В первые 2 года жизни тимус является главным органом иммунопоэза, основная функция которого — формирование T-лимфоцитов. Гормоны тимуса в этом возрасте выполняют важнейшие регуляторные функции, контролируя силу и форму любого специфического иммунного ответа [1, 2]. Именно поэтому состояние тимуса в этом возрасте можно рассматривать как отражение состояния всей иммунной системы. Однако морфологические характеристики тимуса в целом, а также отдельных его структурных элементов как в норме, так и при увеличении его массы в литературе освещены недостаточно.
В работе [3] опубликованы данные о том, что тельца Гассаля (ТГ) играют важную роль в процессах созревания дендритных клеток, обеспечивая презентацию им антигенов. Имеются сведения, что ТГ и клетки их микроокружения оказывают значительную роль на процессы негативной селекции тимоцитов [4]. ТГ принимают участие в элиминации аутореактивных T-лимфоцитов, поэтому правильное функционирование телец необходимо в том числе для предотвращения развития аутоиммунных заболеваний [2].
Ряд авторов [4—9] отмечают, что пик активности ТГ приходится на стадию зрелых телец. Однако ни в одном из доступных источников не удалось найти сведений о морфологии ТГ в условиях увеличения тимуса.
Цель исследования — изучить морфологические особенности телец Гассаля и их микроокружения у новорожденных с увеличенной массой тимуса.
Материал и методы
Морфологическое исследование проводилось на секционном материале. Было изучено 40 протоколов вскрытия и аутопсийный материал детей, умерших в возрасте до 1 мес, причинами смерти которых явились следующие состояния: инфекции (16 случаев), синдром дыхательных расстройств (7 случаев), внутрижелудочковые кровоизлияния (12 случаев), кровоизлияния в надпочечники (2 случая), пороки развития (3 случая). Исследование одобрено комитетом по этике Саратовского государственного медицинского университета, протокол №6 от 06.02.18.
Для установления соответствия массы тимуса возрасту и массе тела ребенка рассчитывали тимический индекс (ТИ%):
ТИ% = масса тимуса (г)/масса тела (г)·100%.
Степень увеличения тимуса оценивали по центильной таблице согласно возрасту ребенка [2]. Все случаи были разделены на две группы: 1-я группа детей с нормальной массой тимуса (n=24 случаев) ТИ% менее 0,42 (группа сравнения) и 2-я группа с увеличенной массой тимуса (n=16 случаев) ТИ% более 0,42 (исследуемая группа).
Фиксацию, проводку и микротомию материала осуществляли по стандартным методикам. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также проводили иммуногистохимическое (ИГХ) исследование с применением мультимерной безбиотиновой системы детекции Reveal — Biotin-Free Polyvalent DAB (Spring Bioscience Corp., США) и антител (АТ) к p53, CD3, CD68, CK19, PanCK (табл. 1).
Таблица 1. Иммуногистохимические маркеры, применявшиеся в исследовании
| Антитела (клон) | Клональность/источник (разведение) | Производитель, страна | Цель |
| p53 (D07) | Моноклональные/мышиные (1:100) | Cell Marque Sigma-Alorich, США | Апоптотические клетки |
| CD3 (SP7) | Моноклональные/кроличьи (1:1000) | Abcam, Великобритания | Зрелые тимоциты |
| CD68 (E19194) | Поликлональные/кроличьи (1:1000) | Spring Bioscience, США | Макрофаги |
| CK19 (RCK108) | Моноклональные/мышиные (1:50) | DAKO, США | Эпителиальные клетки тимуса |
| Pan-CK (AE1/AE3) | Моноклональные/мышиные (1:500) | Cell Marque Sigma-Alorich, США | То же |
Морфологическое исследование проводили при помощи микровизора ЛОМО mVizo-103.
Подсчитывали количество ТГ в 10 полях зрения при увеличении в 774 раза и определяли степень их зрелости с применением классификации, предложенной А.Г. Беловешкиным [9].
Рассчитывали индексы мозгового (ИМВ) и коркового вещества (ИКВ) по формулам:
;
.
