Рабдомиосаркома (РМС) — наиболее распространенная солидная опухоль у детей [1]. РМС составляет 45—60% среди мягкотканных сарком и 5—10% среди всех солидных опухолей у детей [2]. Гистологическая диагностика базируется на данных, полученных при морфологическом, иммуногистохимическом и ультраструктурном исследовании биоптата опухоли [3]. В настоящий момент существует несколько классификаций РМС, но наиболее используемой является классификация ВОЗ, которая включает эмбриональную (ЭРМС), альвеолярную (АРМС), веретеноклеточную/склерозирующую (ВРМС) и плеоморфную (ПРМС) [4, 5]. В 2011 г. группа исследователей описала эпителиоидную рабдомиосаркому (ЭпРМС), которая в настоящее время не включена в классификацию ВОЗ, но рассматривается специалистами как отдельная единица [6, 7]. Кроме того, в 2019 г. была описана новая внутрикостная РМС, для которой характерна аномальная транслокация EWSR1/FUS-TFCP2 [8].
Каждая из РМС определяется как самостоятельная нозологическая форма с индивидуальными особенностями гистологического строения, вариантами иммунофенотипа, генетическими основами и, что является важным следствием, различным клиническим течением и прогнозом [9].
Корректная диагностика РМС требует применения широкого спектра методик, включая иммуногистохимические и генетические исследования (FISH, PCR), однако классические гистологические исследования информативны до определенной степени и недостаточны. Долгое время традиционными маркерами для иммуногистохимической идентификации РМС являлись общие маркеры мезенхимальной дифференцировки и маркеры, ассоциированные с промежуточными филаментами мышечной ткани, — виментин, мышечно-специфический актин (MSA, muscle specific actin), Myosin и Myoglobin. [10, 11]. В то же время эти маркеры не обладают необходимой специфичностью для РМС в связи с присутствием данных белков в ряде иных опухолей. Ядерные транскрипторные факторы, участвующие в миогенезе, такие как MyoD (myf3) и Myogenin (myf4), имеют высокую чувствительность и специфичность и нашли широкое диагностическое применение относительно недавно. Практически во всех случаях РМС отмечается ядерная экспрессия миогенных транскрипторных факторов, в то время как в зрелой здоровой мышечной ткани экспрессия MyoD1 и Myogenin не обнаружена, поскольку действие этих факторов в норме ограничено событиями эмбриогенеза [12, 13].
В то же время РМС демонстрируют экспрессию маркеров, не свойственных мышечной ткани и принадлежащих к иным линиям дифференцировки, что может быть связано с дивергентностью дифференцировки опухолевой ткани [14—17].
Цель работы — качественная и количественная оценка экспрессии транскрипторных миогенных факторов на большой выборке случаев РМС, выявление потенциальных фенотипических различий у разных РМС, а также оценка распространенности и частоты встречаемости аберрантных маркеров, в частности ALK, PAX5, WT1, PCK, CAM5.2, SIX1 и Synaptophysin, в тканях РМС.
Материал и методы
Проведен ретроспективный анализ данных пациентов, у которых за период с 2013 по 2019 г. был верифицирован диагноз рабдомиосаркомы.
На основании полученных сопроводительных документов и результатов исследования микроскопических препаратов из архива отделения были отобраны 250 парафиновых блоков материала, поступившего от пациентов с РМС. Вместе с парафиновыми блоками для каждого случая проведен подбор гистологических стекол, окрашенных гематоксилином и эозином. Диагноз РМС и ее вариант как критерий отбора в исследование повторно определяли три специалиста независимо друг от друга. Отбор архивного материала осуществлялся в соответствии с требованиями этического комитета учреждения и информированным добровольным согласием на исследование пациентов или их представителей. Всего в исследование включены 202 образца опухолевой ткани, 48 образцов исключены из выборки по техническим или иным причинам. Подготовку к микродиссекции опухолевого материала из парафиновых блоков проводили под контролем среза, окрашенного гематоксилином и эозином.
