Саркома Юинга (СЮ) является агрессивной опухолью костей и мягких тканей, которая характеризуется перестройкой генов EWSR1/FUS с партнерами из семейства ETS [1]. СЮ встречается в любом возрасте с пиком заболеваемости в детском возрасте, чаще всего поражаются кости, мягкие ткани, органные локализации редки. В подавляющем большинстве случаев морфология СЮ характеризуется солидным типом роста с формированием полей, состоящих из мономорфных округлых клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением и отсутствием или минимальным плеоморфизмом. Диагностически важной комбинацией антител являются экспрессия CD99 (в «типичном» строго мембранном локусе) с диффузной ядерной коэкспрессией NKX2.2 (рис. 1). Для лечения СЮ у детей используется специальный протокол EURO-EWING 2012, отличный от протоколов лечения остеосаркомы и других опухолей мягких тканей, с хорошим ответом на терапию [2].
Рис. 1. Микроскопическая и иммуногистохимическая картина саркомы Юинга.
а — опухоль состоит из мономорфных округлых клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением; б — диффузная мембранная экспрессия CD99; в —диффузная ядерная экспрессия NKX2.2.
а — окраска гематоксилином и эозином, б, в — иммуногистохимическая реакция. ×400.
В 2020 г. в Классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) опухолей мягких тканей и костей выделена группа недифференцированных круглоклеточных сарком, включающая СЮ, круглоклеточную саркому с перестройкой генов EWSR1/FUS с партнерами не из семейства генов ETS (EWSR1-non ETS), CIC-перестроенную саркому, саркому с альтерациями гена BCOR [1].
Для диагностики саркомы с перестройкой гена BCOR с морфологической точки зрения наиболее достоверным является сочетание гетерогенного круглоклеточно-веретеноклеточного строения опухоли с коэкспрессией антител BCOR, SATB2, TLE1 (рис. 2), для CIC-перестроенной саркомы — эпителиоидно-клеточное строение с коэкспрессией WT1, ETV4 (рис. 3) [3, 4].
Рис. 2. Микроскопическая и иммуногистохимическая картина саркомы с альтерациями гена BCOR.
а — ярко выраженное гетерогенное строение опухоли: опухоль состоит из коротких пучков веретеновидных клеток (верхняя часть микрофотографии) и солидного скопления клеток округлой формы (нижняя часть микрофотографии); б — ядерная экспрессия BCOR; в — ядерная экспрессия SATB2; г — ядерная экспрессия TLE1.
а — окраска гематоксилином и эозином, ×200; б—д — иммуногистохимическая реакция, ×400.
Рис. 3. Микроскопическая и иммуногистохимическая картина CIC-перестроенной саркомы.
а — опухоль состоит из солидных полей крупных эпителиоидных клеток; б — ядерная экспрессия WT1; в — ядерная экспрессия ETV4.
а — окраска гематоксилином и эозином, б, в — иммуногистохимическая реакция. ×400.
Диагностика и дифференциальная диагностика недифференцированных круглоклеточных сарком на основании рекомендаций ВОЗ в нашем центре, который специализируется на лечении этих заболеваний, выявили обстоятельство, заключающееся в том, что в ряде случаев «вероятная» СЮ может иметь некоторые перекрестные варианты морфологической картины и иммунофенотипа с саркомой с альтерациями гена BCOR и CIC-перестроенной саркомой, может аберрантно экспрессировать SATB2, TLE1, однако частота комбинированной экспрессии этих антител, частота экспрессии BCOR в СЮ еще недостаточно изучены, как и частота экспрессии WT1 и ETV4.
Мы провели исследование на большой когорте пациентов с верифицированной СЮ со сравнением морфологической картины и иммунофенотипа с другими недифференцированными круглоклеточными саркомами (саркома с альтерациями гена BCOR, CIC-перестроенная саркома).
Материал и методы
За период 2013—2022 гг. на базе патолого-анатомического отделения НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева разными методами (флюоресцентная гибридизация in situ (FISH), ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), РНК-секвенирование) было выявлено 118 генетически верифицированных случаев СЮ (n=100), саркомы с альтерациями гена BCOR (n=10), CIC-перестроенной саркомы (n=8) с исключением повторяющихся случаев, а также случаев с плохим качеством материала, предварительно проведенным лечением и отсутствием генетической верификации (выявление аберрации соответствующего гена). Материал был получен путем биопсии костей, мягких тканей и внутренних органов (1 случай с локализацией в почке) от пациентов от 0,5 до 22 лет. Исследование проводили на наиболее информативных парафиновых блоках с построением тканевых матриц (tissue microarray − TMA), представляющих собой парафиновые блоки-реципиенты, содержащие тканевые цилиндры, извлеченные из стандартных парафиновых блоков. Изготовление тканевых матриц выполняли с использованием автоматизированной системы EverBio AutoTiss10c («Ever BioTechnology Inc.», Тайвань) и программного обеспечения AutoTiss Designer. Диаметр используемого панчера (core) 1 мм.
