. Операционный материал фиксировали в растворе забуференного 10% формалина. Работа проводилась в 3 этапа: морфологическое исследование опухолевой ткани на светооптическом уровне, иммуногистохимическое исследование образцов опухоли с целью определения dMMR/pMMR-статуса новообразования, мультиплексный анализ. На первом этапе данной работы была выполнена макроскопическая оценка фиксированного в формалине операционного материала с вырезкой образцов опухолевой ткани, проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике, полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Морфологическую оценку операционного материала проводили на светооптическом уровне с применением микроскопа Nikon Eclipse Ni (Япония), гистотип опухоли определяли в соответствии с классификацией WHO Classification of Digestive System Tumours [25]. Микроскопически оценивали наличие метастазов в лимфатических узлах клетчатки кишки и количество лимфатических узлов с метастатическим поражением (в каждом случае исследовано не менее 12 лимфатических узлов). В ткани первичной опухоли при морфологическом исследовании определяли наличие некрозов, признаков сосудистой, периневральной, интраневральной инвазии, а также степень дифференцировки (high-grade и low-grade) в случаях немуцинозных аденокарцином. По результатам морфологического изучения операционного материала верифицировали наличие/отсутствие отдаленных метастазов.
На втором этапе исследование белков системы мисматч-репарации в ткани опухоли (определение dMMR/pMMR-статуса опухоли толстой кишки) проводили с использованием автоматического иммуногистостейнера Bond RX (Leica Biosystem), стандартный протокол F. Для решения обозначенной задачи в работе применяли антитела фирмы Dako An Agilent Technologies Company к белкам системы репарации неспаренных нуклеотидов MLH1 (Clone ES05, RTU), MSH2 (Clone FE1, RTU), MSH6 (Clone EP49, RTU), PMS2 (Clone EP51, RTU). Карциномы кишки с наличием диффузной ядерной экспрессии всех 4 указанных белков (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) идентифицировали как опухоли с профицитом белков системы мисматч-репарации — pMMR-статус, при выпадении ядерного окрашивания хотя бы одного из четырех перечисленных маркеров статус опухоли определяли как dMMR.
На третьем этапе (мультиплексный иммунофлюоресцентный анализ) мультиплексное окрашивание гистологических срезов опухоли выполняли с использованием автоматического иммуногистостейнера Bond RX (Leica) на срезах ткани толщиной 4 мкм. Протокол исследования включал циклы демаскировки, блокирования эндогенной пероксидазной активности и протеиновый блок. Панель маркеров была представлена антителами к белкам PD-L1 (Clone SP142, RTU, Ventana), CTLA4 (1:500, Cloud-clone, КНР), LAG3 (1:500, Cloud-clone, КНР), а также CD3+ (Clone 2GV6, RTU, Ventana), CD8+ (Clone SP57, RTU, Ventana) и CD163+ (Clone 10D6, RTU, Diagnostic Biosystems). Для визуализации выполняли окрашивание 6-цветным набором OPAL Kit (NEL810001KT, Perkin Elmer), содержащим следующие флуорофоры: Opal 520, Opal 540, Opal 570, Opal 620, Opal 650 и Opal 690. Полученные препараты заключали в светозащитную среду ProLong Mount with DAPI (Thermo, США). Для проведения дальнейшего исследования препараты сканировали с помощью системы мультиплексного анализа ткани Vectra 3.0.3 (Perkin Elmer, США). Исследуемые срезы сканировали при увеличении в 4 раза, мультиспектральные изображения изучаемых областей получали при увеличении в 10 раз, в каждом препарате исследовали 10 областей. Сегментацию тканей и клеток, а также их оценку проводили с помощью программного обеспечения InForm 2.2.1 (Akoya Biosciences, Мальборо, Массачусетс, США).
В нашей работе был исследован центр опухоли (core) и ее инвазивный край (edge) [21], непосредственно в данных участках проводили оценку экспрессии PD-L1, CTLA4, LAG3, CD3+, CD8+ лимфоцитов и CD163+ макрофагов (рис. 1, 2). Дополнительным параметром оценки микроокружения опухоли явился расчет отношения количества клеток (расчет проведен в ходе компьютерной обработки срезов) TILs CD3+ к CD8+ в центре опухоли и в зоне инвазивного края.
Рис. 1. TSA-модифицированное многоцветное иммунофлюоресцентное окрашивание ткани колоректальной карциномы (центр).
Антитела к CD3 — белый цвет, CD163 — красный, CD8 — зеленый. ×630.
Рис. 2. TSA-модифицированное многоцветное иммунофлюоресцентное окрашивание ткани колоректальной карциномы (центр).
