Секреторная карцинома молочной железы — это инвазивный рак, состоящий из эпителиальных клеток с внутриклеточными секреторными вакуолями и внеклеточных эозинофильных пузырьков с секретом, имеющих различное строение. Опухоль может локализоваться в любом сегменте молочной железы и, как правило, характеризуется медленным ростом, а сам узел безболезненный и смещается относительно окружающих тканей, иногда в опухолевый процесс вовлекается сосок [1]. При лучевых исследованиях выявляется опухолевое образование с четким контуром, дольчатого строения, больше напоминающее доброкачест-венную опухоль [2].

Этот вид опухоли очень редкий и встречается менее чем в 0,05% всех инвазивных карцином молочной железы, чаще выявляется у женщин, но может быть у мужчин и у подростков. Возраст больных колеблется от 3 до 87 лет, средний возраст пациентов 53 года [3, 4].

При макроскопическом исследовании обычно диагностируется одиночный узел с четкими контурами, серовато-белой или желтоватой поверхностью на разрезе. Реже выявляются множественные очаги. Средний диаметр описанных образований — 2 см, но размеры варьируют от 0,5 до 16 см.

Секреторные карциномы содержат полигональные клетки с эозинофильной гранулированной или вакуолизированной цитоплазмой, круглыми и овальными ядрами. Опухоль может формировать микрокистозные, ячеистые, солидные, тубулярные и папиллярные структуры. Микрокистозные участки могут симулировать тиреоидные фолликулы. Большинство секреторных карцином смешанного строения. Ядерный полиморфизм, как правило, слабый или умеренный, митотическая активность низкая. Опухоль обычно имеет 1-ю или 2-ю градацию по Ноттингемской системе, high-grade-карциномы встречаются исключительно редко.

Клетки секреторной карциномы при иммуногистохимическом исследовании обычно диффузно экспрессируют CEA, S100, маммаглобин, SOX10, MUC4. В большинстве из них выявляются базальные маркеры (СК5/6, EGFR), хотя и фокально. GATA3, CK8/18, CD117 и виментин также могут быть позитивными. Хотя подавляющая часть этих карцином имеет тройной негативный фенотип (негативные ER, PR, HER2), однако уровень экспрессии Ki-67 часто ниже 20% [3].

Дифференциальный диагноз секреторной карциномы включает инвазивный рак с апокриновой дифференцировкой (обычно андрогенпозитивный), ацинозно-клеточную карциному, столбчато-клеточную карциному с обратной полярностью, кистозную гиперсекретирующую карциному in situ.

По данным молекулярно-генетических исследований секреторная карцинома молочной железы часто ассоциируется со слиянием генов ETV6—NTRK3 [3].

Нейтрофильные тропомиозиновые рецепторы тирозинкиназы (NTRK) — это семейство из трех протоонкогенов, NTRK1, NTRK2 и NTRK3, которое кодирует соответственно 3 белка: TrkA, TrkBи TrkC. В норме эти белки вовлечены в различные биологические процессы, в том числе дифференцировку клеток и приспосабливаемость к изменению физиологических условий вокруг клетки. В различных опухолях в онкогенный процесс вовлекаются различные домены NTRK [5]. Учитывая потенциальную онкогенную активность, перестройки NTRK стали очередной терапевтической мишенью для таргетной терапии [6—10].

Для определения имеющейся перестройки используется ряд диагностических методов: секвенирование нового поколения (NGS), обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР), флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) и классическая иммуногистохимия [11, 12].

Безусловно, NGS является одним из самых чувствительных и специфичных тестов и в большинстве случаев будет работать независимо от гена-партнера, определяя все множество различных транслокаций NTRK. Однако методы на основе ДНК-секвенирования могут быть сложными для разработки панели из-за большого размера интронов генов NTRK. Помимо этого метод весьма дорогостоящий, требующий времени для проведения, надлежащее оборудование и квалификацию специалистов, что делает его непригодным для использования в качестве скрининга [13].

ПЦР также высокочувствительный метод, при этом более экономичен и не требует значительного времени для выполнения. Недостатком является невозможность выявить перестройки, не заложенные в диагностическую панель, а также необходимость проведения индивидуальной пробы для каждой транслокации [14].

