Экспрессия маркеров апоптоза и аутофагии в перевитом раке почки у крыс при введении флавоноидсодержащего экстракта аврана лекарственного (L.)

Авторы:
  • Н. А. Наволокин
    ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России, Саратов, Россия
  • Г. Н. Маслякова
    ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России, Саратов, Россия
  • Н. В. Полуконова
    ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России, Саратов, Россия
  • Д. А. Мудрак
    ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России, Саратов, Россия
  • А. Б. Бучарская
    ФГБОУ ВО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздрава России, Саратов, Россия
Журнал: Архив патологии. 2019;81(1): 24-30
Просмотрено: 1519 Скачано: 150

На сегодняшний день количество пациентов с онкологическими заболеваниями продолжает увеличиваться, а современные методы лечения не всегда оказываются эффективными [1]. Кроме того, недостатками применяемых противоопухолевых препаратов являются их токсическое влияние на неизмененные органы и ткани организма, а также развитие к ним устойчивости опухолей [2]. Все это делает необходимым поиск новых, более безопасных и эффективных лекарственных препаратов.

Лекарственные средства растительного происхождения имеют минимальные побочные эффекты, поэтому им сегодня уделяется особое внимание. Препараты из растительного сырья могут использоваться не только для лечения опухолей в виде монотерапии, но и в комплексном лечении для защиты нормальных клеток (в том числе и стволовых клеток костного мозга) при проведении стандартного курса химио- и лучевой терапии [1—3].

Самой перспективной группой препаратов из растительного сырья, по мнению ряда авторов, являются флавоноиды, так как они обладают наибольшим количеством биологических эффектов, оказывающих положительное влияние на результаты лечения новообразований [2, 3]. Открытие в 2011 г. способности растительного флавоноида вогонина активизировать апоптоз в опухолевых клетках [4] позволило продолжить поиск и других биофлавоноидов, обладающих противоопухолевой активностью.

Ранее на лабораторных животных с перевиваемыми опухолями было показано, что флавоноидсодержащий экстракт аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.) наряду с малой токсичностью обладает противоопухолевой активностью в отношении перевиваемого рака печени и саркомы, а также антиоксидантным и антикахексическим свойством [5—7]. Однако детального изучения апоптоза, аутофагии и механизмов гибели опухолевых клеток перевиваемого рака почки с применением иммуногистохимических маркеров под действием экстракта аврана ранее не проводилось.

Цель исследования — в экспериментах in vivo установить механизмы патоморфоза перевитого рака почки под влиянием флавоноидсодержащего экстракта аврана.

Материал и методы

Экстракты были получены авторским способом (патент РФ № 2482863), позволяющим существенно повысить выход биофлавоноидов и предусматривающим минимальный выход токсичных соединений (алкалоидов, гликозидов и др.) [8]. Экстракт аврана лекарственного, полученный данным способом, имеет следующий химический состав: 4-винил-2-метоксифенол; 2,3-дигидро-3,5-дигидрокси-6-метил-4Н-пиран-4-он; 2,3-дигидробензофуран; 3-фуранкарбоновая кислота; 5-гидроксиметил-2-фуральдегид; этил-a-d-рибозид; 4-пропилфенол; пирокатехин; L-луксоза (пентоза); 6-деоксигексоза L-галактоза; бензоилуксусной кислоты этиловый эфир; гексадекановая кислота (пальмитиновая кислота); гомованилиновая кислота; глюкоза; 1,4-ангидро-d-маннитол; бензойная кислота; кверцетин [8].

Работу с лабораторными животными осуществляли согласно протоколу исследований, не противоречащих Женевской конвенции 1985 г. о «Международных принципах биомедицинских исследований с использованием животных». Тема и описания экспериментов одобрены этической комиссией ФГБОУ ВО «СГМУ им. В.И. Разумовского» Минздрава России (протокол № 13 от 03.05.11). Исследование проведено на базе Центра коллективного пользования НИИ фундаментальной и клинической уронефрологии, ФГБОУ ВО «СГМУ им В.И. Разумовского» Минздрава России.

