Амплификация гена c-MYC при ацинарной аденокарциноме простаты. Морфогенетические сопоставления

Рак простаты (РП) сохраняет лидирующие позиции среди злокачественных опухолей у мужчин в старшей возрастной группе как по частоте встречаемости, так и среди причин смертности, наибольший удельный вес отмечается в возрасте от 60 лет и старше. В структуре заболеваемости мужского населения в 2021 г. злокачественные новообразования простаты заняли 15,1% со среднегодовым темпом прироста 3,39%, незначительно уступая лишь злокачественным новообразованиям органов дыхания (16,4%) [1]. Представленные данные не оставляют сомнений в важности проблемы прогнозирования развития и прогрессии РП.

В настоящее время прогноз заболевания во многом определяется показателями уровня сывороточного простатспецифического антигена (ПСА), стадией заболевания и степенью гистологической дифференцировки, определяемой суммарным показателем Глисона. При этом суммарный показатель Глисона рассматривается как один из наиболее чувствительных критериев прогноза прогрессии РП. Типично обнаружение продвинутых стадий заболевания в случаях с высокими показателями сывороточного ПСА при опухолях высоких градационных групп (далее — GG). Остается нерешенной оценка случаев РП, имеющего низкие показатели ПСА и GG, но диагностированного на продвинутой стадии заболевания. С другой стороны, с постоянством обнаруживается обратная ситуация, при которой высокие гистологические GG не коррелируют с продвинутой стадией заболевания и показателями уровня сывороточного ПСА. Это позволяет предположить некую внутригрупповую гетерогенность таких опухолей.

Известно, что инициация опухолевого роста и прогрессия заболевания реализуются в первую очередь при различных цитогенетических аномалиях клеток опухоли, определяющих их пролиферативный потенциал, способность к инвазивному росту и метастазированию. РП не является исключением и обнаруживает невероятное разнообразие мутационных событий, наблюдаемых в клетках опухоли. Одним из наиболее изученных генов, аберрации которого обусловливают неблагоприятное течение злокачественных опухолей, является ген c-MYC (8q24). Опубликовано значительное количество работ, посвященных исследованию роли гена с-MYC при РП [2, 3]. Остается не ясным значение альтерации гена c-MYC при РП, характеризующихся дискордантными показателями суммы Глисона и стадией заболевания.

Цель настоящей работы — оценка амплификации гена c-MYC в субстрате ацинарной аденокарциномы простаты (ААП) при различных показателях суммы Глисона и стадиях заболевания с учетом морфологических характеристик опухоли.

Все процедуры, выполненные в исследовании, соответствуют стандартам этического комитета организации, Хельсинкской декларации 1964 г. и ее последующим изменениям. От каждого пациента, включенного в исследование, получено добровольное информированное согласие. Исследованию подлежала ткань простаты, полученная от пациентов с РП при 12-точечной многофокусной пункционной биопсии простаты. Общее количество случаев, включенных в настоящее исследование — 82, из них 12 — группа контроля. Контрольные образцы не содержали признаков карциномы простаты, а также предрасполагающего для ее развития субстрата (простатическую интраэпителиальную неоплазию и атипическую внутрипротоковую пролиферацию). При оценке изучаемых показателей в группе контроля во внимание принимались железы нормального строения. Исследуемые образцы отбирались по принципу слепого метода на основании установления диагноза ААП с последующей детальной оценкой клинических, лабораторных и морфогенетических показателей. Клинические данные включали возраст пациента, показатель сывороточного ПСА, объем простаты по результату ТРУЗИ, ПЭТ. Условиями исключения стали неоадъювантная терапия по поводу РП или терапия иного новообразования, отсутствие результатов лабораторных и инструментальных данных, дефекты забора материала (малый объем).

Морфологическое исследование включало исследование гистологических препаратов ткани простаты, обработанных по стандартной технологии, окрашенных гематоксилином и эозином. Оценка каждого биоптата включала определение суммарного показателя Глисона, градационной группы по ВОЗ [4], оценку лимфоваскулярной и периневральной инвазии. Под периневральной инвазией понимали рост опухоли в эпиневрии, периневрии или эндоневрии. Лимфоваскулярная инвазия оценивалась как обнаружение опухолевых клеток и их скопление непосредственно в просвете лимфатических и кровеносных сосудов. Для стратификации пациентов учитывалась максимальная градационная группа из 12 образцов простаты, полученных при многофокусной пункционной биопсии. Отдельно учитывались специфические архитектурные характеристики опухоли: криброзные и гломерулоидные структуры, комедонекрозы.