Кроме того, подсчитывали количество клеток микроокружения ТК в 10 полях зрения отдельно в корковом и мозговом веществе.
Экспрессию ИГХ-маркеров оценивали в 1000 клетках, окружающих ТГ в 6—8 полях зрения, и вычисляли процент клеток с положительной экспрессией.
Полученные данные подвергали статистической обработке при помощи программного обеспечения Microsoft Excel. Для определения нормальности распределения высчитывали критерий Шапиро—Уилка, анализ показал ненормальное распределение исследуемых показателей. Исходя из этого, для определения статистически достоверных различий в группах был использован непараметрический Z-критерий Манна—Уитни.
Результаты
В тимусах, имеющих нормальную массу (группа сравнения) при морфологическом изучении с применением обзорных методов окрашивания, была выявлена типичная гистологическая картина: тонкая соединительнотканная капсула, крупные дольки, хорошо выраженные междольковые перегородки, четкое разделение мозгового и коркового слоев. Индекс мозгового вещества в этой группе составил 29%, медиана количества клеток в поле зрения коркового вещества — 174 тимоцита, в мозговом — 127. ТГ в этой группе преимущественно располагались в мозговом веществе, однако единичные ТГ встречались и в корковом слое. Медиана количества ТГ в поле зрения составила 5 (см. табл. 1).
В исследуемой группе (тимус с увеличенной массой) морфологическая картина несколько отличалась. Выявлялось утолщение капсулы железы за счет отека и склероза, площадь долек была меньше на 15%, чем значение соответствующего показателя в группе сравнения. В 23,5% случаев этой группы наблюдалась инверсия слоев тимуса. Индекс мозгового вещества снижался до 17%. Количество клеток в корковом веществе было значительно выше (на 38%) и составило 279 тимоцитов в поле зрения (Z= 4,075; p=0,00005), в мозговом веществе 132 тимоцита в поле зрения, что не отличалось от значений группы сравнения. ТГ в этой группе также преимущественно локализовались в мозговом слое тимуса. Количество телец в поле зрения снижалось на 20% (табл. 2). Особое внимание обращало развитие в них дистрофических изменений, кистозной трансформации. Размеры ТГ в обеих группах достоверно не отличались.
Таблица 2. Морфометрические показатели телец Гассаля
| Тельца Гассаля | Тимус с нормальной массой | Тимус с увеличенной массой | Z | p |
| Me (q25—q75) {min—max} | Me (q25—q75) {min—max} | |||
| Количество в поле зрения | 5 (4—6) {1—10} | 4 (3—6) {1—9} | –2,030 | 0,042 |
| Прогрессивные, % | 16,67 (0—25) {0—100} | 7,14 (0—25) {0—50} | –1,32 | 0,186 |
| Зрелые, % | 46,43 (25—60) {0—100} | 29,17 (16,67 015150) {0—75} | 4,71 | 0,000 |
| Регрессивные, % | 33,33 (20—66,67) {0—100} | 60 (50—66,67) {0—100} | 5,30 | 0,000 |
Примечание. Здесь и в табл. 3 и 4: при статистической обработке использовали непараметрический критерий Манна—Уитни, различия считали достоверными при p≤0,05.
По степени дифференцировки все ТГ были разделены на 3 типа [9]: прогрессивные, зрелые и регрессивные. Прогрессивные тельца состояли из 1—4 эпителиоцитов I типа (округлой формы) и были представлены образованиями следующего вида: 1) состоящие из единичной гипертрофированной клетки (стадия одноклеточного тельца) (рис. 1, а); 2) сформированные скоплением округлых клеток вокруг первичной гипертрофированной клетки (стадия юного тельца) (рис. 1, б); 3) с начальными признаками формирования полости (стадия молодого тельца) (рис. 1, в).
Рис. 1. Тельца Гассаля различной степени дифференцировки.
а—в — прогрессивные; г—е — зрелые; ж—и — регрессивные. Иммуногистохимическая реакция с антителами к Pan-Cytokeratin, ×774.