В эксперименте, проводимом в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [9], использованы 30 самцов белых лабораторных крыс Wistar массой 150±50 г, которым имплантировали подкожно в область лопатки по 0,5 мл 25% опухолевой взвеси рака почки РА в растворе Хэнкса. Опухоль получена из банка опухолевых штаммов ГУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Животные с перевитым раком методом случайной выборки были разделены на три группы по 10 крыс: 1-я и 2-я — опытные, крысы получали экстракт аврана либо перорально, либо внутримышечно в дозе 110 мг сухой массы экстракта на 1 кг, 3-ю группу (сравнения) составили животные с перевиваемой опухолью, но без введения экстракта. В опытных группах через 72 ч после трансплантации опухоли крысам раствор вводили ежедневно в течение 2 нед, после чего животных всех групп выводили из эксперимента путем декапитации под наркозом (золетил 10 мг /кг подкожно) и проводили забор образцов ткани опухоли.

Известно, что эффективность противоопухолевой терапии оценивается по степени выраженности патоморфоза, который проявляется дистрофией, некрозом, склерозом, а также развитием атрофических изменений в ткани опухоли [10].

Для изучения патоморфоза опухоли применяли морфологические и морфометрические методы, использовали окраску гистологических срезов гематоксилином и эозином. При иммуногистохимическом исследовании применяли систему детекции REVEAL Polyvalent HRP-DAB Detection System с антителами ABCAM в разведении к антителу от 1:50 до 1:100. Использовали следующую панель моно- и поликлональных антител: маркеры апоптоза (p53 (clone PAb 1801, ab28), bax (clone 100/D5, ab692), bcl-2 (ab54829), Fas-receptor (ab15285), Fas-ligand (ab82419)) для установки возможного пути его реализации, аутофагии LС3b (ab48394) для уточнения роли этого процесса в механизме гибели клеток опухоли, маркер пролиферации Ki-67 (clone SP6, ab16667) и ангиогенеза VEGF (clone JH121, ab28775). При окраске с иммуногистохимическими маркерами использовали положительный и отрицательный контроль для исключения ложноотрицательных и ложноположительных результатов, окрашивание на каждый маркер проводили для всех образцов тканей единовременно для создания стандартизации условий окраски и повышения объективности полученных результатов. Подсчитывали процент экспрессирующих клеток в 10 полях зрения каждого микропрепарата, а также степень выраженности иммуногистохимических реакций (слабая, умеренная и выраженная). Учитывали наличие дистрофических и некротических изменений и также такие цитоморфометрические показатели, как диаметр опухолевых клеток, ядерно-цитоплазматический индекс (ЯЦИ), среднее количество клеток в поле зрения. Все морфометрические исследования проводили с помощью микровизора медицинского проходящего света µVizo-103 (ЛОМО) при увеличении 774.

При статистической обработке данных нормальность распределения показателей в группах проверяли при помощи критерия Шапиро—Уилка. Для сравнения средних полученных показателей использовали критерий Крамера—Уэлча (Т), при котором разность средних арифметических двух выборок (контрольной и экспериментальной) делится на естественную оценку среднего квадратического отклонения этой разности. При данном методе разность средних с вероятностью в 95% определяется при Т≥1,96 и p<0,05. Весь статистический анализ выполнен при помощи программного обеспечения Statistiсa 10.0 Interprise.

Результаты и обсуждение

В группе сравнения перевитый рак почки макроскопически был представлен опухолью, состоящей из одного или несколько узлов, масса опухоли составила 11,52±2,34 г. При введении экстракта аврана наблюдали резкое замедление темпов роста опухоли, в конце эксперимента в опытной группе с внутримышечным введением опухоль была меньше на 73% (3,1±1,1 г), чем в группе сравнения, а при пероральном введении — на 71% (3,29±1,2 г). Макроскопически опухоль после курса введения экстракта была представлена одним узлом, имеющим на разрезе пестрый вид.

