Гистологическое строение неоинтимы привлекает внимание исследователей исходя из того, что ее гиперплазия является типичным ответом на повреждение структурных элементов кровеносной системы, что приводит к их гемодинамически значимому стенозированию [1—4]. В образовании неоинтимы принимают участие различные типы клеток, обычно это гладкомышечные клетки, фибробласты, миофибробласты и макрофаги [1, 4—6]. От пролиферативной и функциональной активности этих клеток во многом зависит позитивный или негативный сценарий ремоделирования сосудов [6, 7]. Более того, хирургические и малоинвазивные методы реваскуляризации сосудов часто сопровождаются развитием рестеноза. Поэтому гистологические методы оценки находят широкое применение и позволяют получить информацию о текущем состоянии сосудов и спрогнозировать сценарии развития процесса гиперплазии неоинтимы [8, 9].

Как правило, строение неоинтимы и развитие пролиферации в ответ на воздействие цитокинов, гипоксии, оксидативного стресса и других факторов исследуется на животных моделях с индуцированным хирургическим повреждением сосудов, в то время как ультраструктурных исследований клинического материала в отношении формирования неоинтимы выполнено недостаточно [10—13]. Кроме того, имеется очень мало данных о сравнительных исследованиях структуры неоинтимы у различных нативных и искусственных элементов системы кровообращения.

Разработанный нашей группой оригинальный вариант сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах (EM-BSEM) позволяет получать микрофотографии высокого разрешения, визуально сходные с таковыми при просвечивающей электронной микроскопии [14, 15].

Цель работы — выполнить сравнительную оценку строения неоинтимы нативных тканей (кондуиты для коронарного шунтирования, биопротезы клапанов сердца) и искусственно созданных тканеинженерных (сосудистые протезы) и металлических конструкций (стенты).

Материал и методы

Объектами исследования выступили: 1) участки внутренней грудной артерии человека, используемой в качестве кондуитов для коронарного шунтирования (от 30 больных); 2) экспериментальные сосудистые протезы из биодеградируемых полимеров поли(3-гидроксибутирата-ко-3-гидроксивалерата) и поли(ε-капролактона), имплантированные в сонную артерию овцы и извлеченные по завершении срока наблюдения (1,5 года); 3) ранее имплантированные в митральную позицию и эксплантированные по причине кальцификации (от 4 овец) или инфекционного эндокардита (n=5) створки ксеноперикардиальных биопротезов клапанов сердца («ЮниЛайн», ЗАО «НеоКор», Кемерово, Россия) от 8 больных; 4) металлические стенты с окружающими тканями, ранее имплантированные в выводной отдел правого желудочка детей, рожденных с низкой массой тела с целью обеспечения насыщения крови кислородом до последующей полной хирургической коррекции тетрады Фалло [16] (от 7 больных); 5) металлический стент, ранее имплантированный в сонную артерию человека по причине гемодинамически значимой хронической ишемии головного мозга и извлеченный вследствие рестеноза сонной артерии вместе с окружающими тканями при каротидной эндартерэктомии (1 больной).

Исследование было выполнено в соответствии со стандартами надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice), принципами Хельсинкской декларации (2013) и с соблюдением этических принципов Европейской конвенции по защите позвоночных животных. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний». До включения в работу от всех пациентов было получено письменное информированное согласие.

Образцы тканей сразу после их извлечения помещали в забуференный (pH 7,4) 10% водный раствор формалина («БиоВитрум», Россия). После фиксации в формалине в течение 1 сут (2 смены раствора формалина по 12 ч каждая) биоматериал постфиксировали 1% тетраоксидом осмия в 0,1M фосфатном буфере в течение 12 ч, затем окрашивали 2% тетраоксидом осмия в бидистиллированной воде в течение 48 ч. Далее образцы обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации (50, 60, 70, 80 и 95% этанол, все по две смены, каждая смена по 15 мин), окрашивали 2% уранилацетатом (Electron Microscopy Sciences, США) в 95% этаноле (5 ч), обезвоживали 99,7% изопропанолом («БиоВитрум», Россия) в течение 5 ч и ацетоном («Реахим», Россия) в течение 4 ч, пропитывали смесью ацетона с эпоксидной смолой Epon (Electron Microscopy Sciences, США) в соотношении 1:1 (6 ч), после чего переносили в свежую порцию эпоксидной смолы (на 24 ч) и далее проводили ее полимеризацию в емкостях FixiForm (Electron Microscopy Sciences, США) при 60°C. Полученные эпоксидные блоки подвергали шлифовке и полировке до достижения глубины расположения интересующего участка биологической ткани на установке TegraPol-11 (Struers, США). Эта процедура обеспечивала полную структурную сохранность образца, включая участки с кальциевыми включениями и металлическими стентами. Контрастирование цитратом свинца проводили по Рейнольдсу в течение 7 мин путем нанесения раствора на поверхность шлифованного образца с последующей его отмывкой бидистиллированной водой. Далее проводили напыление на полированную поверхность эпоксидных блоков углерода (толщина покрытия 10—15 нм) с помощью вакуумного напылительного поста (EM ACE200, Leica). Визуализацию структуры образцов при помощи сканирующей электронной микроскопии в обратно-рассеянных электронах проводили на электронном микроскопе Hitachi-S-3400N (Hitachi, Япония) в режиме BSECOMP при ускоряющем напряжении 10 или 15 кВ. При исследованиях в структуре неоинтимы идентифицировали элементы внеклеточного матрикса и определяли клеточный состав.