Цитогенетическое исследование проводили на серийных срезах простаты с соотнесением зон интереса с морфологическим субстратом опухоли. Материал фиксирован в 10% забуференном формалине. Серийные срезы изготавливали толщиной 3—4 мкм, крайние срезы были окрашены по стандартной методике гематоксилином и эозином, остальные срезы подвергнуты депарафинизации, дегидратации и дальнейшей обработке в 0,01М цитратном буфере в течение 15 мин при 96—98 °C, согласно инструкции к набору пробоподготовки (Tissue Digestion Kit I), с последующей промывкой в дистиллированной воде при комнатной температуре по 2 мин дважды и обработкой пепсином в течение 15 мин при температуре 37 °C. По истечении времени инкубации в пепсине срезы промывали в дистиллированной воде 1 мин при комнатной температуре и далее обрабатывали буфером на основе хлорида натрия, подвергали дегидратации в этиловом спирте в градиенте концентрации 70, 85 и 100% соответственно по 1 мин при комнатной температуре. После высыхания на срезы наносили зонд c-MYC (8q24)/SE8 (Kreathech Biotechnology, Netherlands). Затем срезы помещали в гибридайзер на 16—18 ч и запускали программу коденатурации и гибридизации. После завершения программы срезы доставали, промывали трижды в SSC, дегидратировали и сушили в темном месте, согласно инструкции к набору.

Затем наносили краситель DAPI, срезы интерпретировали с применением микроскопа ZeissAxioImagerM2 (Германия) с блоком люминесцентных фильтров: DsRed λ 545/25 нм, FITC λ 450—490 нм, DAPI λ 365 нм, обработку результатов проводили в программе ZEN (Zeiss, Германия). Подсчет генетических событий выполняли в зонах интереса с пересчетом на 50 клеток опухоли, определением среднего количества сигналов (копий) на клетку, с учетом количества центромерных сигналов для исключения полисомии или наличия делеции 8-й хромосомы. Статистический анализ выполняли методами вариационной статистики для непараметрических величин с использованием программы Statistica 10, StatSoft. Расчетные значения приведены в медианах с указанием 25-го и 75-го перцентиля.

В основную группу вошло 70 человек с морфологически подтвержденной ААП. Медиана возраста составила 70 лет (25% — 64 года; 75% — 74 года), объем простаты (в см³) по результату ТРУЗИ оценивался в 41,9 (25% — 32,4; 75% — 160,3), показатель уровня общего PSA (в нг/мл) составил 12,6 (25% — 9,0; 75% — 28,7). Характеристика пациентов по стадии заболевания на момент исследования представлена в табл. 1.

Таблица 1. Характеристика пациентов по стадиям заболевания и гистологическим градационным группам

Примечание. * — стадия заболевания по классификации TNM; GG — градационная группа по системе ВОЗ.

Из приведенных данных с учетом результатов дисперсионного анализа следует, что в исследуемой группе пациентов преобладали случаи первичной диагностики РП II стадии, среди которых большая часть на основании морфологического исследования была отнесена к GG4. Сравнительный анализ показал, что большая часть случаев с IV стадией заболевания вошла в 4-ю градационную группу (p>0,05). Следовательно, по этому параметру группы рассматриваются как сопоставимые.

Цитогенетическое исследование в части амплификации гена c-MYC дало следующие результаты. Амплификация c-MYC обнаруживалась в клетках опухоли в виде увеличения количества копий гена на ядро в интервале от 4—6 и от 8 (последнее расценивалось как кластерная амплификация) (рис. 1).

Рис. 1. Результат FISH исследования с зондом c-MYC (8q24)/SE8,

а — эпителий нормальной железы без амплификации гена c-MYC; б — ацинарная аденокарцинома простаты: ▲ — кластерная амплификация гена c-MYC с копийностью с-MYCx8+ SEx2, ▲ — амплификация гена c-MYC с копийностью с-MYCx4-6 SEx2. ×1000.

