На основании данных группы по изучению генома раковых заболеваний The Cancer Genome Atlas (TCGA), где выявлены различия в механизмах и путях регуляции клеточного цикла плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГШ), сформированы две группы ПРГШ по признаку ассоциации с вирусом папилломы человека (ВПЧ) ВПЧ-позитивным и ВПЧ-негативным раком [1]. Установлено, что эти две группы имеют различные механизмы канцерогенеза, уникальный мутационный профиль и экспрессируют характерные молекулярные маркеры. Предполагается, что патогенез ВПЧ-ассоциированного ПРГШ связан с нарушением пути белка ретинобластомы (pRb), а ВПЧ-негативные опухоли зачастую развиваются вследствие возникновения мутаций гена-супрессора опухолевого роста ТР53 [2].

Комплекс Rb-E2 °F является значимой системой регуляции клеточного цикла и основной мишенью для канцерогенеза, ассоциированного с вирусом папилломы человека [3, 4]. Транскрипционный фактор E2 °F в норме связан и представлен в комплексе с белком pRb. E2 °F выполняет функцию контроля транскрипции значительного числа генов, вовлеченных в регулирование клеточного цикла, апоптоза и поддержание стабильности генома [4]. При ВПЧ-позитивном ПРГШ инактивация пути Rb достигается посредством экспрессии протеина ВПЧ Е7, который связывается с RB1 и отменяет необходимость остановки механизма p16INK4A. Как результат, происходит экспрессия белка р16 в опухолевых клетках, что подтверждает ВПЧ-позитивный статус опухоли при иммуногистохимическом анализе [5]. Независимо от вариантов терапии пациенты с орофарингеальной плоскоклеточной карциномой (ОФПКК) и гиперэкспрессией р16 имеют лучшие прогноз и клинические исходы. Недавние исследования [6] продемонстрировали значимую корреляцию между экспрессией p16INK4A в качестве суррогатного маркера ВПЧ-инфекции и прогнозом при ОФПКК с выявлением ВПЧ в опухоли. В исследовании R. Klaes и соавт. [7] окрашивание p16INK4A определялось как негативное (менее 1% позитивных клеток), спорадическое (менее 5% позитивных клеток), фокальное (менее 25% позитивных клеток) или диффузное (более 25% позитивных клеток). Другие исследователи [8—10] определяли гиперэкспрессию p16INK4A как интенсивное и диффузное (цитоплазматическое и ядерное) окрашивание 70% клеток и более.

Предполагается, что мутации р53 не должны играть ведущую роль в ВПЧ-индуцированном туморогенезе в связи с тем, что ВПЧ проявляет канцерогенные свойства путем инактивации регуляторов клеточного цикла р53 и pRb. Это связано с экспрессией онкопротеинов E6 и E7.

Выявление экспрессии белка p53 в исследованиях может свидетельствовать о наличии как мутированного, так и дикого типа протеина p53, поскольку используемые во многих исследованиях моноклональные антитела (МКА) для детекции р53 способны связываться с мутированным и немутированным типами белка p53 [11].

Цель исследования — выявить экспрессию молекулярных маркеров р53 и p16INK4A при ПРГШ и оценить их влияние на клинические, морфологические характеристики опухоли и показатели общей выживаемости больных ПРГШ.

Исследованы гистологические блоки и медицинская документация 55 больных ПРГШ, проходивших лечение на базе ГБУЗ КОД № 1 Краснодара с 2011 по 2016 г. Лечение проведено согласно локализации, распространенности и принятым локальным методам. Срез данных по клиническим исходам заболевания проведен в декабре 2017 г. В исследование ретроспективно включали больных гистологически подтвержденным плоскоклеточным раком небных миндалин, мягкого неба, стенок ротоглотки, корня и тела языка, имеющих гистологический блок ткани опухоли, приемлемый для иммуногистохимического анализа, и с доступными данными по распространенности, методам лечения и исходам заболевания.

Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах автоматизированным методом на иммуногистостейнере ThermoScentific с использованием МКА к p16 (cloneINK4 BioGenex в разведении 1:25) и р53 (cloneAb-5 (DO-7) LabVision в разведении 1:100). Визуализацию реакции осуществляли системой детекции Ultra Vision Qanto Detection System HRPDAB («ThermoScentific»). Применен балльный критерий степени экспрессии p16INK4A: 0 (нет окрашивания), 1 (окрашено 1—10% опухолевых клеток), 2 (11—40%), 3 (41—70%) и 4 (более 71%) (рис. 1, а—г)

Статистический анализ выполнен с использованием статистического пакета IBMSPSS Statistics version 22. Для характеристики количественных данных использовали описательный метод расчета средних величин, статистических ошибок, для их сравнения — t-критерий Стьюдента. Для оценки достоверности различий клинико-морфологических характеристик в подгруппах в зависимости от степени экспреcсии р16INK4A использовали метод распределения χ² по Пирсону, в случаях, предусмотренных статистическими методами, индекс рассчитывали с поправкой Йетса. Значение p≤0,05 оценивали как статистически достоверное. Для оценки общей выживаемости в зависимости от молекулярных детерминант использовали метод Каплана—Майера, достоверность различий определяли по логарифмическому ранговому критерию. Значение p≤0,05 оценивали как статистически достоверное.

