Рак легкого (РЛ) — наиболее часто встречающаяся злокачественная опухоль и самая распространенная причина смерти онкологических больных [1]. Наиболее агрессивным в клиническом отношении является мелкоклеточный РЛ (МРЛ). Для него доказана абсолютная связь с курением, характерны частое развитие паранеопластических синдромов, отсутствие фазы роста in situ, быстрое прогрессирование, тенденция к раннему метастазированию и высокая чувствительность к химиотерапии [1—4]. В гистологической классификации опухолей легких ВОЗ 5-го пересмотра (2015 г.) впервые МРЛ, нейроэндокринный крупноклеточный рак, типичный и атипичный карциноиды и диффузная идиопатическая легочная нейроэндокринно-клеточная гиперплазия объединены в общую группу нейроэндокринных опухолей легких [2]. При этом МРЛ относится к низкодифференцированным нейроэндокринным опухолям высокой степени злокачественности (G3) и его следует рассматривать как мелкоклеточный вариант нейроэндокринной карциномы [2, 3].
Достоверная диагностика морфологического варианта РЛ на дооперационном этапе по материалам «малых образцов» крайне важна, так как определяет дальнейшую тактику лечения, которая существенно отличается в зависимости от гистологического типа РЛ. Методом выбора при лечении МРЛ является химиотерапия, при других морфологических вариантах РЛ прибегают к хирургическому лечению зачастую в сочетании с лучевой и химиотерапией [4].
Дооперационная морфологическая диагностика РЛ в большинстве случаев основывается на исследовании так называемых «малых образцов» (термин впервые предложен в гистологической классификации опухолей легких ВОЗ 2015 г.), к которым относится «малый биопсийный» (бронхобиоптаты) и цитологический материал, получаемый, преимущественно при бронхоскопии, а также трансторакальной и трансбронхиальной игловой биопсии [2]. В последнее время все большая роль в диагностике РЛ отводится исследованию цитологического материала с использованием традиционных цитологических методов, а также методов жидкостной цитологии (ЖЦ) и клеточного блока — цитоблока (ЦБ) [5—7]. Следует подчеркнуть, что метод ЦБ имеет ряд существенных преимуществ, при этом в отечественной литературе имеются лишь единичные публикации, посвященные этому перспективному способу цитологического исследования [5, 8, 9].
В соответствии с данными литературы при гистологическом исследовании для МРЛ наиболее характерен диффузный тип роста в виде широких полей и пучков, часто ориентированных в одном направлении, реже определяются типичные для нейроэндокринных опухолей гнезда, трабекулы, розетки и палисадовидные структуры, расположенные по периферии. Клетки опухоли мелкие, обычно меньше или равны трем размерам малого лимфоцита (в среднем 10—15 мкм) и имеют округлые, овальные или вытянутые ядра и скудную цитоплазму, границы клеток обычно плохо различимы. Ядерный хроматин нежно-зернистый, а ядрышки отсутствуют или видны неотчетливо. Для опухоли характерны обилие некрозов, нередко весьма обширных, высокая митотическая активность (в среднем 60—80 митозов на 2 мм2) и краш-феномен, который проявляется в ткани опухоли наличием скоплений разрушенных опухолевых клеток и тяжей базофильной ядерной субстанции [1—3].
В отличие от гистологической картины в цитологических мазках клетки опухоли обычно расположены цепочками или тяжами, могут образовывать компактные трехмерные комплексы («виноградная гроздь», «монетный столбик» и др.), реже — розетко- и палисадоподобные структуры. Определяется много изолированных клеток, «голых» ядер и тяжей ядерной субстанции, что является проявлением краш-феномена. По данным литературы, клетки МРЛ в цитологических образцах имеют мелкий или средний размер (в зависимости от вида цитологического материала), в среднем в 1,5 раза больше такового малого лимфоцита и равны по размеру ядер клеток бронхиального эпителия [2, 5—7].