Таким образом, было получено 9 блоков, содержащих материал от 8 до 26 пациентов. На каждый блок был использован одинаковый набор антител (табл. 1), разработанный с учетом данных литературы о СЮ и других недифференцированных круглоклеточных саркомах. Полученные результаты заносились в базу данных с указанием диагноза, локализации, пола, возраста пациента, особенности морфологической картины и иммунофенотипа. Статистический анализ проводили с помощью программы Jamovi (version 2.3.19). Для достижения достоверности результатов при каждом виде исследований (гистологическое исследование, иммуногистохимическое, ОТ-ПЦР, РНК-секвенирование и FISH) строго придерживались соответствующих протоколов и рекомендаций.
Таблица 1. Антитела, используемые в исследовании
| Антитело | Производитель, клон |
| CD99 | Cell Marque, EPR30974 |
| NKX2.2 | BioSB, EP336 |
| BCOR | Cell Marque, C-10 |
| SATB2 | Santa Cruz, SATBA4B10 |
| TLE1 | Cell Marque, 1F5 |
| WT1 | Cell Marque, 6F-H2 |
| ETV4 | Invitrogen, 1A2G3 |
Результаты
Характеристика когорты СЮ
СЮ встречалась чаще у лиц мужского пола (n=54), пациентов женского пола было несколько меньше (n=46). Возраст пациентов варьировал от 6 мес до 22 лет (медиана 11 лет). Более подробно данные о половозрастной структуре пациентов представлены в табл. 2, 3. В подавляющем большинстве случаев СЮ локализуется в костях (n=69, рис. 4), далее следуют мягкие ткани (n=30, рис. 5) и в 1 наблюдении опухоль была выявлена во внутренних органах (почка).
Таблица 2. Доля пациентов мужского и женского полов среди лиц с диагнозом саркомы Юинга, саркомы с альтерациями гена BCOR и CIC-перестроенной саркомы
| Показатель | Саркома Юинга | Саркома с альтерациями гена BCOR | Саркома с перестройками гена CIC |
| Пол: | |||
| мужской | 54 (54%) | 9 (90%) | 3 (37,5%) |
| женский | 46 (46%) | 1 (10%) | 5 (62,5%) |
Таблица 3. Распределение пациентов с диагнозом саркомы Юинга, саркомы с альтерациями гена BCOR и CIC-перестроенной саркомы по возрастным группам
| Возраст, годы | Саркома Юинга | Саркома с альтерациями гена BCOR | CIC-перестроенная саркома |
| Младше 1 | 1 (1%) | 1 (11,1%) | 0 |
| 1—3 | 5 (5%) | 0 | 0 |
| 3—7 | 9 (9%) | 2 (22,2%) | 0 |
| 7—11 | 25 (25%) | 1 (11,1%) | 2 (25%) |
| 11—18 | 59 (59%) | 5 (55,6%) | 6 (75%) |
| Старше18 | 1 (1%) | 0 | 0 |
Рис. 4. Частота поражения костей при саркоме Юинга.
Рис. 5. Частота поражения мягких тканей при саркоме Юинга.
Классическая морфологическая картина СЮ с мономорфным солидным круглоклеточным инфильтратом, по данным нашего исследования, встречалась в подавляющем большинстве случаев (n=91), в небольшом количестве случаев отмечалась так называемая атипичная морфология: в 7 — с эпителиоидно-клеточной морфологической картиной и 3 — с гетерогенным круглоклеточно-веретеноклеточным строением.
Характеристика когорты недифференцированных круглоклеточных сарком (саркомы с альтерациями гена BCOR, CIC-перестроенной саркомы)
Когорта других недифференцированных круглоклеточных сарком включала 10 случаев саркомы с альтерациями гена BCOR и 8 — CIC-перестроенной саркомы.