Результаты

Во всех исследованных образцах наблюдали появление слоев неоинтимы на контактирующих с кровью поверхностях. В сосудистых протезах (рис. 1, а) неоинтима образовывала сплошной равномерный слой с различной электронной плотностью по всей окружности. В стентированном выводном отделе правого желудочка ребенка с тетрадой Фалло (рис. 1, б) слой неоинтимы находился на остатках слоя адвентиции, сохранившегося после установки стента. Неоинтима имела неравномерную толщину за счет разрастания адвентиции и выступов в районе установки стента. Вблизи адвентиции в составе неоинтимы находились отдельные капилляры. При рестенозе сонной артерии в участках с сохранившимся сосудистым просветом (рис. 1, в) неоинтима также образовывала сплошной слой по всему периметру сосуда. Неоинтима имела неравномерную электронную плотность: вблизи оставшегося слоя адвентиции имелся слой светлой ткани, содержащей многочисленные сосуды; со стороны просвета сосуда неоинтима представляла собой слой высокой электронной плотности (см. рис. 1, в). В различных вариантах внутренней грудной артерии неоинтима была представлена по-разному. В сосуде с подозрением на наличие инфекции неоинтима покрывала толстым слоем всю внутреннюю поверхность (рис. 1, г), однако в большинстве случае в структуре сосуда наблюдали присутствие лишь отдельных участков, покрытых неоинтимой (рис. 1, д, е). В кальцинированном биопротезе митрального клапана отложения кальция, контактирующие с потоком крови, были покрыты тонким плотным слоем неоинтимы (рис. 1, ж). В нативном митральном клапане с инфекционным эндокардитом слой неоинтимы был рыхлым, имел низкую электронную плотность и мог содержать капилляроподобные структуры (рис. 1, з).

Рис. 1. Общий вид исследуемых элементов системы кровообращения.

а — биодеградируемый сосудистый протез, имплантированный в сонную артерию овцы; б — металлический стент, имплантированный в легочную артерию ребенка с тетрадой Фалло; в — металлический стент, имплантированный в сонную артерию человека по причине ее рестеноза; г—е — различные варианты эксплантированной при проведении коронарного шунтирования внутренней грудной артерии; ж — кальцинированный биопротез митрального клапана сердца «ЮниЛайн»; з — инфекционный эндокардит митрального клапана. Белые стрелки — неоинтима, черные стрелки — структуры стента.

При прицельном рассмотрении при большем увеличении (рис. 2, а—г) все варианты неоинтимы независимо от элементов системы кровообращения (нативные или протезные) имели структурное сходство и содержали слой эндотелия, гладкомышечные клетки и соединительнотканные волокна. Эндотелиальный слой имел большое разнообразие как между различными элементами системы кровообращения, так и в пределах одной анатомической структуры (см. рис. 2). Эти отличия проявлялись в форме клеток, структуре их ядер и гистоархитектоники субэндотелиального слоя. Клетки могли иметь типичную для эндотелиальных клеток уплощенную (см. рис. 2, а—в) или округлую форму (см. рис. 2, г). При отсутствии воспаления в поверхностном слое расположение гладкомышечных клеток и волокон было параллельно эндотелию. Кроме гладкомышечных клеток в этом слое присутствовало большое количество клеток фибробластического ряда. Типирование клеток выполняли на основании морфологических критериев. Гладкомышечные клетки определяли по более светлым ядрам, обычно имеющим веретеновидную форму и тонкий слой эухроматина по периферии, светлой вытянутой цитоплазме, наличию электронно-плотного слоя на границе плазматической мембраны. Клетки фибробластического ряда дифференцировали по более темным ядрам с большим количеством эухроматина в центре и по периферии, меньшему поперечному сечению ядра у фиброцитов, дополнительным критерием служило наличие вблизи клеток коллагеновых волокон.

Рис. 2. Структурное сходство неоинтимы в нативных и протезных элементах системы кровообращения.