Во всех случаях исследуемой группы обнаруживалась амплификация гена c-MYC в субстрате опухоли, что достоверно отличало ее от группы контрольных образцов (p<0,05) с медианой значения числа клеток с амплификацией, равной 13 (Q₂₅ — 10; Q₇₅ — 23), что составило 26% от числа оцениваемых клеток опухоли. Вместе с этим при сравнительном анализе частоты обнаружения амплификации гена c-MYC не было установлено значимых различий между гистологически определяемой градационной группой и уровнем амплификации гена (p>0,05) (рис. 2, а). Также не было обнаружено такой зависимости при оценке групп с учетом уровня копийности гена в клетках (p>0,05). Межгрупповой сравнительный анализ между стадией заболевания и амплификацией гена с-MYC не выявил значимых различий при сравнении случаев со II и III стадиями заболевания (см. рис. 2, б). Обнаруживалось достоверное различие по уровню амплификации гена при сравнении групп пациентов со II и III клиническими стадиями заболевания с группой, отнесенной к IV стадии опухолевого процесса: (11,0 (Q₂₅ — 8,0; Q₇₅ —12,5) и 19,0 (Q₂₅ — 11; Q₇₅ — 22,5) соответственно в сравнении с 37,5 (Q₂₅ — 34,0; Q₇₅ — 41,0); p<0,05.

Анализ уровня копийности гена c-MYC среди случаев со II и III стадиями выявил сложную комбинацию различий как между группами, так и группой пациентов с IV стадией заболевания. Так, при оценке случаев с 4—6-кратной копийностью гена (далее — c-MYCx4-6 SEx2) не установлено достоверных различий между пациентами со II и III стадиями (p>0,05) 10,0 (Q₂₅ — 8; Q₇₅ — 11,5) и 13,5 (Q₂₅ — 9,5; Q₇₅ — 16,5) соответственно при значимом отличии обеих этих групп от IV стадии 30,0 (Q₂₅ — 27,0; Q₇₅ —34,0); p < 0,05. Кластерная амплификация гена c-MYC (далее — с-MYCx8+ SEx2) была обнаружена с равной частотой в группах пациентов с III 5,0 (Q₂₅ — 2,0; Q₇₅ — 6,5) и IV 7,5 (Q₂₅ — 5,0; Q₇₅ — 9,0) стадиями заболевания (p > 0,05) и достоверно отличала их от пациентов со II стадией, у которых обнаружение кластерной амплификации встречалось в единичных случаях с низким числом клеток (p<0,05).

Рис. 2. Уровень амплификации гена c-MYC в клетках аденокарциномы простаты в зависимости от гистологической градационной группы (а) и стадии заболевания (б).

По оси абсцисс: число клеток, обнаруживающих амплификацию гена c-MYC (при подсчете на 50 клеток); по оси ординат: GG — гистологическая градационная группа, Control — эпителий нормальных желез простаты.

Анализ исследуемых групп по принципу деления на основе системы TNM позволил выявить сложные межгрупповые отличия (рис. 3). В случаях исследования материала с совокупной оценкой уровня амплификации гена c-MYC от пациентов со стадиями T2a, T2b, T2c и T3a значимых различий не обнаружено (за исключением случаев, отнесенных к стадии T2с, которые обнаруживали больший уровень амплификации в сравнении со случаями, относящимися к стадиям T2a и T2b). Вместе с этим полученные данные выявили резко значимое увеличение уровня совокупной амплификации гена c-MYC в группах с продвинутыми стадиями заболевания (p<0,02) (табл. 2).

Рис. 3. Уровень амплификации гена c-MYC в клетках аденокарциномы простаты в зависимости от стадии TNM.

а — общее число событий амплификации; б — амплификация с-MYCx4-6 SEx2; в — кластерная амплификация с-MYCx8+ SEx2.

По оси абсцисс: стадия по системе TNM, Control — эпителий нормальных желез простаты; по оси ординат: число клеток, обнаруживающих амплификацию гена c-MYC (при подсчете на 50 клеток).

Таблица 2. Характеристика пациентов по стадии TNM и уровню амплификации гена c-MYC в клетках опухоли

Примечание. * — данные приведены в Me (Q_25%; Q_75%).

Детализация уровня амплификации гена c-MYC у пациентов с различными стадиями обнаружила, что некластерная амплификация (с-MYCx4-6 SEx2) достоверно отличает пациентов со стадиями T4M0 и T4M1 от остальных со значительным повышением показателя (p<0,05). Вместе с этим обнаружены и значительные различия между самими стадиями заболевания T4M0 и T4M1. В метастатической стадии отмечалось значительное увеличение уровня амплификации гена c-MYC в сравнении со стадией T4M0 (p<0,02). В группе контроля выявлены лишь единичные случаи амплификации гена c-MYC, рассматриваемые как случайное событие.

Кластерная амплификация гена c-MYC не обнаруживалась в клетках нормальных ацинусов и с постоянством определялась на продвинутых стадиях заболевания (T3a, T4M0 и T4M1). На представленных диаграммах прослеживаются межгрупповые различия с преобладанием случаев обнаруживаемой амплификацией гена c-MYC в группе пациентов со стадиями заболевания T4M0 и T4M1. При этом наиболее отчетливо эти различия видны при оценке совокупной амплификации гена c-MYC и при оценке некластерной амплификации (рис. 3).