При анализе медицинской документации 55 больных ОФПКК и раком тела языка распределение по стадиям по классификации TNM 7-го пересмотра было следующим: I—II стадия выявлена у 15 (20%) из 55 больных, а III—IV стадия — у 40 (80)% из 55 пациентов. Только хирургический метод лечения получили 5 (9%) из 55 человек. Оперативному лечению с последующим облучением были подвергнуты 11 (20%) из 55 пациентов. Лучевую терапию получили 10 (15)% из 55, неоадъювантную химиотерапию с последующим облучением — 14 (25%) из 55 человек. Остальным 15 (28%) из 55 больных назначали только полихимиотерапию.

Из исследованных гистологических блоков гиперэкспрессия белка р53 (3+, р53≥50%) выявлена у 33 (60%) пациентов. Из них I—II стадия отмечена у 10 (30%) из 33 человек, III—IV стадия — у 25 (70%). Отрицательная экспрессия р53 (0—25%) выявлена у 13 (24%), слабая экспрессия (26—50%) — у 9 (16%) пациентов. У пациентов с отрицательной и слабой экспрессией р53 I—II стадия заболевания отмечена у 5 человек, III—IV стадия — у 15.

Экспрессия р16INK4A 40—70% (3 балла) обнаружена у 9 пациентов. Из них гиперэкспрессия р53 (р53≥50%) выявлена у 5 (56%) пациентов, экспрессия р53<50% наблюдалась у 4 (44%). Гиперэкспрессию р16≥70% (3 балла) имели 6 пациентов. Из них гиперэкспрессия р53≥50% отмечена у 4 (67%) пациентов, а отсутствие или слабая экспрессия р53 (р53≤50%) — у 2 (33%). В исследованной группе больных при иммуногистохимическом исследовании гиперэкспрессия р16INK4A (3 и 4 балла) выявлена у 15 (27%) из 55 пациентов. При этом в группе р16-позитивных человек I—II стадия отмечена у 3 (20%) из 15 больных, III—IV стадия — у 2 (80%) из 15. Из них гиперэкспрессия р53 (3+) присутствовала в опухоли 8 (53%) пациентов. Слабая экспрессия или ее отсутствие отмечены у 7 (47%) пациентов. Окрашивание р16INK4A 1 и 2 балла (менее 40% опухолевых клеток) установлено у 40 (73%) пациентов. Из них р53≥50% имели 24 (60%) пациента, р53<50% — 16 (40%) пациентов.

Выявлено, что демографические, клинические, морфологические характеристики различны в зависимости от паттерна экспрессии p16INK4A. Возраст больных в исследуемой группе составил от 36 до 82 лет (µ=56,45, σ=9,888, Ме=58, SD=1,333). При гиперэкспрессии p16INK4A (3 и 4 балла) возраст больных ПРГШ (n=15) составил от 39 до 68 лет (µ=53,4, σ=9,731, Ме=57, SD=2,512). Возраст 40 р16-негативных пациентов (при экспрессии p16INK4A <40%) составил от 36 до 82 лет (µ=57,6, σ=9,21, Ме=57, SD=1,553). При сравнении средних показателей возраста в двух группах t-критерий Стьюдента 1,42. Число степеней свободы f=53, p=0,160956. Различие показателей статистически незначимо. Половое распределение в исследуемых группах: из 15 больных с р16-позитивным статусом опухоли были 9 (60%) мужчин и 6 (40%) женщин. При р16-негативном статусе из 40 человек мужчин 35 (87,5%) и 5 (12,5%) женщин. ВПЧ-позитивный статус опухоли был статистически достоверно чаще ассоциирован с женским полом (р=0,023) (табл. 1).

При рассмотрении локализации рака ротоглотки p16INK4A-позитивный статус характерен для рака небных миндалин (р<0,001). Связь рака ротоглотки других отделов (корень языка, мягкое небо, боковые стенки ротоглотки) с p16INK4A-статусом опухоли достоверно не подтверждена, но имеется тенденция взаимосвязи рака тела языка с низкой экспрессией p16INK4A (р=0,061) (табл. 2).

Степень дифференцировки опухоли не зависела от p16INK4A-статуса опухоли (р=0,927). Р16-негативные образцы опухоли были ороговевающими или имели склонность к ороговению. Р16-позитивный рак был представлен неороговевающим типом (р=0,008). Гиперэкспрессия р53 статистически значимо коррелировала с умеренной степенью дифференцировки опухоли (р=0,021), а экспрессия р53<50% была характерна для рака тела языка (р=0,004). Высокий индекс пролиферативной активности (Ki-67≥60) также характерен для р16-позитивного рака, что отражает особенности патогенеза этого типа рака (р=0,02). Экспрессия р16 достоверно не влияет на размер первичной опухоли (Т), но выявлена взаимосвязь с более частым метастазированием в регионарные лимфатические узлы при гиперэкспрессии p16INK4A (р=0,029). По показателям общей 3-летней выживаемости в группе р16-позитивных пациентов имелось статистически значимое преимущество (р=0,016) (табл. 3).