Несмотря на наличие большого количества исследований, посвященных изучению морфологических особенностей МРЛ [1—3, 5—9], в литературе практически отсутствуют данные о морфометрии клеток МРЛ по материалам «малых образцов», полученных различными методами.
Цель исследования — проведение морфометрии размера клеток МРЛ по материалам «малых образцов» и сравнительный анализ морфометрических показателей при морфологическом исследовании гистологического и цитологического материала, включая методы ЖЦ и ЦБ.
Материал и методы
В исследование включены «малые образцы» 131 пациента консультативно-диагностической поликлиники Легочно-хирургического центра ГБУЗ СО ПТД с клиническим диагнозом МРЛ, проходивших лечение в период с 2009 по 2016 г. Из них 122 (93%) мужчины в возрасте от 32 до 87 лет и 9 (7%) женщин в возрасте от 51 до 71 года. Указанным пациентам в амбулаторно-поликлинических условиях в соответствии со стандартными диагностическими протоколами была выполнена бронхоскопия и трансбронхиальная биопсия стенки пораженного бронха с забором материала для гистологического и цитологического метода исследования.
Для отбора пациентов использовали морфологические критерии МРЛ согласно гистологической классификации опухолей легких ВОЗ 2015 г., определяемые на светооптическом уровне в гистологических препаратах с окраской гематоксилином и эозином бронхобиоптатов указанных больных [2].
«Малые образцы» всех пациентов разделили на две группы в зависимости от характера и способа получения материала. В 103 случаях (1-я группа) выполнили только щипцовую биопсию стенки пораженного бронха. Полученные бронхобиоптаты одних и тех же больных параллельно исследовали при помощи традиционного гистологического и цитологического метода исследования. При гистологическом исследовании кусочки фиксировали в 10% забуференном формалине, заливали в парафин и микротомировали. Параллельно для цитологического исследования изготавливали мазки-отпечатки бронхобиоптатов на предметных стеклах с дальнейшей фиксацией цитопрепаратов в 96% этиловом спирте и окраской азур-эозином по Романовскому.
В 28 случаях (2-я группа) во время бронхоскопии, помимо щипцовой биопсии стенки бронха, выполняли трансбронхиальную аспирацию содержимого пораженного бронха при помощи катетера и электроотсоса. Таким образом, морфологическому исследованию подлежали не только бронхобиоптаты и их отпечатки на предметном стекле, но и другой вид цитологического материала — аспираты из бронхов. Аспирированное содержимое бронхов помещали в транспортную среду (Thermo Scientific Shandon Cytospin Collection Fluid) для получения клеточной суспензии, которую в дальнейшем исследовали методом ЖЦ и ЦБ с использованием цитоцентрифуги Cytospin 4 и системы Cytoblock (Cell Block Preparation System) фирмы Shandon. Готовые жидкостные микропрепараты фиксировали в 96% этиловом спирте и окрашивали азур-эозином по Романовскому, клеточные блоки подвергали стандартному гистологическому исследованию аналогично бронхобиоптатам по вышеописанной методике [5].
Для морфометрического исследования и оценки размеров клеток МРЛ в гистологических и цитологических препаратах использовали микроскоп Olympus CX41 с цифровой камерой DP27 (Olympus Corporation, Япония) и пакет программного обеспечения Phmias by Phenix с функцией морфометрии (Phenix Jiangxi Optical, Китай).
Морфометрическое исследование проводили параллельно на гистологическом и цитологическом материале бронхобиоптатов одних и тех же пациентов. Выполняли измерение площади профильного поля 50 максимально сохранивших свою структуру опухолевых клеток в каждом образце при 400-кратном увеличении. В 103 случаях измерение площади профильного поля клеток МРЛ выполняли параллельно на двух видах «малых образцов» (бронхобиоптатах и их мазках-отпечатках), в 28 случаях — параллельно на четырех видах «малых образцов» (бронхобиоптатах и их мазках-отпечатках), а также на жидкостных микропрепаратах и материале ЦБ, полученных из аспирированного содержимого бронхов.