Отличительной чертой зрелых телец являлось наличие двух типов эпителиоцитов (округлой и вытянутой формы) и сформированного кератинового ядра. По степени сформированности кератинового ядра среди зрелых ТГ выделяли следующие виды: ТГ, в полости которых присутствуют единичные кератиновые пластины (стадия формирования кератинового ядра) (рис. 1, г); ТГ с концентрически расположенными кератиновыми пластинами (стадия сформированного кератинового ядра) (рис. 1, д); ТГ, в которых кератиновые пластины занимали более половины полости тельца (стадия начала разрушения кератинового ядра) (рис. 1, е).
Типичным проявлением для зрелых ТГ являлись образования с одной полостью и одним кератиновым ядром. Многокамерные тельца, т.е. имеющие несколько полостей, встречались редко, причем с одинаковой частотой в обеих группах. Эпителиоциты II типа в зрелых тельцах содержали два вида включений: первые — базофильные, имели вид гранул синего или темно-фиолетового цвета, располагающихся в цитоплазме клеток; включения второго типа имели вид гранул черного цвета, которые в 2,5 раза чаще встречались в зрелых тельцах группы с увеличенной массой тимуса (рис. 2).
Рис. 2. Включения в зрелых тельцах Гассаля в эпителиоцитах II типа.
а — группа сравнения; б — исследуемая группа. Иммуногистохимическая реакция с антителами к p53, ×774.
Среди ТГ регрессивного типа выделяли следующие разновидности: ТГ, в которых кератиновые пластины занимали менее половины полости (разрушение 1-й стадии) (рис. 1, ж); ТГ, в полости которых обнаруживали клеточный детрит или пустоту (разрушение 2-й стадии) (рис. 1, з); ТГ с признаками разрыва стенки (разрушение 3-й стадии) (рис. 1, и). В регрессивных тельцах отсутствовали эпителиоциты I типа.
В группе сравнения соотношение ТГ (прогрессивные: зрелые:регрессивные) составляло 1:2,8:2, т.е. преобладали зрелые тельца.
В исследуемой группе подобное соотношение составляло 1:4,1:8,4, т.е. преобладали регрессивные тельца, что свидетельствовало о замедлении процессов обновления ТГ.
При проведении сравнительного анализа между двумя группами было установлено, что доля прогрессивных и зрелых телец во 2-й группе (с увеличенной массой тимуса) уменьшается по сравнению с 1-й группой (нормальной массой тимуса) в 2,3 и 1,6 раза соответственно, при этом доля регрессивных телец увеличивается практически в 2 раза (см. табл. 2).
При проведении ИГХ-реакций было обнаружено, что в группе сравнения большая часть клеток микроокружения ТГ была представлена T-лимфоцитами — 63% (рис. 3, а); доля апоптотических лимфоцитов составила 36% (рис. 3, б); доля макрофагов — 3,5% (рис. 3, в). Установлено, что в этой группе CD68-положительные клетки локализовались в полости практически всех ТГ регрессивного типа (см. рис. 3, в).
Рис. 3. Экспрессия иммуногистохимических маркеров в клетках микроокружения телец Гассаля.
Иммуногистохимическая реакция с антителами к: а, г — CD3; б, д — p53; в, е — CD68, ×774. Пояснение в тексте.
В исследуемой группе экспрессия всех использованных ИГХ-маркеров снижалась: CD3-положительных лимфоцитов практически в 1,5 раза (табл. 3, рис. 3, г); экспрессия маркера активации апоптоза p53 более, чем в 2 раза (см. табл. 3, рис. 3, д), экспрессия CD68 — в 3,5 раза (см. табл. 3, рис. 3, е). Следует отметить, что в данной группе локализация макрофагов в полости телец была единичной.
Таблица 3. Экспрессия иммуногистохимических маркеров в клетках микроокружения телец Гассаля
| Маркер | Тимус с нормальной массой Me (q25—q75) {min—max} | Тимус с увеличенной массой Me (q25—q75) {min—max} | Z | p |
| p53, % (маркер апоптоза) | 36 (24—47) {19—53} | 15 (12—26) {10—38} | 2,751 | 0,006 |
| CD68, % (макрофаги) | 3,5 (1—7) {0—13} | 1 (0—4) {0—13} | 3,033 | 0,002 |
| CD3, % (тимоциты) | 63 (48—90,5) {23—110} | 47 (23—59) {3—81} | 2,340 | 0,019 |
В группе сравнения эпителиальные CK19-положительные клетки распределялись равномерно в корковом и мозговом веществе, формируя сеть, в ячейках которой располагались тимоциты (рис. 4, а). Доля ТГ с положительной экспрессией данного маркера в этой группе составила 65,4% (см. рис. 3, в).