Саркома с альтерациями гена BCOR была диагностирована у 9 лиц мужского пола и 1 — женского в возрасте от 6 мес до 16 лет (медиана 13,5 года). Саркомы с альтерациями гена BCOR преимущественно характеризовались круглоклеточно-веретеноклеточным строением (7 случаев), 3 случая имели круглоклеточное строение. В подавляющем большинстве случаев (n=7) саркомы с альтерациями гена BCOR располагались в мягких тканях (рис. 6), в 3 — в костях (кости таза, кости голени и кости стопы соответственно).
Рис. 6. Частота поражения мягких тканей при саркоме с альтерациями гена BCOR.
Все 8 случаев CIC-перестроенной саркомы были выявлены в мягких тканях у 5 пациентов женского пола и 3 — мужского в возрасте от 9 до 16 лет (медиана 13,5 года). Данные о половозрастной структуре представлены в табл. 2, 3. Данные о локализации опухоли представлены на рис. 7. В 3 случаях саркомы морфологически имели круглоклеточное строение, в 2 — эпителиоидно-клеточное, в 1 — веретеноклеточное, в 1 — гибридное круглоклеточное и веретеноклеточное, в 1 — гибридное круглоклеточное и эпителиоидно-клеточное.
Рис. 7. Частота поражения мягких тканей при CIC-перестроенной саркоме.
Сравнение результатов иммуногистохимического исследования СЮ, саркомы с альтерациями гена BCOR, CIC-перестроенной саркомы
Характерная мембранная экспрессия CD99 наблюдалась в 100% СЮ, 50% сарком с альтерациями гена BCOR, 62,5% CIC-перестроенной саркомы.
Была исследована изолированная экспрессия NKX2.2 во всех трех опухолях. Позитивная реакция выявлена в 94% СЮ (диффузная яркая ядерная экспрессия), 40% сарком с альтерациями гена BCOR, 60% сарком с перестройкой гена CIC. Показана статистически значимая разница в экспрессии NKX2.2 между СЮ и двумя другими опухолями (p≤0,001, точный тест Фишера).
Коэкспрессия CD99/NKX2.2 в группе недифференцированных круглоклеточных сарком выявлена не была, зато наблюдалась в 94% СЮ (6% СЮ экспрессировали CD99 изолированно, без NKX2.2). Таким образом, показана статистически значимая разница экспрессии CD99, коэкспрессии CD99/NKX2.2 между СЮ и каждой опухолью из группы недифференцированных круглоклеточных сарком (p≤0,001, точный тест Фишера).
Экспрессия BCOR была выявлена в 7% СЮ, 90% сарком с альтерациями гена BCOR и не установлена в CIC-перестроенной саркоме. Показана статистически значимая разница в экспрессии BCOR между саркомой с альтерациями гена BCOR, СЮ, CIC-перестроенной саркомой (p≤0,001, точный тест Фишера).
Коэкспрессия BCOR, TLE1 и SATB2 выявлена в 80% сарком с альтерациями гена BCOR. В СЮ и саркомах с перестройками гена CIC коэкспрессии этих трех маркеров не обнаружено. Различия в наличии коэкспрессии BCOR, TLE1 и SATB2 между саркомами с альтерациями гена BCOR и СЮ и саркомами с перестройками гена CIC были статистически значимыми (p≤0,001, точный тест Фишера).
Экспрессия WT1 выявлена в 2% СЮ, 10% сарком с альтерациями гена BCOR, 25% сарком с перестройками гена CIC. Статистически значимой разницы между тремя опухолями по экспрессии WT1 выявлено не было (p=0,110, точный тест Фишера).
Экспрессия ETV4 обнаружена в 2% СЮ и 25% сарком с перестройками гена CIC. В саркомах с альтерациями гена BCOR экспрессия ETV4 обнаружена не была. Таким образом, статистически значимой разницы между тремя опухолями показано не было (p=0,110, точный тест Фишера).
Коэкспрессия ETV4 и WT1 была показана только в саркомах с перестройками гена CIC (25% случаев). Показана статистически значимая разница коэкспрессии WT1/ETV4 в CIC-перестроенной саркоме и двух других исследуемых опухолях (p=0,004, точный тест Фишера).
Обсуждение
Наибольшая заболеваемость СЮ наблюдается в возрасте 11—18 лет, с незначительным преобладанием пациентов мужского пола. Выявлено значительное преобладание лиц мужского пола среди пациентов с саркомой и альтерациями гена BCOR. Вероятно, объяснением может служить то, что наиболее распространенной генетической перестройкой среди опухолей с альтерацией гена BCOR, встречающейся в 60% случаев, является образование химерного гена BCOR::CCNB3 вследствие парацентрической инверсии в X-хромосоме [5]. В случае саркомы с перестройками гена CIC возраст пациентов был меньше медианы, указанной в литературе [6], что может объясняться селекцией материала в соответствии с профилем клиники (тем не менее пациенты с саркомой и перестройками гена CIC были несколько старше пациентов из двух других групп) (см. табл. 3). Согласно данным литературы, саркома с перестройками гена CIC также чаще встречается у пациентов мужского пола, преобладание пациентов женского пола в рамках данного исследования можно объяснить малым размером выборки [6—8].