Антитела к LAG3 — голубой цвет, PD-L1 — розовый, CTLA4 — оранжевый ×630.
Статистический анализ данных был выполнен при помощи пакета программ SPSS 23.0 (IBM SPSS Statistics, США). Описание количественных показателей проводили с указанием медианы (25; 75-го процентиля). Качественные показатели описывали с указанием абсолютных и относительных частот. Сравнение количественных и качественных показателей независимых выборок проводили с использованием U-критерия Манна—Уитни и критерия χ2. Результаты считали статистически значимыми при значении p<0,05.
Результаты и обсуждение
В результате проведенного исследования были получены следующие данные. Основные клинические показатели и морфологические параметры первичной опухоли толстой кишки в исследуемой группе пациентов представлены в таблице.
Клинические показатели пациентов и морфологические характеристики опухоли толстой кишки в группе исследования
| Клинические показатели и морфологические характеристики | dMMR/MSI- и pMMR/MSS- статус опухоли кишки | χ2 | p | |
| dMMR/MSI (n=16), абс(%) | pMMR/MSS (n=16), абс(%) | |||
| Пол | ||||
| мужской | 12 (75) | 7 (43,75) | 3,239 | 0,072 |
| женский | 4 (25) | 9 (56,25) | ||
| Гистотип опухоли | ||||
| аденокарцинома High-grade | 8 (50) | 2 (12,5) | 7,480 | 0,024 |
| аденокарцинома Low-grade | 3 (18,75) | 10 (62,5) | ||
| муцинозная аденокарцинома | 5 (31,25) | 4 (25) | ||
| Локализация опухоли (отдел кишки) | ||||
| слепая | 4 (25) | — | 10, 267 | 0,174 |
| восходящая | 3 (18,75) | 2 (12,5) | ||
| печеночный изгиб | 3 (18,75) | 3 (18,75) | ||
| поперечная | 2 (12,5) | — | ||
| нисходящая | 1 (6,25) | 1 (6,25) | ||
| сигмовидная | 2 (12,5) | 8 (50) | ||
| ректосигмоидный отдел | 1 (6,25) | 1 (6,25) | ||
| Сторона поражения | ||||
| справа | 11 (68,75) | 6 (37,5) | 3,137 | 0,077 |
| слева | 5 (31,25) | 10 (62,5) | ||
| Критерий T | ||||
| T2 | 1 (6,25) | 1 (6,25) | 1,500 | 0,682 |
| T3 | 3 (18,75) | 5 (31,25) | ||
| T4a | 9 (56,25) | 9 (56,25) | ||
| T4b | 3 (18,75) | 1 (6,25) | ||
| Критерий N | ||||
| N0 | 7 (43,75) | 8 (50) | 3,733 | 0,588 |
| N1a | 3 (18,75) | 3 (18,75) | ||
| N1b | 1 (6,25) | 1 (6,25) | ||
| N1c | 1 (6,25) | — | ||
| N2a | — | 2 (12,5) | ||
| N2b | 4 (25) | 2 (12,5) | ||
| Наличие: | ||||
| некрозов в ткани опухоли | 11 (68,75) | 7 (43,75) | 2,032 | 0,154 |
| метастазов в лимфатических узлах | 9 (56,25) | 8 (50) | 0,125 | 0,723 |
| отдаленных метастазов | 1 (6,25) | 4 (25) | 2,133 | 0,144 |
| сосудистой инвазии | 5 (31,25) | 6 (37,5) | 0,139 | 0,710 |
| периневральной инвазии | 3 (18,75) | 3 (18,75) | 0,000 | 1,000 |
| интраневральной инвазии | 1 (6,25) | — | 1,143 | 0,285 |
На основании данных иммуногистохимического исследования в зависимости от dMMR/pMMR-статуса карциномы толстой кишки были сформированы две группы: 1-ю группу составили 16 (50%) случаев с дефицитом белков системы мисматч-репарации (dMMR-статус), равное число пациентов (50%; n=16) было включено во 2-ю группу контроля — опухоли с профицитом белков (pMMR-статус). Средний возраст пациентов в 1-й группе составил 65 (49,25—69,5) лет, во 2-й группе — 64,5 (58—74) года. При оценке частоты выявления лимфогенных метастазов в 1-й и 2-й группах статически значимых различий обнаружено не было (n=9 и n=8; p=0,723; χ2=0,125 соответственно). Количество лимфатических узлов с метастазами в группе с dMMR-статусом карциномы соответствовало значению 0,5 (0—5,8), в группе с pMMR статусом — 1 (0—5), таким образом, в описанных группах в зависимости от dMMR/pMMR-статуса карциномы толстой кишки не было обнаружено статически значимых различий по исследуемому параметру (p=0,780).