Оценка опухолевого субстрата в части проявления опухолевой периневральной и лимфоваскулярной инвазии также выявила значимые межгрупповые отличия. В группе с периневральной инвазией оценка уровня копийности гена c-MYC позволила установить значимое превышение этого показателя в сравнении с группой без периневральной инвазии с показателями 30,0 (Q₂₅ — 20,0; Q₇₅ — 38,0) против 10,0 (Q₂₅ — 8,0; Q₇₅ — 12,0); p<0,05.

Лимфоваскулярная инвазия сопровождалась повышенным уровнем амплификации c-MYC в сравнении со случаями, в которых внутрисосудистой инвазии не обнаруживалось (p<0,05). Внутригрупповые показатели составили 12,5 (Q₂₅ — 10,5; Q₇₅ — 18,3) и 32,4 (Q₂₅ — 17,3; Q₇₅ — 52,1) в группах с лимфоваскулярной инвазией и без нее соответственно (рис. 4).

Рис. 4. Уровень амплификации гена c-MYC в клетках аденокарциномы простаты в зависимости от периневральной инвазии (а) и лимфоваскулярной инвазии (б).

По оси абсцисс: PN0 — периневральная инвазия отсутствует; PN1 — периневральная инвазия присутствует; LV0 — лимфоваскулярная инвазия отсутствует; LV1 — лимфоваскулярная инвазия присутствует; Control — эпителий нормальных желез простаты; по оси ординат: число клеток, обнаруживающих амплификацию гена c-MYC (при подсчете на 50 клеток).

Оценка образцов по системе градаций Глисона с учетом формулы складываемых градаций не выявила значимых межгрупповых различий уровня амплификации гена c-MYC (p<0,05) (рис. 5, а).

Рис. 5. Уровень амплификации гена c-MYC в клетках аденокарциномы простаты в зависимости от суммарного показателя Глисона (а) и криброзной организации клеток опухоли (б).

По оси абсцисс: а — формула градационных групп в сумме Глисона; б — способность опухоли к формированию криброзных структур; по оси ординат: число клеток, обнаруживающих амплификацию гена c-MYC (при подсчете на 50 клеток).

Оценка уровня амплификации гена c-MYC при стратификации случаев по принципу присутствия криброзного паттерна организации желез (4-я градация по системе Глисона) позволила выявить статистически значимые межгрупповые различия (см. рис. 5, б). Так, в случаях с криброзной организацией опухоли значимо чаще обнаруживались высокие уровни копийности гена c-MYC в сравнении с таковыми без криброзных структур. Показатели амплификации гена c-MYC составили 12 (Q₂₅ — 8; Q₇₅ — 13) против 29 (Q₂₅ — 13; Q₇₅ — 38) в группах без криброзных структур и с криброзной организацией опухоли соответственно.

Гиперактивация гена c-MYC в настоящее время рассматривается как одна возможных причин канцерогенеза в различных опухолях эпителиального происхождения. Сверхэкспрессия белка MYC рассматривается некоторыми авторами [5] как раннее событие, возникающее в люминальном эпителии очагов простатической интраэпителиальной неоплазии высокой степени и эпителии РП. Установлено, что патологическая активация гена c-MYC в эпителии желез простаты является достаточным событием для инициации механизмов канцерогенеза. Важно отметить, что около 25% семейного риска РП связано с вариациями зародышевой линии локуса 8q24, связывающими эту область с регуляцией гена MYC. Сверхэкспрессия MYC в нормальных люминальных клетках простаты мышей достаточна для инициации РП. Это доказывает, что нарушение регуляции экспрессии белка MYC является онкогенным событием, приводящим к инициации механизмов развития РП [6]. Также одновременная активация программы транскрипции с низким уровнем экспрессии андрогенового рецептора и высоким уровнем экспрессии MYC ускоряет прогрессирование РП в сторону метастатического резистентного к кастрации заболевания [2]. Амплификация гена c-MYC в клетках карциномы простаты, по мнению ряда авторов, определяет особую группу пациентов, характеризующихся продвинутой стадией заболевания с отдаленным метастазированием и неблагоприятным прогнозом.