В исследовании выявлена зависимость клинико-морфологических параметров от комплекса уровня экспрессии р16≥40% и р53≥50%. Эта комбинация молекулярных признаков встречалась у 9 пациентов из исследованной когорты, у 46 она отсутствовала. При ее наличии различий в отношении пола не выявлено, однако она отсутствовала у 40 мужчин и всего у 6 женщин (χ²=4,989; р=0,026). Связь с морфологией опухоли – ороговение и степень злокачественности — не выявлена (р=0,110 и р=0,977 соответственно). Наиболее часто комплекс маркеров встречался при раке небных миндалин (χ²=9,875; р=0,046), что статистически значимо. Имела место тенденция к статистической значимости корреляции комплекса экспрессии р16≥40% и р53≥50% и индекса пролиферативной активности Ki-67≥60% (χ²=3,341; р=0,068).

Больные с гиперэкспрессией p16INK4A (3 и 4 балла) в среднем живут дольше, чем p16INK4A-негативные. Средняя продолжительность жизни при р16-позитивности 42,702 мес, σ=5,989, Ме=60, SD=22,591; при р16-негативности µ=25,882 мес, σ=3,852, Ме=20, SD=3,039. Общая выживаемость в зависимости от экспрессии p16INK4A в подгруппах с гиперэкспрессией и без гиперэкспрессии оценена методом Каплана–Майера. При использовании логарифмического рангового критерия общая выживаемость больных p16INK4A-позитивным ПРГШ достоверно выше, чем p16INK4A-негативных пациентов без учета стадии заболевания (р=0,048).Средняя продолжительность жизни у больных III—IV стадии при р16-позитивности 43,091 мес, σ=6,718, Ме=60, SD=24,638; при р16-негативности µ=24,122 мес, σ=4,607, Ме=16, SD=5,714. Показатели общей выживаемости больных p16-позитивным ПРГШ достоверно выше, чем p16INK4A-негативных пациентов при III—IV стадии (р=0,021) (рис. 3).

Общая выживаемость в зависимости от признака коэкспрессии p16INK4A (3 и 4 балла) и р53 (3+) оценена методом Каплана—Майера. При использовании логарифмического рангового критерия общая 3-летняя выживаемость больных ПРГШ с коэкспрессией p16INK4A (3 и 4 балла) и р53 (3+) достоверно выше, чем в отсутствие сочетания этих молекулярных маркеров вне зависимости от стадии заболевания (р=0,049). При этом общая выживаемость больных ПРГШ и коэкспрессией p16INK4A (3 и 4 балла), р53 (3+) достоверно выше, чем в отсутствие сочетания этих молекулярных маркеров для III—IV стадии (р=0,01) (рис. 4).

Полученные результаты характеризуют значимую корреляцию паттерна окрашивания р16INK4A с клинико-морфологическими особенностями опухолей ПРГШ. Таким образом, при гиперэкспрессии р16INK4A (3 и 4 балла), что, согласно данным литературы, связано с ВПЧ-позитивностью опухоли, наиболее часто и статистически значимо встречается рак небных миндалин. Опубликованные данные литературы свидетельствуют о том, что гиперэкспрессия р53 при ПРГШ коррелирует с неблагоприятным прогнозом по показателям выживаемости. В данном исследовании полученные результаты не указывают на худший прогноз в отношении общей выживаемости у больных ПРГШ с гиперэкспрессией р53, более того, при комбинции экспрессии с другими молекулярными маркерами могут прогнозировать благоприятные исходы. Гиперэкспрессия р16INK4A статистически значимо связана с более высокими показателями общей выживаемости. Данные представленного исследования описывают также статистически значимую взаимосвязь комплекса уровней экспрессии р16INK4A, р53 с показателями общей выживаемости. При этом можно выделить прогностически благоприятную группу больных ПРГШ в исследованной когорте по паттерну окрашивания при сочетании уровня экспрессии р16 ≥40% (3,4 балла) и р53≥50% (3+), что отражено в более высоких показателях общей 3-летней выживаемости в сравнении с другими вариантами коэкспрессии.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.И.С., В.Н.Б.

Сбор и обработка материала — А.И.С., О.Ю.Ч., В.А.П

Статистическая обработка данных — А.И.С.

Написание текста — А.И.С.

Редактирование — А.И.С., В.Н.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Стукань А.И. — e-mail: jolie86@bk.ru; https://orcid.org/0000-0002-0698-7710

Чухрай О.Ю. — e-mail: kkod@kkod.ru

Бодня В.Н. — e-mail: vadimbodnya@rambler.ru