Флюоресцентная гибридизация in situ может определять неизвестные транслокации NTRK, однако при этом используются три зонда отдельно для каждого гена NTRK, а для известных транслокаций (например, NTRK3—ETV6 при инфантильной фибросаркоме) — специфичные пробы [13]. Анализ может быть выполнен достаточно быстро (в течение 2 дней), хотя и требует специального оборудования для оценки. Основными недостатками метода являются высокая стоимость (необходимо три зонда) и достаточный объем опухолевого материала.

Объективным и доступным методом скрининга может быть иммуногистохимический метод. Обладая сравнительно невысокой специфичностью, метод весьма чувствителен, доступен по стоимости и времени, а также не требует большого объема материала [14]. Антитела к panTRK в отличие от всех описанных выше методов созданы для выявления наличия белков семейства TRK, а не генов в ДНК или РНК опухолевых клеток. В настоящее время для иммуногистохимических исследований чаще всего используется тест VENTANApan-TRK (EPR17341), выявляющий С-концевую область тропомиозин-рецепторной киназы А, В и С, присутствующую в белках дикого и химерного типа. В зависимости от того, какие произошли мутации в клетке, реакция с антителами дает ядерное, перинуклеарное, мембранное, цитоплазматическое окрашивание различной интенсивности или комбинацию вариантов [5]. Это усложняет метод, делает его более субъективным и оставляет ему место только в рамках скрининга [11].

Зачем нужно определять транслокации NTRK? Согласно данным G.Demetri и соавт. [15] применение энтректиниба (ингибитора TrkA/B/C и ROS1) способно обеспечить частоту объективного ответа 57,4% (95% ДИ 8,0—14,9) при наблюдении пациентов с местно-распространенными и метастатическими опухолями с транслокацией NTRK в течение 15,5 мес. При этом медиана времени без прогрессирования заболевания составила 11,2 мес (95% ДИ 7,1—NR).

Перестройки NTRK чаще всего встречаются в редких опухолях, таких как секреторная карцинома молочной железы, аналог секреторной карциномы слюнной железы (MASK), врожденная инфантильная фибросаркома и врожденная мезобластная нефрома, а также в некоторых других опухолях детского возраста [16]. В ряде исследований показано, что частота встречаемости реаранжировки гена NTRK в солидных опухолях невысока и составляет в карциномах молочной железы от 0,18% [17]. Однако в некоторых редких опухолях, например секреторной карциноме слюнной железы или в воспалительной миофибробластической опухоли, может встречаться достаточно часто. Это показывает важную роль патолога в выборе пациентов для выявления генетических перестроек в гене NTRK на основе морфологического исследования.

Клинический случай

Для определения тактики лечения в клинику ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава РФ обратилась пациентка К., 51 год, которая в октябре 2019 г. самостоятельно нащупала уплотнение в правой молочной железе, обратилась в региональную больницу, где провели УЗИ, маммографию и core-биопсию образования. На основании полученных данных был выставлен диагноз: С50.4 Злокачественное новообразование верхненаружного квадранта молочной железы, рак правой молочной железы, T2N0M0. Стадия IIA. Гистологическое заключение: аденокистозный рак, реакции с антителами к эстрогеновым, прогестероновым рецепторам и HER2 отрицательные, Ki-67 — 7%. Принято решение о проведении операции на первом этапе. По результатам патолого-анатомического исследования операционного материала обнаружен беловатый опухолевый узел с четкими контурами размером 2,5×2,5×2 см, диагноз: инфильтративная карцинома неспецифического типа, G2, pT2N0.

При пересмотре препаратов биопсийного и операционного материала в лаборатории клиники РМАНПО в опухоли выявлены полигональные опухолевые клетки с эозинофильной цитоплазмой, округлыми ядрами и множеством внутри- и внеклеточных вакуолей, заполненных слизью. Клетки формировали преимущественно микрокисты и фолликулоподобные структуры, мелкие солидные скопления (рис. 1, 2). Некоторая деформация опухоли в биопсии диктовала необходимость дифференциального диагноза с аденокистозной карциномой, однако клетки опухоли не были базалоидными и не формировали розетковидных структур. Заключение: секреторная карцинома молочной железы, ICD-O-code — 8502/3, G2, pT2N0, R0, LVI0, VI0.