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы. Как ранее было установлено другими исследовательскими группами [3, 7], амплификация гена c-MYC в эпителии нормальных желез не определяется. В проведенном исследовании во всех случаях ААП с постоянством определялась амплификация гена c-MYC с различным уровнем копийности гена от минимальной до кластерной (8 сигналов и более на ядро). Сопоставление уровня амплификации гена c-MYC с морфологической градационной группой позволяет высказать мнение, что зависимость между этими показателями отсутствует, т.е. вероятность обнаружения увеличения копийности гена присутствует как в случаях с GG3, так и в более высоких градационных группах. Также не получены значимые различия между показателем копийности гена c-MYC и клинической стадией заболевания. В нашем исследовании выявлено значимое межгрупповое различие между уровнем амплификации гена c-MYC со стадией заболевания, определяемой по системе TNM. Так, продвинутые стадии заболевания неизменно характеризовались резко повышенной копийностью гена. Такие показатели в полной мере соответствуют наблюдениям, сделанными другими исследовательскими группами [2]. Проведенное исследование позволяет предположить, что достаточным оценочным критерием является совокупная амплификация гена c-MYC в клетках опухоли, коррелирующая с таковой при оценке кластерной и некластерной амплификации. Вместе с этим кластерная амплификация достоверно чаще наблюдается при продвинутых и метастатических стадиях опухолевой прогрессии.

Одним из факторов неблагоприятного прогноза при аденокарциноме простаты является периневральная инвазия опухоли в основном очаге роста как при локализованной, так и распространенной стадиях заболевания [8, 9]. В проведенном представленном исследовании случаи ААП, сопровождающиеся периневральной инвазией опухоли, характеризовались повышенным уровнем копийности гена c-MYC в сравнении с таковыми без явлений периневральной инвазии. Более того, обнаружена положительная корреляция между стадией заболевания по системе TNM, амплификацией гена c-MYC и периневральной инвазией.

Лимфоваскулярная инвазия — общеизвестный фактор неблагоприятного прогноза для многих злокачественных новообразований, внесенный в протоколы исследований большинства клинических рекомендаций. Большое число исследований показало, что наличие лимфоваскулярной инвазии при прочих равных условиях является независимым фактором худшего прогноза при РП. Наличие лимфоваскулярной инвазии сопровождается кратным увеличением вероятности более раннего биохимического рецидива, метастатического поражения лимфатических узлов, меньшей успешностью лучевой терапии. В связи с этим решением согласительной конференции ISUP 2009 г. закреплена обязательность отражения в морфологическом заключении факта лимфоваскулярной инвазии [10]. В нашем исследовании продемонстрировано повышение уровня амплификации гена c-MYC в случаях РП, когда обнаруживались явления внутрисосудистой инвазии.

Другим фактором неблагоприятного прогноза при РП является обнаружение криброзного паттерна роста по системе Глисона. Согласно данным литературы [11], криброзные структуры обнаруживаются примерно в 90% случаев РП при ISUP grade group 2 с локальными или отдаленными метастазами и значительно реже (в 38%) встречаются у пациентов без метастазирования аденокарциномы. В проведенном исследовании криброзные паттерны организации обнаруживались в составе опухолей 3-й и 4-й гистологической градации (GG3, GG4). Выполненный анализ выявил статистически значимое увеличение копийности гена c-MYC в опухолях, содержащих криброзный паттерн организации желез в сравнении с опухолями без крибриформного роста.

Таким образом, проведенное исследование показало, что амплификация гена c-MYC в клетках опухоли простаты сопряжено с продвинутыми стадиями заболевания (T4M0 и T4M1) и нарастанием копийности гена при метастатической стадии процесса. Обнаружено, что повышенная амплификация гена c-MYC отличает группы пациентов, в опухолях которых обнаруживаются явления периневральной и лимфоваскулярной инвазии, а также крибриформный паттерн организации опухоли. Проведенное исследование позволяет высказать мнение о вероятной независимой неблагоприятной роли амплификации гена с-MYC при ААП, что сопряжено с обнаружением фокусов криброзной организации опухоли и явлений периневральной и лимфоваскулярной инвазии, с повышением частоты метастатического поражения. Исходя из полученных данных настоящего исследования, представляется перспективным оценить уровень амплификации гена c-MYC в случаях локализованной стадии заболевания низких градационных групп по системе Глисона и определить отсроченную клиническую динамику заболевания.

Участие авторов

Концепция и дизайн исследования — В.А. Хоржевский, Ю.В. Анжиганова

Сбор и обработка материала — В.А. Хоржевский, С.В. Гаппоев, Е.В Алымова

Статистическая обработка — В.А. Хоржевский

Написание текста — В.А. Хоржевский

Редактирование — А.К. Кириченко

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.