При гистологическом исследовании в ткани опухоли на 12-й день эксперимента обнаруживались обширные зоны некроза и дистрофические изменения опухолевых клеток, а также визуализировались апоптотические тельца. Митозы не встречались в отличие от группы сравнения (без лечения), где фигур митозов насчитывали до 2 в поле зрения. По данным морфометрического исследования выявлено статистически значимое снижение среднего числа клеток в поле зрения в 2 раза при внутримышечном введении экстракта аврана и 1,6 раза при пероральном введении (табл. 1).

Таблица 1. Морфометрические показатели перевитой опухоли почки РА в группе сравнения и после курсов внутримышечного и перорального введения экстракта аврана в дозе 110 мг/кг/сут (М±δ) Примечание. Здесь и в табл. 2: * – при p<0,05 и T>1,96 достоверность различий более 95% при сравнении значений опытной группы и группы сравнения.
Выявили уменьшение размеров диаметра ядра опухолевых клеток в 1,8 раза при внутримышечном и в 1,2 раза при пероральном введении. Статистически значимое уменьшение среднего диаметра клетки наблюдали только в группе животных с внутримышечным введением экстракта (см. табл. 1).

При иммуногистохимическом исследовании ткани рака с маркером Ki-67 в группе сравнения индекс пролиферации составил 48%, причем у большей части иммунопозитивных ядер клеток экспрессия была выраженной. В экспериментальных группах при обоих путях введения экстракта аврана экспрессия Ki-67 не выявлялась (индекс пролиферации был равен 0) (см. табл. 1).

При иммуногистохимической реакции ткани рака почки РА с использованием маркера ангиогенеза VEGF в группе сравнения наблюдали слабую цитоплазматическую экспрессию в клетках опухоли. В экспериментальных группах как с внутримышечным, так и с пероральным введением экстракта аврана экспрессия маркера ангиогенеза VEGF отсутствовала (табл. 2, рис.

Таблица 2. Иммуногистохимические маркеры рака почки РА в группе сравнения и экспериментальных группах под действием экстракта аврана Примечание. (+), (++), (+++) — степень выраженности экспрессии (слабая, умеренная и выраженная).
1).
Рис. 1. Иммуногистохимические реакции с антителами VEGF, p53, Bax в раке почки. а — группа сравнения, ×774 (VEGF); б — экспериментальная группа с пероральным путем введения экстракта аврана, ×774 (VEGF); в — группа сравнения, ×774 (p53); г — экспериментальная группа с внутримышечным введением экстракта аврана, ×774 (p53); д — группа сравнения, ×246 (Bax); е — экспериментальная группа с внутримышечным введением экстракта аврана, 246 (Bax).

В группе сравнения при окраске на маркер апоптоза р53 выявили отсутствие экспрессии. После введения экстракта аврана в опытных группах в опухолевой ткани отмечали появление умеренной как цитоплазматической, так и ядерной экспрессии маркера апоптоза p53. Обращало на себя внимание, что маркер экспрессировался в апоптотических тельцах и в клетках без ядер. При внутримышечном введении экстракта процент клеток с положительной экспрессией достигал 60,5, а при пероральном пути введения — 37,5 (см. табл. 2, см. рис. 1).

При иммуногистохимическом выявлении цитоплазматического маркера активации апоптоза Bax в клетках рака почки РА группы сравнения наблюдали отрицательную реакцию, так же как и в группе с пероральным путем введения экстракта аврана. При внутримышечном введении экстракта аврана отмечали умеренную экспрессию маркера в 58,2±12,8% клеток (см. табл. 2, см. рис. 1). Кроме того, экспрессия Bax при внутримышечном введении отмечалась в клетках с конденсированным ядром, в безъядерных клетках и апоптозных тельцах, это может быть подтверждением того, что опухолевые клетки при воздействии экстракта погибают главным образом по механизму апоптоза.