а — кальцинированный биопротез митрального клапана сердца «ЮниЛайн»; б — биодеградируемый сосудистый протез, имплантированный в сонную артерию овцы; в — эксплантированная при проведении коронарного шунтирования внутренняя грудная артерия; г — металлический стент, имплантированный в легочную артерию ребенка с тетрадой Фалло.

Структура субэндотелиального слоя была различной не только в разных полях зрения, но и элементах системы кровообращения. В ряде образцов эндотелий непосредственно прилегал к гладкомышечным клеткам (рис. 3, а), часто встречались участки, в которых эндотелий примыкал к фибробластоподобным клеткам, имеющим сильно уплощенную форму и вытянутое ядро с электронно-плотным содержимым (рис. 3, б). Иногда между эндотелием и гладкомышечными клетками находилась электронно-плотная базальная мембрана (рис. 3, в). Кроме того, эндотелий мог располагаться поверх слоя, состоящего из различных видов клеток (рис. 3, г, д). В таком варианте под эндотелием отсутствовал слой уплощенных клеток или упорядоченных волокон. Редко встречались участки с некротизированными эндотелиоцитами, находящимися на поверхности фибриноподобных волокон (рис. 3, е).

Рис. 3. Строение эндотелия и субэндотелиального слоя в структуре неоинтимы тканеинженерного сосудистого протеза малого диаметра.

а — уплощенный эндотелий на поверхности гладкомышечных клеток; б — эндотелий на поверхности фибробластоподобных клеток; в — эндотелий на поверхности мембраноподобного слоя, лежащего поверх гладкомышечных клеток; г, д — эндотелий, расположенный поверх других типов клеток; е — некротизированный эндотелиоцит на поверхности из фибриноподобных волокон.

Большая часть поверхности неоинтимы, контактирующей с кровью, была покрыта только эндотелиальными клетками. Однако встречались участки, на поверхности которых наблюдали адгезию лейкоцитов (рис. 4). Среди этих клеток преимущественно встречались моноциты и нейтрофилы (см. рис. 4, а, б). Поскольку данные клеточные популяции также присутствуют в неоинтиме (см. рис. 4, в, г), можно предположить функциональную активность адгезирующихся клеток и их миграцию вглубь неоинтимы.

Рис. 4. Адгезия и миграция лейкоцитов в структуру неоинтимы.

а — адгезия лейкоцитов, стент в рестенозированной сонной артерии человека; б — адгезия лейкоцитов на поверхность эндотелия, кальцинированный биопротез митрального клапана сердца; в, г — миграция моноцитов и нейтрофилов, сосудистый графт малого диаметра в сонной артерии овцы.

В составе неоинтимы вблизи твердых включений, таких как очаги кальцификации или балки металлического стента, часто присутствовали макрофаги и нейтрофильные лейкоциты (рис. 5, а, б). Вблизи места контакта кальцификатов или балок стентов часто наблюдали скопления пенистых клеток (рис. 5, в, г).

Рис. 5. Лейкоциты и пенистые клетки на границе с твердыми включениями в неоинтиму.

а, б — макрофаги и нейтрофилы вблизи границы неоинтимы с кальциевыми депозитами, биопротез митрального клапана сердца; в — пенистые клетки и макрофаги вблизи кальцификата в составе неоинтимы сосудистого протеза; г — макрофаги и пенистые клетки вблизи балки стента сонной артерии (стрелка — граница со стойкой стента).

При гиперплазии неоинтимы в ее составе встречаются капилляроподбные структуры и полностью структурированные капилляры.

При значительном расширении слоя медии на границе между медией и неоинтимой встречались капилляроподобные структуры и настоящие капилляры (рис. 6). Так, в стенке внутренней грудной артерии отмечались участки с капилляроподобными структурами, представляющими собой пространства вытянутой или неправильной формы, окруженные эндотелиоподобными клетками (см. рис. 6, а—в). В некоторых образцах внутри этих структур присутствовали эритроциты (см. рис. 6, б, в). У части таких структур отмечался контакт с просветом сосуда (см. рис. 6, б).

Рис. 6. Капилляроподобные структуры и капилляры в структуре гипертрофированной неоинтимы.

а—в — капилляроподобные структуры в гипертрофированной неоинтиме артерии с подозрением на инфицирование; г — капилляры в структуре неоинтимы стентированного выводного отдела легочной артерии; д — капилляр на границе неоинтимы и биодеградированного участка сосудистого протеза.

В неоинтиме образцов легочной артерии со стентами и неоинтиме сосудистых протезов вблизи границы с ними регистрировались хорошо структурированные капилляры (см. рис. 6, г, д). Наибольшее количество таких капилляров наблюдалось в неоинтиме, находящейся в составе стентированных артерий (см. рис. 6, г).