В интерфейсе программы Phmiasby Phenix первоначально получали фотоизображение опухолевой ткани, затем выбирали наиболее сохранившие свою структуру участки и проводили ручное выделение контуров измеряемого объекта, программа автоматически вычисляла площадь профильного поля опухолевых клеток (рисунок). Эти данные экспортировали в программу Microsoft Excel и группировали в четыре раздела (гистологическое исследование, цитологические мазки-отпечатки, жидкостная цитология, цитоблок) для дальнейшей статистической обработки.
Морфометрия клеток МРЛ по материалам «малых образцов» в программе Phmias by Phenix.
а — гистологический препарат, окраска гематоксилином и эозином; б — мазок-отпечаток, окраска азур-эозином; в — жидкостной препарат, окраска азур-эозином; г — цитоблок, окраска гематоксилином и эозином, ×400.
Статистическую оценку клинической информативности различных методов морфологической диагностики МРЛ по материалам «малых образцов» проводили с помощью программы Statistica 8.0. Нормальность выборки определяли методом Колмогорова—Смирнова. В 1-й группе «малых образцов» ввиду соответствия выборки нормальному распределению использовали параметрический t-критерий Стьюдента для связанных совокупностей. Во 2-й группе вследствие несоответствия выборки нормальному распределению применяли непараметрический критерий Краскела—Уоллиса. В обеих группах различия считали значимыми при p<0,05.
Результаты и обсуждение
По данным морфометрического исследования «малых образцов» выявлено, что площадь профильного поля клеток МРЛ существенно варьирует в зависимости от вида морфологического материала и способа его получения (таблица). При гистологическом исследовании бронхобио-птатов площадь профильного поля опухолевых клеток в 1-й группе колеблется от 7,72 до 97,11 мкм (среднее значение 31,48 мкм), во 2-й группе показатели площади профильного поля клеток схожи: 9,44—97,11 мкм (среднее значение 32,22 мкм). В цитологических мазках-отпечатках биоптатов бронхов площадь профильного поля клеток существенно возрастает и составляет 27,07—406,65 мкм в обеих группах (среднее значение 124,37 и 126,93 мкм соответственно). В жидкостных микропрепаратах, изготовленных из аспирированного содержимого бронхов, площадь профильного поля клеток МРЛ существенно меньше и составляет 11,53—52,14 мкм (среднее значение 22,27 мкм). В препаратах ЦБ размер клеток опухоли приближен к гистологическим образцам и варьирует от 16,29 до 82,47 мкм (среднее значение 36,341 мкм).
Площадь профильного поля клеток МРЛ по материалам «малых образцов»
| Показатель | Площадь, мкм | |||
| Min | Max | Среднее значение | Доверительный интервал | |
| 1-я группа (n=103): | ||||
| Гистология | 7,72 | 97,11 | 31,48 | 31,48±11,20 |
| Цитология (мазки-отпечатки) | 27,07 | 406,65 | 124,37 | 124,37±41,57 |
| 2-я группа (n=28): | ||||
| Гистология | 9,44 | 97,11 | 32,22 | 32,22±11,06 |
| Цитология (мазки-отпечатки) | 27,07 | 406,65 | 126,93 | 126,93±40,95 |
| Жидкостная цитология | 11,53 | 52,14 | 22,26 | 22,26±4,76 |
| Цитоблок | 16,29 | 82,47 | 36,34 | 36,34±9,42 |
Площадь профильного поля опухолевых клеток в цитологических мазках-отпечатках бронхобиоптатов оказалась практически в 4 раза больше, чем в гистологических препаратах, в 3 раза больше, чем в материале ЦБ, и в 6 раз больше, чем в жидкостных образцах. Площадь профильного поля клеток МРЛ в гистологических препаратах и материале ЦБ отличается незначительно. Соотношение площадей профильного поля опухолевых клеток при МРЛ в зависимости от вида морфологического материала по убывающей можно отобразить следующим образом: 6 (мазки-отпечатки) : 2 (ЦБ) : 1,5 (гистологические препараты) : 1 (ЖЦ).