Из полученного объема материала собраны 5 мультиблоков (tissue microarray) для проведения последующих исследований. Материал в блоках картирован с использованием заведомо чужеродных контролей.
Техническую часть исследования осуществляли с помощью EverBio AutoTiss 10C (EverBio Technology Inc., Тайвань), автоматизированной системы для создания тканевых матриц (ТМА) на блоках-реципиентах. Диаметр используемого панча (core) — 2 мм. На полученных серийных срезах ТМА проводили иммуногистохимическое исследование экспрессии Myogenin, MyoD1, ALK (с использованием клонов антител D5F3 и p80), PAX5, WT1, PCK, Synaptophysin, CAM5.2, SIX1.
Интенсивность иммуногистохимических реакций с антигенами ALK (D5F3 и p80), PAX5, WT1, PCK, Synaptophysin, CAM5.2, SIX1 оценивали качественным способом (наличие/отсутствие реакции).
Результаты иммуногистохимической реакции с антителами к транскрипционным факторам Myogenin и MyoD1 оценивали по балльной шкале от 0 до 3, учитывая выраженность ядерной реакции: 0 — отсутствие реакции (0% клеток с позитивной реакцией), 1 — слабая реакция (менее 30% экспрессирующих клеток), 2 — умеренная реакция (30—70% экспрессирующих клеток), 3 — сильная реакция (более 70% экспрессирующих клеток). Также осуществлен анализ экспрессии Myogenin и MyoD1 с помощью программного обеспечения Aperio ImageScope 12.3.3 (Leica Biosystems, США). Алгоритм анализа продемонстрирован на рис. 1.
Рис. 1. Алгоритм анализа экспрессии миогенных транскрипторных факторов (на примере Myogenin).
а — общий вид среза исследуемой ТМА-матрицы, окраска гематоксилином и эозином, ×20; б, в — выделение области интереса, б — ×200, в — ×400; г, д — анализ экспрессии Myogenin в клеточных ядрах с применением математического алгоритма Nuclear v9, г — ×200, д — ×400.
Статистическую обработку данных проводили с помощью программного пакета Statistica 13.0. (StatSoft, Россия). При сравнении исследуемых групп по категориальным признакам использовали критерий χ2 Пирсона. Различия между сравниваемыми параметрами считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты
Клинико-патологическая характеристика пациентов с РМС, включенных в исследование, приведена в табл. 1. РМС была диагностирована у 88 лиц женского пола и у 114 лиц мужского пола в возрасте от 16 дней до 18 лет (медиана возраста составила 5,6 года). В группу исследования вошли 10 детей в возрасте до 1 года, 190 детей в возрасте от 1 года до 18 лет и 2 взрослых пациента (32 и 44 года). Наиболее часто первичная опухоль локализовывалась в области головы и шеи (у 69 пациентов), в урогенитальном тракте (у 44 пациентов), в мягких тканях нижних и верхних конечностей опухоль располагалась у 22 и 16 пациентов соответственно. Другие анатомические области (туловище, грудная клетка, брюшная полость, забрюшинное пространство и таз) были вовлечены реже. У 7 пациентов опухоль затрагивала несколько анатомических областей, а у 11 пациентов локализация опухоли была неизвестна.