Обсуждение

Образование неоинтимы — это характерная реакция различных элементов сердечно-сосудистой системы, находящихся в прямом контакте с кровью, на различные виды повреждения; кроме того, недостаточная гемосовместимость протезов элементов системы кровообращения также неминуемо приводит к формированию неоинтимы на их поверхности. Вероятно, процесс формирования неоинтимы у разных объектов может различаться на начальных этапах. Если в случае стентированных артерий можно ожидать участие в этом процессе адвентиции, повреждение которой вызывает выброс воспалительных цитокинов и миграцию сосудистых гладкомышечных клеток [4], то для клапанных протезов и тканеинженерных сосудистых протезов такой сценарий представляется маловероятным. Тем не менее в сосудистых протезах вклад адвентиции в образование неоинтимы возможен вблизи места контакта протезов с нативными сосудами. Наиболее вероятно, что в образовании неоинтимы в структуре биопротезов клапанов сердца и центральной части сосудистых протезов участвует фибрин, на поверхности которого формируется эндотелий и происходит миграция камбиальных клеток и лейкоцитов из кровотока [2]. В образовании неоинтимы артерий, вероятно, принимают участие фибриновые микротромбы и клетки интимы. На начальных этапах этого процесса фибрин играет роль внеклеточного матрикса [17]. В дальнейшем синтез внеклеточного матрикса происходит за счет участия гладкомышечных клеток синтетического фенотипа.

В составе неоинтимы наибольшим морфологическим разнообразием обладали эндотелиоциты и клетки субэндотелиального слоя. Клетки эндотелия различались по форме, электронной плотности цитоплазмы и ядра, субэндотелиальный слой — по клеточному составу и форме клеток. Субэндотелиальный слой обычно был образован гладкомышечными клетками и фиброцитами, однако в некоторых участках присутствовали клетки моноцитарного ряда. Вероятно, такой полиморфизм имеет адаптивный характер и обусловлен гидродинамическими различиями потока крови в конкретном участке кровотока.

Привлекает внимание то, что в отдельных участках неоинтимы наблюдается адгезия лейкоцитов на поверхности эндотелия. Трансмиграция этих клеток вглубь неоинтимы указывает на вероятность присутствия в этих участках воспалительных цитокинов.

Наличие пенистых клеток в неоинтиме вблизи твердых структур, вероятно, обусловлено низкой эластичностью этих включений. Поэтому пульсирующая механическая нагрузка в месте контакта с клетками неоинтимы приводит к механическому разрушению клеток с высвобождением факторов воспаления и привлечением моноцитов с последующей трансформацией в пенистые клетки.

В целом неоинтима во всех образцах имела структурное сходство и состояла из параллельных слоев гладкомышечных клеток и ВКМ, покрытых со стороны просвета сосуда эндотелием. При этом сформировавшаяся неоинтима не является статичным образованием и находится в постоянном процессе ремоделирования. Отмечено изменение клеточного состава, появление макрофагов, в том числе пенистых клеток, а также капилляров и кальциевых депозитов. Представляет интерес образование капилляроподобных структур в составе расширенных фиброзных отложений на стенке внутренней грудной артерии. Одним из объяснений такого явления может быть то, что отложение фибрина происходит слоями. Возможен вариант, при котором слой фибрина откладывается на неоинтиму, уже покрытую эндотелием. Если прилегание слоя фибрина неплотное и имеет полости на границе между уже эндотелизированным фибрином и свежим слоем, есть вероятность, что произойдет разрастание эндотелия из более глубокого слоя на вновь отложенные слои фибрина. Результатом этого процесса являются капилляроподобные структуры.

Заключение

Полученные данные показали, что различные виды элементов системы кровообращения при разных вариантах сердечно-сосудистого ремоделирования характеризовались формированием неоинтимы, ультраструктура которой имела однотипный характер и была представлена эндотелием, гладкомышечными клетками, фибробластами и внеклеточным матриксом. Наблюдавшиеся различия ультраструктуры, вероятно, обусловлены особенностями распределения гидродинамических нагрузок в пульсирующем кровотоке внутри изученных элементов системы кровообращения, а также миграцией и участием иммунокомпетентных клеток в процессе ремоделирования.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Р.А. Мухамадияров, А.Г. Кутихин;

Сбор и обработка материала — В.А. Кошелев, А.В. Фролов, А.В. Миронов, А.Р. Шабаев, А.В. Евтушенко, А.А. Ляпин;

Написание текста — Р.А. Мухамадияров, А.Г. Кутихин;

Редактирование — А.Г. Кутихин, А.В. Евтушенко

Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ №0546-2019-0002 «Патогенетическое обоснование разработки имплантатов для сердечно-сосудистой хирургии на основе биосовместимых материалов, с реализацией пациент-ориентированного подхода с использованием математического моделирования, тканевой инженерии и геномных предикторов».