Однако при оценке экспрессии иммуногистохимического маркера блокатора апоптоза Bcl-2 наблюдали отрицательную окраску как в группе сравнения, так и после курсового введения экстракта аврана, что мы связываем с биологическими особенностями перевитого рака почки РА.

При иммуногистохимическом окрашивании маркером клеточной смерти CD95 (Fas/APO-1) в клетках рака почки РА в группе сравнения отмечали отрицательную реакцию. Введение экстракта аврана вызывало выраженную цитоплазматическую экспрессию данного рецептора в клетках рака почки РА при внутримышечном введении в 83,1% и при пероральном в 24,6% (см. табл. 2, рис. 2).

Рис. 2. Иммуногистохимические реакции с антителами Fas/APO-1, FAS-ligand и LC3B в раке почки. а — группа сравнения (Fas/APO-1), ×774; б — экспериментальная группа с внутримышечным путем введения экстракта аврана (Fas/APO-1), ×774; в — группа сравнения (FAS-ligand), ×774; г — экспериментальная группа с пероральным путем введения экстракта аврана, ×246 (FAS-ligand); д — группа с внутримышечным путем введения экстракта аврана (LC3B), ×774; е — группа с пероральным путем введения экстракта аврана (LC3B), ×774. Стрелками указаны погибшие клетки с положительной зернистой экспрессией.

В группе сравнения при окраске ткани рака почки РА маркером FAS-ligand отмечали отрицательную реакцию. При введении экстракта аврана наблюдали слабую мембранную и цитоплазматическую экспрессию FAS-ligand: при внутримышечном введении до 38,4% клеток и при пероральном до 49% клеток (cм. табл. 2, см. рис. 2).

При иммуногистохимическом окрашивании на маркер аутофагии LC3b в клетках рака почки РА группы сравнения отмечали зональную слабую положительную экспрессию в 7,8% клеток. При пероральном пути введения наблюдали умеренную очаговую экспрессию маркера LC3b и увеличение числа экспрессировавших его клеток до 12,3%. Следует отметить, что при этом экспрессия проявлялась в виде многочисленной мелкой зернистости. По мнению ряда авторов, такое окрашивание свидетельствует о запуске аутофагии [11]. Это обусловлено тем, что LC3b фиксируется на поверхности аутофагосом и клетка за счет этого приобретает пятнистый вид. При внутримышечном введении экстракта аврана наблюдали цитоплазматическую экспрессию LC3b в единичных клетках (1,2±0,8%) (см. табл. 2, см. рис. 2).

Иммуногистохимическое исследование позволило выявить некоторые механизмы, лежащие в основе клеточной гибели опухолевых клеток при воздействии экстракта аврана в раке почки Р.А. Установлено, что в результате действия экстракта значительно снижается пролиферативная активность в клетках рака почки. Блокирование деления клеток опухоли лежит в основе действия большинства цитостатических препаратов, однако они блокируют деление клетки на фазе митоза [1].

Исследование показало, что под действием экстракта происходит переход опухолевых клеток в G0-фазу. Кроме того, снижается экспрессия маркера ангиогенеза и происходит активация всех путей апоптоза: митохондриального через белки p53, BAX и внешнего рецепторного через белки CD95 (Fas/APO-1) и FAS-ligand. Все описанные процессы развиваются в 1,5—2 раза интенсивнее при внутримышечном пути введения аврана.

Данные, полученные с помощью иммуногистохимии, согласуются и с гистологическими изменениями в ткани опухоли: отсутствие митозов, уменьшение размеров ядра и клетки, снижение количества клеток в поле зрения. Установлено, что, несмотря на выраженные изменения в ткани опухоли, у животных отсутствовали признаки интоксикации, сопровождающие, как правило, некротические процессы, и это подтверждает полученные данные о том, что опухолевые клетки погибают за счет активации апоптоза.