Таблица 1. Клинико-патологическая характеристика пациентов с РМС
| Характеристика | Количество пациентов, абс. (%) |
| Возраст, годы: | |
| младше 1 года | 10 (5) |
| 1—18 | 190 (94) |
| старше 18 | 2 (1) |
| Пол: | |
| мужской | 114 (56) |
| женский | 88 (44) |
| Локализация опухоли: | |
| область головы и шеи | 69 (34) |
| верхняя конечность | 16 (8) |
| нижняя конечность | 22 (11) |
| туловище | 3 (2) |
| грудная клетка | 3 (2) |
| забрюшинное пространство | 7 (3) |
| область таза | 8 (4) |
| урогенитальный тракт | 44 (22) |
| брюшная полость | 12 (6) |
| вовлечение нескольких анатомических областей | 7 (3) |
| локализация неизвестна | 11 (5) |
| Вариант РМС: | |
| ЭРМС | 103 (51) |
| АРМС | 80 (40) |
| ВРМС | 16 (8) |
| ЭпРМС | 2 (1) |
| БДУ | 1 (0) |
ЭРМС была диагностирована в 103 случаях, АРМС — в 80 случаях, ВРМС обнаружена в 16 случаях, ЭпРМС — в 2 случаях. В 1 случае вследствие недостаточного количества гистологического материала не удалось точно верифицировать вариант РМС. Наиболее частая локализация ЭРМС — урогенитальный тракт (39%) и область головы и шеи (34%). АРМС в 28% случаев диагностирована в области головы и шеи, верхние и нижние конечности были затронуты в 15 и 19% случаев соответственно. Для ВРМС характерными локализациями оказались область головы и шеи (31%) и урогенитальный тракт (25%). Более подробное распределение РМС по анатомическим областям отражено в табл. 2.
Таблица 2. Локализация рабдомиосаркомы
| Локализация | Количество пациентов | |||
| ЭРМС | АРМС | ВРМС | ЭпРМС | |
| Область головы и шеи | 40/103 | 22/80 | 5/16 | 1/2 |
| Верхняя конечность | 1/103 | 12/80 | 3/16 | — |
| Нижняя конечность | 6/103 | 15/80 | 1/16 | — |
| Туловище | 1/103 | 2/80 | — | — |
| Грудная клетка | — | 2/80 | 1/16 | — |
| Забрюшинное пространство | 6/103 | — | 1/16 | — |
| Область таза | — | 7/80 | 1/16 | — |
| Урогенитальный тракт | 35/103 | 6/80 | 4/16 | — |
| Брюшная полость | 9/103 | 3/80 | — | — |
| Несколько анатомических областей | 2/103 | 4/80 | — | 1/2 |
| Локализация неизвестна | 3/103 | 7/80 | 1/16 | — |
Результаты иммуногистохимических исследований приведены в табл. 3—6 и проиллюстрированы на рис. 2—6. Ввиду технических особенностей проведения исследований с применением тканевых матриц некоторое количество образцов было утрачено. Таким образом, иммуногистохимические исследования проведены на 75 образцах АРМС из 80, на 87 образцах АРМС из 103. От 0 до 2 образцов ВРМС в зависимости от исследуемого маркера были утеряны, что отражено в табл. 3—6. Для двух образцов ЭпРМС удалось исследовать экспрессию лишь миогенных транскрипторных факторов, ALK и SIX1.
Таблица 3. Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии MyoD1 (myf3) в ткани РМС
| Вариант РМС | Число позитивных образцов | Интенсивность реакции | ||
| 1+ | 2+ | 3+ | ||
| Альвеолярная (n=75) | 75 | 32 | 35 | 8 |
| Эмбриональная (n=87) | 87 | 54 | 28 | 5 |
| Веретеноклеточная/склерозирующая (n=14) | 14 | 8 | 3 | 3 |
| Эпителиоидная (n=1) | 1 | 1 | 0 | 0 |
Таблица 4. Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии Myogenin (myf4) в ткани РМС
| Вариант РМС | Число позитивных образцов | Интенсивность реакции | ||
| 1+ | 2+ | 3+ | ||
| Альвеолярная (n=75) | 75 | 35 | 35 | 5 |
| Эмбриональная (n=87) | 87 | 69 | 16 | 2 |
| Веретеноклеточная/склерозирующая (n=15) | 15 | 13 | 2 | 0 |
| Эпителиоидная (n=1) | 1 | 1 | 0 | 0 |
Таблица 5. Результаты иммуногистохимического исследования экспрессии аберрантных маркеров в ткани РМС
| Вариант РМС | Количество позитивных образцов | |||||||
| ALK (D5F3) | ALK (p80) | PAX5 | PCK | WT1 | SYP | CAM5.2 | SIX1 | |
| Эмбриональная | 25/87 | 4/87 | 0/87 | 12/87 | 15/87 | 9/87 | 0/87 | 77/87 |
| Альвеолярная | 43/75 | 7/75 | 13/75 | 20/75 | 15/75 | 12/75 | 0/75 | 62/75 |
| Веретеноклеточная/склерозирующая | 3/14 | 0/14 | 0/14 | 2/14 | 1/14 | 0/14 | 1/14 | 8/14 |
| Эпителиоидная | 2/2 | 2/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 1/2 |
Таблица 6. Результаты исследования паттерна экспрессии ALK в ткани РМС
| Вариант РМС | Количество образцов с фокальной/диффузной экспрессией | |
| ALK (D5F3) | ALK (p80) | |
| Эмбриональная | 16/25 | 3/4 |
| Альвеолярная | 22/43 | 5/7 |
| Веретеноклеточная/склерозирующая | 1/3 | — |
| Эпителиоидная | 0/2 | 0/2 |
Рис. 2. Морфологическая картина различных вариантов РМС.