Рис. 1. Секреторная карцинома молочной железы, биопсийный материал, ×10.

Рис. 2. Секреторная карцинома молочной железы, операционный материал, ×20.

Учитывая последние данные об эффективности энтректиниба в лечении секреторных карцином молочной железы, пациентке рекомендовано проведение анализа для определения экспрессии белка TRK и наличия мутаций в генах NTRK. Для исследований методом иммуногистохимии были изготовлены срезы толщиной 4 мкм и помещены на положительно заряженные предметные стекла. Иммуногистохимическое исследование выполнено с антителами VENTANA pan-TRK (EPR17341) Assay в иммуностейнере VENTANA Bench Mark ULTRA. Для детекции применялся набор Opti View DAB IHC Detection Kit (VENTANA) по стандартному протоколу, рекомендованному производителем. В качестве контроля использован реагент негативного контроля (Rabbit Monoclonal Negative ControlIg VENTANA) и внутрилабораторный позитивный контроль (ткань аппендикса). Оценивалась реакция различной локализации (ядерная, цитоплазматическая).

Для исследования методом флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) приготовлены срезы толщиной 3 мкм, которые после депарафинизации и протеолиза гибридизовались с пробой NTRK3 Break Apart FISH Probe Kit (производство компании CytoTest, США) согласно протоколам производителя с незначительными модификациями. Результат гибридизации оценивался после просмотра препарата в флюоресцентном микроскопе Axioimager Z2 (Zeiss, Германия). Исследовался весь препарат, подсчитывалось не менее 100 опухолевых клеток в 4 различных зонах. Признаком перестройки гена NTRK3 считалось обнаружение более 15% ядер опухолевых клеток с расщепленным сигналом (расхождение сигналов более, чем на 2 диаметра наибольшего, красного сигнала) или с отдельно лежащими красными сигналами, соответствующими тирозинкиназному домену исследуемого гена.

Результаты иммуногистохимического исследования и FISH-метода продемонстрировали следующее: на срезах с иммуногистохимическим окрашиванием с антителами VENTANA pan-TRK (EPR17341) Assay обнаружена положительная реакция в ядрах части опухолевых клеток, что оценено как положительный результат (рис. 3). Учитывая специфику иммуногистохимического выявления белков TRK, в лаборатории молекулярной биологии МГОБ №62 было также проведено FISH-исследование, по результатам которого реаранжировка гена NTRK3 была подтверждена (рис. 4, а, б). При оценке исследуемого образца обнаружено, что 80% опухолевых клеток демонстрируют признаки транслокации гена NTRK3. В клетках выявлялся один слитный сигнал, соответствующий неперестроенному гену NTRK3, и 1—2 пары расщепленных сигналов, указывающих на наличие перестройки. Таким образом, транслокация исследуемого гена была подтверждена.

Рис. 3. Иммуногистохимическая реакция с антителами к pan-TRK, ×20.

Рис. 4. Результаты FISH-исследования перестроек в гене NTRK3 (а, б).

Слитные сигналы соответствуют неперестроенному гену, раздельно лежащие сигналы подтверждают транслокацию.

Заключение

Пример данного клинического случая показал необходимость внимательного отношения патолога при рутинном гистологическом исследовании рака молочной железы. Следует всегда помнить о редких морфологических вариантах, имеющих индивидуальный прогноз и чувствительность к терапии. Так, при некоторых вариантах (тубулярная и крибриформная карцинома) можно ограничиться только хирургическим лечением на начальных стадиях заболевания. При выявлении нейроэндокринной дифференцировки возможна коррекция лекарственной терапии. Устанавливая секреторный рак молочной железы, необходимо провести первичное иммуногистохимическое исследование и обязательно направить материал для подтверждения транслокации гена NTRK3 на молекулярно-генетическое исследование. Это позволит пациентам с таким диагнозом получить адекватное таргетное лечение.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.