До настоящего времени в литературе нет однозначного мнения о значении развития аутофагии в опухолевых клетках. Так, некоторые авторы отмечают более благоприятный прогноз у пациентов при появлении аутофагосом в опухолевых клетках [12], но большинство исследователей считают, что экспрессия LC3b связана с неблагоприятным прогнозом течения заболевания [13—15]. Мнения всех авторов сходятся в том, что аутофагия может развиваться в опухолевых клетках как защитный механизм опухолевой клетки при лечении [12—16], с чем мы полностью согласны. Установлено, что частота развития цитопротекторной аутофагии зависит от пути введения. Так, при внутримышечном введении аврана частота развития аутофагии в опухолевых клетках была в 10 раз меньше, чем при пероральном, по-видимому, из-за большей биодоступности. Следует заметить, что в группе животных после перорального введения экстракта аврана количество опухолевых клеток с аутофагосомами стало больше, чем в группе сравнения. Этот факт свидетельствует о том, что аутофагия действительно развивается как защитный механизм опухолевой клетки при действии повреждающего агента, которым является в данном случае экстракт с противоопухолевым действием, и лежит в основе возникновения резистентности опухоли к противоопухолевой терапии.

Поэтому нельзя исключить, что появление факта аутофагии может считаться признаком развития резистентности опухоли к действию препаратов из-за недостаточной дозировки, и это необходимо учитывать при оценке степени патоморфоза и определении дальнейшей тактики лечения пациентов.

Выводы

1. Выраженный патоморфоз рака почки (2—3-й степени) происходит после введения экстракта аврана и проявляется развитием выраженных некротических и атрофических изменений в опухолевых клетках (уменьшение размеров ядра и клетки в 1,5 раза), снижением пролиферативной активности, исчезновением митозов, запуском апоптоза митохондриальным и рецепторным путем.

2. Установлено, что недостаточная концентрация экстракта аврана в опухолевых клетках, обусловленная пероральным путем его введения, способствует развитию цитопротекторной аутофагии. При внутримышечном введении экстракта, позволяющем повысить концентрацию экстракта в опухолевой ткани, процесс развития цитопротекторной аутофагии блокируется. Полученные результаты позволяют предположить, что маркер аутофагии LC3b может использоваться в качестве дополнительного критерия оценки лечебного патоморфоза опухолей, так как отражает эффективность проводимой терапии.

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18−015−00298 . Работа выполнена в рамках государственного задания Минздрава России «Исследование экстрактов лекарственных растений, содержащих флавоноиды и их фракции, с целью создания препаратов, обладающих противоопухолевой, антиоксидантной, антикахексической и другой активностью».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Г. Н.М., Н.В.П., Н.А.Н.

Сбор и обработка материала — Д.А.М., Н.А.Н.

Статистическая обработка — Д.А.М., Н.А.Н.

Написание текста — Н.А.Н.

Редактирование — Г. Н.М., А.Б.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Наволокин Никита Александрович — e-mail: nik-navolokin@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0001-7876-9758

Маслякова Галина Никифоровна — e-mail: gmaslyakova@yandex.ru;
https://orcid.org/0000-0001-8834-1536

Полуконова Наталья Владимировна — https://orcid.org/0000-0001-9228-6808

Мудрак Дмитрий Андреевич — https://orcid.org/0000-0001-7399-9204

Бучарская Алла Борисовна — https://orcid.org/0000-0003-0503-6486

Список литературы:

  1. Корман Д.Б. Основы противоопухолевой терапии. М.: Практическая медицина; 2006.
  2. Гольдберг Е.Д., Разина Т.Г., Зуева Е.П., Амосова Е.Н., Крылова С.Г., Гольдберг В.Е. Растения в комплексной терапии опухолей. М.: Издательство РАМН; 2008;180-190.
  3. Корсун В.Ф., Трескунов К.А., Корсун Е.В., Мицконас А. Лекарственные растения в онкологии. М. 2007.
  4. Polier G, Ding J, Konkimalla BV, Eick D, Rebiero N, Kuchler R, Giaisi M, Efferth T, Desaubry T, Krammer L, Li-Weber M. Wogonin andrelated natural flavones are inhibitors of CDK9 that induce apoptosis in cancer cells by transcriptional suppression of Mcl-1. Cell Death Dis. 2011;2:e182.
  5. Navolokin NA, Polukonova NV, Maslyakova GN, Bucharskaya AB, Durnova NA. Effect of extracts of Gratiola officinalis and Zea mays on the tumor and the morphology of the internal organs of rats with transplanted liver cancer. Russian Open Medical Journal. 2012;1(2): 0203.
  6. Navolokin NA, Mudrak DA, Bucharskaya AB, Matveeva OV, Tychina SA, Polukonova NV, Maslyakova GN. Effect of flavonoid-containing extracts on the growth of transplanted sarcoma 45, peripheral blood and bone marrow condition after oral and intramuscular administration in rats. Russian Open Medical Journal. 2017; 6(3):e0304. https://doi.org/10.15275/rusomj.2017.0304
  7. Tkachenko N, Pravdin A, Terentyuk G, Navolokin N, Kurchatova M, Polukonova N. Inhibiton of photodynamic haemolysis by Gratiola officinalis L. Extract. In: Progress in biomedical optics and imaging - SPIE Proceedings: Saratov Fall Meeting 2014: Optical Technologies in Biophysics and Medicine XVI; Laser Physics and Photonics XVI; and Computational Biophysics. 2015;9448:94480P.
  8. Polukonova NV, Kurchatova MN, Navolokin NA, Bucharskaya AB, Durnova NA, Maslyakova GN. A new extraction method of bioflavanoids from poisonous plant (Gratiola Officinalis L.). Russian Open Medical Journal. 2014;3(3):304.
  9. Миронов А.Н., ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012.
  10. Julka PK, Doval DC, Gupta S, Rath GK. Response assessment in solid tumours: a comparison of WHO, SWOG and RECIST guidelines. Br J Radiol. 2008;81(966):444-449.
  11. Dokladny K, Nathaniel Zuhl M, Mandell M, Bhattacharya D, Schneider S, Deretic V, Moseley PL. Regulatory coordination between two major intracellular homeostatic systems: heat shock response and autophagy. J Biol Chem. 2013;288(21):14959-14972.
  12. Yang Z, Ghoorun RA, Fan X, Wu P, Bai Y, Li J. High expression of Beclin-1 predicts favorable prognosis for patients with colorectal cancer. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 2015;39(1):98-106.
  13. Tang JY, Hsi E, Huang YC, Hsu NC, Chu PY, Chai CY. High LC3 expression correlates with poor survival in patients with oral squamous cell carcinoma. Hum Pathol. 2013;44(11):2558-2562.
  14. Liu JL, Chen FF, Lung J, Lo CH, Lee FH, Lu YC. Prognostic significance of p62/SQSTM1 subcellular localization and LC3B in oral squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 2014;111(5):944-954.
  15. Lai K, Matthews S, Wilmott JS, Killingsworth MC, Yong JL, Caixeiro NJ, Wykes J, Samakeh A, Forstner D, Lee M, McGuinness J, Niles N, Hong A, Ebrahimi A, Lee CS. Differences in LC3B expression and prognostic implications in oropharyngeal and oral cavity squamous cell carcinoma patients. BMC Cancer. 2018;18:624.
  16. Wu DH, Jia CC, Chen J, Lin ZX, Ruan DY, Li X. Autophagic LC3B overexpression correlates with malignant progression and predicts a poor prognosis in hepatocellular carcinoma. Tumour Biol. 2014;35(12):12225-12233.