Получены данные о преимущественной костной локализации СЮ и частом вовлечении длинных костей нижних конечностей, костей таза и ребер. Заслуживает внимания наблюдение о достаточно частом расположении СЮ в костях черепа в рассматриваемой выборке. Хотя данная опухоль может поражать любые кости, локализация в области головы не считается классической. При этом дифференциально-диагностический ряд для круглоклеточных новообразований головы и шеи обычно включает другие нозологии (ольфакторная нейробластома, недифференцированная синоназальная карцинома, миоэпителиальная карцинома), что может приводить к диагностическим ошибкам. В данном контексте важно учитывать также данные о том, что СЮ, располагающиеся в области головы и шеи, могут экспрессировать маркеры эпителиальной дифференцировки [9].
Другое значимое наблюдение — частая локализация сарком с альтерациями гена BCOR в забрюшинном пространстве. Такая локализация создает затруднения в дифференциальной диагностике данной опухоли со светлоклеточной саркомой почки. Данные опухоли имеют общие генетические аномалии (BCOR-ITD, химерный ген YWHAE::NUTM2), однако для их лечения используются различные протоколы [10]. Также дифференциальный диагноз при этой локализации может включать недифференцированную нейробластому, СЮ, десмопластическую мелкокруглоклеточную опухоль.
В рамках данной работы показано, что >90% СЮ имеют типичное круглоклеточное строение. Морфологическая картина недифференцированных круглоклеточных сарком в нашей выборке, за исключением СЮ, демонстрирует высокую гетерогенность, так как клетки могут быть веретеновидными и эпителиоидными в различных комбинациях. Однако среди сарком с альтерациями гена BCOR и сарком с перестройками гена CIC были обнаружены также случаи мономорфной круглоклеточной морфологии, которая считается характерной для СЮ, что подчеркивает актуальность вопроса о дифференциальном диагнозе между этими опухолями.
Чувствительность CD99 для СЮ в настоящей работе составила 100%, однако высокие уровни экспрессии данного маркера в мембранном локусе также были отмечены в саркоме с альтерациями гена BCOR и саркоме с перестройками гена CIC, что свидетельствует о низкой специфичности CD99 для СЮ. Несмотря на то что NKX2.2 считается высокоспецифичным маркером для СЮ [11], его экспрессия также была обнаружена в сравнительно большой доле сарком с альтерациями гена BCOR и сарком с перестройками гена CIC, в связи с чем нельзя рекомендовать изолированное исследование экспрессии данного маркера в диагностике СЮ. Коэкспрессия CD99 и NKX2.2 является высокочувствительной для СЮ и может считаться более специфичной по сравнению с экспрессией NKX2.2 [12, 13].
Наиболее высокая специфичность в отношении саркомы с альтерациями гена BCOR была продемонстрирована для комбинации маркеров BCOR, SATB2 и TLE1, которая не встречалась в СЮ и CIC-перестроенной саркоме.
Коэкспрессия ETV4 и WT1 была продемонстрирована только в саркомах с перестройками гена CIC, что позволяет говорить о специфичности данной комбинации. Однако, несмотря на то что, по данным литературы [14], оба этих маркера считаются высокочувствительными (чувствительность >90%), в рамках данной работы их коэкспрессия была продемонстрирована только в 25% случаев генетически подтвержденных CIC-перестроенных сарком.
Алгоритм диагностики недифференцированных круглоклеточных сарком
Общее правило диагностики опухолей костей и мягких тканей заключается в комплексной оценке клинических данных, цитологических свойств клеток, характера стромы, ее объема, паттерна организации сосудов, наличия или отсутствия реактивного воспалительного инфильтрата, его характера, отношения опухоли к окружающим тканям и др. Подход, который применим к группе недифференцированных круглоклеточных сарком, вступает в противоречие с общим правилом. Диагностика строится почти исключительно на определении формы и размера клеток, оценке гетерогенности опухолевой ткани.
Описываемый алгоритм (рис. 8) в части случаев может быть применен только при условии исключения других опухолей со схожим строением не из группы недифференцированных круглоклеточных сарком.