Статистический анализ полученных данных морфомет-рии выявил значимые различия площадей профильного поля клеток МРЛ в 1-й группе (Meцит=124,37, Meгист=31,48, Diff=92,88, t=155,92, df=5124, p=0,0000) и во 2-й группе (H (3, N=5600)=4052,138, p=0,000).
Выявленная вариабельность размеров опухолевых клеток при исследовании гистологического и цитологического материала «малых образцов», по нашему мнению, может быть обусловлена особенностями морфологического строения МРЛ, а именно повышенной «хрупкостью» опухолевой ткани при механическом воздействии в силу низкой степени дифференцировки опухоли, а также может зависеть от способа получения материала для морфологического исследования и методики изготовления микропрепаратов. Традиционный цитологический метод исследования заключается в «ручном» изготовлении микропрепаратов из «нефиксированной» опухолевой ткани, полученной путем щипцовой биопсии при бронхоскопии, в итоге клетки опухоли подвергаются двойной травматизации. Первоначально ткань опухоли раздавливается кусачками бронхоскопа при биопсии, а затем подвергается артефициальным изменениям в виде механического распластывания на стекле с укрупнением размера клеток при изготовлении мазков-отпечатков. В отличие от традиционной цитологии жидкостная методика подразумевает изготовление микропрепаратов из предварительно фиксированного в транспортной среде материала при помощи цитоцентрифуги, что позволяет сохранить мелкие размеры и форму клеток опухоли. Однако клетки опухоли теряют свои межклеточные связи в процессе центрифугирования и распределения на стекле в виде монослоя, что создает трудности в проведении дифференциальной диагностики МРЛ с другими мелкоклеточными опухолями. Незначительные отличия размера клеток МРЛ в гистологических препаратах и материале ЦБ обусловлены, наиболее вероятно, самой методикой изготовления клеточных блоков, заключающейся в комбинации цитологической техники центрифугирования «фиксированной» клеточной взвеси и заключении материала в свертке фибрина или гелевой матрице, которые в дальнейшем подвергаются всем технологическим этапам исследования гистологического материала аналогично бронхобиоптатам.
Таким образом, полученные в ходе проведенного исследования результаты свидетельствуют о существенной вариабельности размера клеток МРЛ на материале «малых образцов».
Выводы
1) Впервые проведено сравнительное морфометрическое исследование площади профильного поля клеток МРЛ по материалам «малых образцов», полученных при традиционном гистологическом исследовании бронхобиоптатов опухоли, цитологическом исследовании мазков-отпечатков, а также с использованием методов ЖЦ и ЦБ бронхиальных аспиратов.
2) Исследование позволило продемонстрировать статистически достоверные различия размера клеток опухоли в сравниваемых вариантах материала «малых образцов». При этом минимальный размер опухолевых клеток выявлен в жидкостных микропрепаратах (22,26 мкм), а максимальный — в цитологических мазках-отпечатках (124,37 мкм). Размер клеток опухоли в материале ЦБ (36,34 мкм) сопоставим с размером клеток в гистологических образцах (31,48 мкм).
3) Вариабельность размера клеток МРЛ в различных вариантах «малых образцов» свидетельствует о высокой пластичности клеток опухоли и зависит от метода получения материала, особенностей его фиксации и методики морфологического исследования. При этом следует подчеркнуть, что наиболее близким к традиционному гистологическому методу исследования является метод ЦБ, при котором цитологический клеточный материал концентрируется и подвергается микротомированию по аналогии с тканевым материалом биоптата.
4) Выявленные достоверные различия размера клеток опухоли при МРЛ в материале «малых образцов», полученных разными способами, следует учитывать при проведении морфологической диагностики, что будет способствовать ее объективизации и совершенствованию.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования: Н.Е. Костерина, Л.М. Гринберг
Сбор и обработка материала: Н.Е. Костерина, Г.С. Сенькин
Статистическая обработка данных: Г.С. Сенькин
Написание текста: Н.Е. Костерина
Редактирование: Л.М. Гринберг
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
<