Рис. 4. Экспрессия цитокератина-19 в тимусе.
а, в — группа сравнения; б, г — исследуемая группа. Иммуногистохимическая реакция с антителами к СК19, ×774. Пояснение в тексте.
В группе с увеличенной массой тимуса CK19-положительные клетки не формировали сетчатых структур и были распределены неравномерно: единичные клетки встречались в корковом веществе и располагались они преимущественно у междольковых перегородок, общее число таких клеток в корковом веществе тимусов исследуемой группы снижалось на 91% (табл. 4, рис. 4, б). Доля CK19-положительных клеток в микроокружении ТГ, расположенных в мозговом слое, достоверно не изменялась и составила 7,8%.
Таблица 4. Экспрессия CK19 в клетках тимуса
| Клетки с позитивным окрашиванием | Нормальная масса тимуса Me (q25—q75) {min—max} | Увеличенная масса тимуса Me (q25—q75) {min—max} | Z | p |
| В корковом слое, % | 7,85 (4,66—10,75) {0—15,93} | 0,67 (0—2,05) {0—5,13} | 4,16 | 0,00 |
| В мозговом слое, % | 7,56 (5,93—12,68) {3,97—19,19} | 7,87 (5,6—9,3) {3,68—13,24} | 1,78 | 0,06 |
| В составе телец Гассаля, % | 70 (41,33—72) {41—72} | 66 (65—66,67) {46—73,33} | 0,23 | 0,82 |
Доля ТГ с положительной экспрессией данного маркера не изменялась, медиана этого показателя в группах исследования и сравнения составила 66 и 70% соответственно (см. табл. 4, рис. 4, г).
Обсуждение
В литературе [10] имеются сведения, что морфология тимуса при увеличении не отличается от его строения в норме. Морфологическая картина тимусов группы сравнения, которую мы принимали за условную норму, поскольку все дети умерли от заболеваний, а не среди полного здоровья, в нашем исследовании полностью соответствовала типичному описанию, представленному другими авторами [6, 7]. В нашем исследовании было обнаружено, что увеличение массы тимуса сочетается с уменьшением площади долек тимуса, о чем имеются единичные публикации [10, 11]. Следует отметить, что в этих публикациях указывается на увеличение индекса мозгового вещества долек тимуса, чего не наблюдалось в наших случаях. Возможно, это объясняется тем, что авторы использовали материал других возрастных групп.
В иностранной литературе [10, 12] широко распространен термин «гиперплазия вилочковой железы», употребление которого обозначает увеличение числа тимоцитов в поле зрения, однако конкретное число тимоцитов, характерное для данного термина, ни в одном источнике найти не удалось. Было установлено, что при увеличении массы тимуса количество тимоцитов в корковом слое увеличивается на 38% и составляет 279 тимоцитов, в мозговом веществе количество тимоцитов не отличается от группы сравнения — 132 тимоцита.
При наиболее часто встречаемой патологии неонатального периода, которую мы изучали, было установлено уменьшение общего количества ТГ в увеличенном тимусе на 20%. По данным Corrado Lavini и соавт. [13], количество ТГ также снижается при аутоиммунных заболеваниях и иммунодефицитных состояниях. Возможно, эти изменения можно рассматривать как признак нарушения функционирования вилочковой железы.
Несмотря на большое количество классификаций ТГ, вопрос об их соотношении по степени зрелости ни в норме, ни при патологии в литературе ранее не поднимался. Описанные кистозные изменения и формирования «многокамерных» ТГ мы нашли только в статье Е.А. Постоваловой и соавт. [14] при описании тимуса при язвенном колите. К сожалению, авторы не соотносили описываемые изменения с массой вилочковой железы.