Рис. 8. Алгоритм диагностики недифференцированных круглоклеточных сарком.
Круглоклеточная опухоль кости со скудной стромой в первую очередь требует исключения СЮ, используя CD99, NKX2.2. При наличии характерной диффузной мембранной экспрессии обязательно в сочетании с диффузной яркой ядерной экспрессией NKX2.2 диагноз СЮ не вызывает сомнения.
Негативная реакция с CD99, NKX2.2, вариабельная экспрессия CD99, фокальная и/или слабая реакция с NKX2.2 в большей степени исключают СЮ. Следующим этапом является исключение саркомы с альтерациями гена BCOR и определением TLE1, SATB2, BCOR и CIC-перестроенной саркомы с использованием WT1 и ETV4. При «выпадении» хотя бы одного маркера из ряда TLE1, SATB2, BCOR или полностью негативных реакциях диагноз саркомы с альтерациями гена BCOR ставится под сомнение. Коэкспрессия WT1, ETV4 помогает заподозрить CIC-перестроенную саркому, однако экспрессия по отдельности данных антител не должна интерпретироваться в пользу какого-либо диагноза. При негативных или перекрестных реакциях вне диагностически значимых сочетаний антител патологические изменения стоит интерпретировать как недифференцированную круглоклеточную саркому и рекомендовать молекулярно-генетическое исследование.
В случае гетерогенной круглоклеточной и веретеноклеточной морфологии опухоли на первый план выступает саркома с альтерациями гена BCOR, однако не стоит забывать о довольно маленьком проценте СЮ с атипичной морфологией. Далее в более редких случаях следует исключить CIC-перестроенную саркому. Если попытки оказались неудачными, может быть рекомендовано исключение EWSR1::NFATC2 (NKX3.1, PanCK, AGGRECAN) и EWSR1::PATZ1 (desmin, myogenin, myoD1, S100) круглоклеточных сарком без учета специальных морфологических признаков, описанных в классификации ВОЗ для каждой опухоли, так как в литературе суммарно описано менее двух десятков случаев и в перспективе можно добавить новые морфологические варианты.
Крупноклеточная/эпителиоидно-клеточная опухоль в контексте недифференцированных круглоклеточных сарком диктует необходимость исключения CIC-перестроенной саркомы, затем атипичной формы СЮ; саркома с альтерациями гена BCOR исключается на уровне морфологического исследования.
Заключение
Показано, что для СЮ характерно поражение костей скелета (преимущественно длинных костей конечностей и костей туловища, однако отмечается также значительная доля поражения костей черепа), при этом вовлечение мягких тканей также не является редким, кроме того, возможно развитие первичной опухоли во внутренних органах. Для сарком с альтерациями гена BCOR была продемонстрирована преимущественно мягкотканная локализация, а для сарком с перестройками гена CIC — исключительно мягкотканная локализация.
СЮ в подавляющем большинстве случаев демонстрирует мономорфную круглоклеточную морфологию, однако возможны также «атипичные» варианты — эпителиоидный, веретено-круглоклеточный. Саркомы с альтерациями гена BCOR и саркомы с перестройками гена CIC являются более гетерогенными (возможны круглоклеточный, веретеноклеточный, эпителиоидный и смешанные варианты строения).
Наиболее специфичной для диагностики СЮ является комбинация маркеров CD99 и NKX2.2. Для саркомы с альтерациями гена BCOR наибольшую специфичность демонстрирует комбинация маркеров BCOR, SATB2 и TLE1. Для саркомы с перестройками гена CIC наибольшая специфичность была продемонстрирована для комбинации маркеров ETV4 и WT1, однако чувствительность в данном случае является невысокой.
В данной работе была показана мало обсуждаемая на сегодняшний день проблема «перекрестного» иммунофенотипа СЮ и «юингоподобных» сарком. Не только отдельные ИГХ-маркеры, но и их комбинации, считающиеся более специфичными, могут обнаруживаться в опухолях, для которых считаются нехарактерными. В связи с этим для дифференциальной диагностики следует учитывать не только клиническую и морфологическую картину опухоли, но и данные ИГХ-исследования, а для повышения точности диагностики необходима верификация с использованием молекулярно-генетических методов.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — И.В. Сидоров, А.С. Федорова, Д.М. Коновалов
Сбор и обработка материала — И.В. Сидоров, А.С. Федорова
Статистическая обработка — И.В. Сидоров, А.С. Федорова
Написание текста — И.В. Сидоров, А.С. Федорова, А.С. Шарлай
Редактирование — Д.М. Коновалов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.