а—в — эмбриональная рабдомиосаркома (ЭРМС); г—е — альвеолярная рабдомиосаркома (АРМС); ж—и — веретеноклеточная/склерозирующая рабдомиосаркома (ВРМС); г—м — эпителиоидная рабдомиосаркома (ЭпРМС).
а, г, ж, к — окраска гематоксилином и эозином; б, д, з, л — экспрессия myf3; в, е, и, м — экспрессия myf4. а—м — ×400.
Рис. 3. Иммуногистохимическая картина экспрессии миогенина в ткани РМС.
ЭРМС с иммунореактивностью 1+ (а), 2+ (б) и 3+ (в); АРМС с иммунореактивностью 1+ (г), 2+ (д) и 3+ (е); ВРМС с иммунореактивностью 1+ (ж) и 2+ (з). а—з — ×600.
Рис. 4. Иммуногистохимическая картина экспрессии MyoD1 в ткани РМС.
ЭРМС с иммунореактивностью 1+ (а), 2+ (б) и 3+ (в); АРМС с иммунореактивностью 1+ (г), 2+ (д) и 3+ (е); ВРМС с иммунореактивностью 1+ (ж), 2+ (з) и 3+ (и). а—и — ×600.
Рис. 5. Иммуногистохимическая картина экспрессии ALK в ткани РМС.
а — клон D5F3, ×600; б — клон р80, ×400.
Рис. 6. Иммуногистохимическая картина экспрессии PAX5 в ткани АРМС, ×200.
Экспрессия Myogenin и MyoD1 выявлена во всех исследуемых образцах ткани РМС. Для АРМС более характерна интенсивность реакции 1+ и 2+, в то же время более 50% случаев ЭРМС, ВРМС и ЭпРМС характеризуются интенсивностью реакции на уровне 1+ (см. рис. 4 и 5).
Экспрессию ALK исследовали с применением клонов D5F3 и p80. Клон D5F3 показал более интенсивную реакцию по сравнению с клоном p80 (см. рис. 4). Помимо этого наибольшее количество случаев с позитивной реакцией также обнаружено при помощи клона D5F3: в 25 из 87 случаев ЭРМС, в 43 из 75 случаев АРМС, в 3 из 16 случаев ВРМС и во всех случаях ЭпРМС. При использовании клона p80 позитивная реакция отмечена в 4 из 87 случаев ЭРМС, в 7 из 75 случаев АРМС, во всех случаях ЭпРМС. В образцах ВРМС позитивной реакции с помощью клона p80 не выявлено. Разница чувствительности к экспрессии ALK в пользу клона D5F3 оказалась статистически значимой (p<0,05). Отмечена как диффузная, так и фокальная экспрессия ALK в ткани РМС, причем для АРМС и ЭРМС фокальный паттерн экспрессии встречался в 50% образцов или более с положительной реакцией (см. табл. 5). В ткани ВРМС фокальная экспрессия отмечена лишь в 1 случае, а в образцах ЭпРМС фокальный паттерн не обнаружен.
Экспрессия PAX5 выявлена в 13 из 75 случаев АРМС (см. рис. 6). В образцах ЭРМС, ВРМС и ЭпРМС экспрессия не отмечена.