Результаты мультиплексного анализа с подсчетом количества клеток с позитивной экспрессией исследуемых маркеров PD-L1, CTLA4, LAG3 (мультиплексный анализ Vectra 3.0.3 образцов опухолевой ткани с применением программного обеспечения InForm 2.2.1) и выявленные статистически значимые различия представлены на рис. 3. Необходимо отметить, что значимые различия экспрессии всех изучаемых иммунных контрольных точек в группах пациентов, имеющих подтвержденный иммуногистохимическим методом dMMR- и pMMR-статус опухоли, были обнаружены в опухолевом микроокружении в зоне инвазивного края (edge). В центре опухоли (core) статистически значимые различия в количестве позитивных клеток были зарегистрированы для LAG3 (p=0,034). В группах с dMMR- и pMMR-статусом при оценке экспрессии маркера PD-L1 в центральных отделах карциномы значимых различий выявлено не было (p=0,407), аналогичные данные получены и в отношении CTLA4 (p=0,085).
Рис. 3. Результаты мультиплексного анализа с подсчетом количества клеток с позитивной экспрессией маркеров PD-L1, CTLA4, LAG3 в опухолевом микроокружении аденокарциномы кишки (диаграммы размаха).
Мультиплексный анализ Vectra 3.0.3 образцов опухолевой ткани с применением программного обеспечения InForm 2.2.1.
а — статистически значимые различия в количестве клеток с позитивной экспрессией LAG3 в центре опухоли в группах с dMMR- и pMMR-статусом карциномы кишки; б — наличие клеток с позитивной экспрессией CTLA4 в инвазивном крае опухоли в группах с dMMR- и pMMR-статусом карциномы кишки; в — наличие клеток с позитивной экспрессией LAG3 в инвазивном крае опухоли в группах с dMMR- и pMMR-статусом карциномы кишки; г — наличие клеток с позитивной экспрессией PD-L1 в инвазивном крае опухоли в группах с dMMR- и pMMR-статусом карциномы кишки.
При подсчете TILs с позитивной экспрессией CD3+, CD8+, а также определении соотношения CD3+/CD8+ в центре опухоли (core) в двух исследуемых группах с dMMR- и pMMR-статусом статистически значимых различий выявлено не было. При исследовании аналогичных указанных показателей опухолевого микроокружения в зоне инвазивного края (edge) установлены статистически значимые различия при подсчете количества TILs с позитивной экспрессией CD3+, в группах с dMMR- и pMMR-статусом опухоли значения их составили 7,8 (3,45—9,58) и 4,97 (2,23—5,52) (p=0,015 соответственно). При изучении в микроокружении карциномы кишки TILs с позитивной экспрессией CD163+ получены статистически значимые различия между исследуемыми группами, при этом различия выявлены и в центре опухоли (14,36 и 7,36; p=0,019 соответственно), и в инвазивном крае (8,7 и 6,23; p=0,041).
Заключение
В проведенном исследовании представлен анализ экспрессии иммунных контрольных точек PD-L1, CTLA4, LAG3 и состава опухолеинфильтрирующих лимфоцитов в зависимости от MMR-статуса колоректальных карцином. По результатам исследования выявлены значимые различия экспрессии PD-L1, CTLA4, LAG3 в зоне инвазивного края опухоли между группами dMMR- и pMMR-аденокарцином толстой кишки у пациентов, сопоставимых по клинико-морфологическим характеристикам и проведенному лечению. Так, в группе опухолей с dMMR отмечено повышение экспрессии всех изученных маркеров. Количество TILs CD3+ также было достоверно выше в инвазивном крае опухолей с dMMR-статусом. Кроме того, отмечено увеличение числа CD163+ макрофагов как в центре, так и на периферии опухолей с dMMR-статусом. Не выявлено существенных различий в экспрессии контрольных точек и составе TILs в центральной зоне опухолей с разным MMR-статусом.
Проведенное исследование с применением мультиплексного иммуногистохимического анализа показало, что MMR-дефицитные аденокарциномы толстой кишки характеризуются более выраженной иммунной инфильтрацией и повышенной экспрессией контрольных точек иммунитета в клетках микроокружения преимущественно в зоне инвазивного роста опухоли. Полученные данные могут иметь важное значение для понимания механизмов иммуноопосредованного контроля опухолевого роста и выбора тактики иммунотерапии в зависимости от MMR-статуса.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — С.С. Наумов, Н.В. Крахмаль, С.В. Вторушин
Сбор и обработка материала — С.С. Наумов, Л.А. Таширева
Статистическая обработка — С.С. Наумов
Написание текста — С.С. Наумов, Н.В. Крахмаль
Редактирование — С.В. Вторушин
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflict s of interest.