Было установлено, что в тимусе с увеличенной массой наиболее часто встречаются ТГ регрессивного типа, в которых преобладают эпителиоциты II типа, т.е. в увеличенном тимусе процессы деградации ТГ превалируют над процессами их образования и созревания. Уменьшение количества зрелых ТГ приводит к снижению процессов негативной селекции T-лимфоцитов. Об этом же свидетельствует снижение экспрессии апоптозиндуцирующего маркера p53. К сожалению, сведений о количественной оценке апоптотических тимоцитов в увеличенной вилочковой железе в литературе найти не удалось. Мы нашли сведения об изучении апоптоза в тимусе в условиях его акцидентальной инволюции при стрессе. Авторы [15] отмечают, что типичной реакцией тимуса на стрессовое воздействие является увеличение доли апоптотических клеток. Снижение апоптотических процессов в увеличенном тимусе позволяет предположить, что на фоне ослабления процессов негативной селекции T-лимфоцитов в нем накапливаются «дефектные» тимоциты. Возможно, этим объясняется и уменьшение доли клеток, экспрессирующих маркер CD3, с 63% в группе с нормальной массой тимуса до 47% в группе с увеличением массы тимуса. В источниках литературы [16] имеются сведения, что наличие CD3-антигена характерно для зрелых тимоцитов.
Снижение количества CD3-позитивных лимфоцитов в мозговом слое тимуса Е.В. Москвичев и соавт. [17] наблюдали в эксперименте у спленэктомированных животных, что они связывали с удалением селезенки и усиленной миграцией зрелых T-лимфоцитов в периферическую кровь.
Снижение CD68-позитивных клеток в увеличенном тимусе свидетельствует о снижении количества макрофагов в окружении ТГ. Об этом факте мы уже упоминали в одной из статей [18]. Фенотип CD68 связывают с появлением активированных макрофагов, которые обеспечивают клеточно-опосредованный иммунный ответ, также они могут реагировать на различные стрессовые стимулы [19, 20]. Возможно, снижение апоптотических процессов и уменьшение количества макрофагов взаимосвязаны. Нет апоптозных телец, не нужны и макрофаги для их утилизации.
Эпителиальные клетки тимуса очень важны для процесса дифференцировки тимоцитов в вилочковой железе. Эти клетки имеют множество отростков, формирующих сеть, которая необходима для правильной дифференцировки T-лимфоцитов [21]. В ряде исследований отмечают, что увеличение числа СК19-положительных клеток является типичной реакцией вилочковой железы на стресс и воспалительные процессы. Описанные изменения клеточного состава вилочковой железы авторы [22] связывают с восстановлением коркового слоя за счет активации процессов пролиферации и дифференцировки тимоцитов. В нашем исследовании установлено, что увеличение массы вилочковой железы влечет снижение СК19-положительных клеток в корковом слое тимуса и нарушение формирования сети между этими клетками как в корковом, так и в мозговом веществе тимуса. Этот факт еще раз подтверждает нарушение дифференцировки T-лимфоцитов в увеличенном тимусе.
Заключение
Тимус как центральный орган иммуногенеза может полноценно осуществлять свои функции (лимфопоэтическую, иммунорегуляторную и эндокринную) только благодаря четкому взаимодействию всех структурных компонентов. В тимусе с увеличенной массой нарушается структурно-функциональная организация органа: при уменьшении площади долек на 15% увеличивается количество тимоцитов в корковом слое на 38%. В 23,5% случаев наблюдается инверсия слоев тимуса. Снижается количество макрофагов, эпителиальных клеток и ТГ (с преобладанием регрессивных телец), что свидетельствует о нарушении процессов созревания, апоптоза и отрицательной селекции лимфоцитов и может приводить к развитию нарушений иммуногенеза.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Д.А. Мудрак, Н.А. Наволокин, Г.Н. Маслякова
Сбор и обработка материала — Д.А. Мудрак
Статистическая обработка данных — Д.А. Мудрак
Написание текста — Д.А. Мудрак
Редактирование — Н.А. Наволокин, Г.Н. Маслякова
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.