Положительная реакция с анти-PCK определена в 12 из 87 случаев ЭРМС, в 20 из 75 случаев АРМС и в 2 из 14 образцов ВРМС. Статистически значимой разницы в экспрессии PCK между исследуемыми группами не обнаружено.
Экспрессия WT1 выявлена в 15 из 87 образцов ЭРМС, в 15 из 75 образцов АРМС и в 1 из 14 образцов ВРМС. Значимой разницы в экспрессии между группами также не было.
Позитивная реакция с антителами к Synaptophysin отмечена в 9 из 87 случаев ЭРМС и в 12 из 75 случаев АРМС. Разница в экспрессии между ЭРМС и АРМС не выявлена.
В 73% всех случаев РМС определена экспрессия SIX1: в 77 из 87 образцов ЭРМС, в 62 из 75 образцов АРМС, в 8 из 14 образов ВРМС и в 1 из 2 образцов ЭпРМС. Значимой разницы в экспрессии между вариантами РМС не обнаружено.
Экспрессия CAM5.2 выявлена лишь в 1 образце исследуемой выборки.
Обсуждение
Диагностика РМС как наиболее частой мягкотканной саркомы у детей требует тщательного дифференцированного подхода. В качестве чувствительных и специфичных маркеров РМС предложены миогенные транскрипторные регуляторные факторы, в частности Myogenin (myf4) и MyoD1 (myf3). В нашем исследовании все 202 образца имели позитивную ядерную экспрессию обоих маркеров. Причем для АРМС характерна более выраженная качественная и количественная положительная иммуногистохимическая реакция, что согласуется с опубликованными данными [18—20].
Экспрессия аберрантных маркеров наблюдалась в различном соотношении во всех случаях РМС. Это свидетельствует о том, что в определенных ситуациях, сопряженных с нетипичной гистологической картиной, вариантной локализацией и низким уровнем экспрессии миогенных транскрипторных факторов, может произойти диагностическая ошибка.
При этом корреляции между вариантом РМС и определенным аберрантным маркером не обнаружено. Показано, что исследование экспрессии ALK с помощью клона D5F3 позволяет лучше визуализировать и выявлять большее количество позитивных образцов (p<0,05).
Кроме того, для АРМС выявлена устойчивая закономерность между уровнем экспрессии ALK D5F3 и миогенных транскрипторных факторов. Во всех случаях АРМС с фокальной экспрессией ALK D5F3 наблюдался преимущественно низкий или умеренный уровень активности анти-Myogenin и анти-MyoD1.
Экспрессия маркера PAX5 при иммуногистохимическом исследовании обнаружена исключительно у пациентов с АРМС, что, вероятно, объясняется близостью расположения гена PAX5 и региона транслокационной нестабильности PAX3/7—FOXO1, приводящей к его активации [15, 21].
Экспрессия WT1 обнаружена в образцах АРМС, ЭРМС и ВРМС. В ряде публикаций такое обстоятельство рассматривается как фактор благоприятного прогноза [22, 23].
Любопытным оказался факт экспрессии маркера SIX1 в 80—95% всех случаев РМС. Транскрипторный фактор SIX1 положительно регулирует экспрессию PAX-3/7 на всех этапах развития мышечной клетки. Его значение в опухолевой ткани в настоящий момент неизвестно [24].
Несмотря на идентичность названия различных форм РМС, каждая из них нормативно, биологически, гистологически, фенотипически и клинически является самостоятельной нозологической формой. Морфологическая диагностика требует тщательной оценки всех перечисленных факторов, особенно принимая во внимание вариативность экспрессии миогенных транскрипторных факторов и высокий уровень аберрантности фенотипа.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Г.К. Ботиралиева, Д.М. Коновалов
Сбор и обработка материала — Г.К. Ботиралиева, В.Ю. Рощин, И.В. Сидоров
Статистическая обработка — А.С. Шарлай
Написание текста — А.С. Шарлай, Г.К. Ботиралиева, И.В. Сидоров
Редактирование — Д.М. Коновалов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.