Рабдомиосаркомы (РМС) составляют одну из самых крупных категорий сарком мягких тканей у детей и подростков. Однако опухоли данной группы встречаются и у взрослых. На основании клинико-патологических особенностей и генетических аберраций в Классификации опухолей мягких тканей и костей Всемирной организации здравоохранения 2020 г. РМС подразделяют на 4 типа: эмбриональный, альвеолярный, веретеноклеточный/склерозирующий и плеоморфный. Каждый из описанных типов имеет отличительные гистологические и генетические особенности [1].
С момента первого описания и до настоящего времени классификация РМС не раз претерпевала качественные и количественные изменения [2]. Причем в отличие от гистологических критериев, которые изменялись не столь существенно, генетическая характеристика РМС претерпела ряд значимых изменений [1]. Так, например, в предыдущей Классификации опухолей мягких тканей и костей (2013 г.), ведущим диагностическим молекулярно-генетическим маркером в группе РМС был химерный ген PAX3/7::FOXO1, который описывался в качестве единственного патогномоничного маркера для альвеолярной РМС. Для других типов РМС молекулярно-генетическая характеристика либо включала комплексный кариотип, либо совершенно отсутствовала [3].
Впоследствии широкое распространение и доступность современных молекулярно-биологических технологий позволили пролить свет на генетику различных типов и выделить ранее не описанные варианты РМС [4]. Таким образом, в группе веретеноклеточной/склерозирующей РМС впервые были описаны рекуррентные транслокации — VGLL2::CITED2, VGLL2::NCOA2, TEAD1::NCOA2 и SRF::NCOA2 [5—9]. Группа альвеолярной РМС была дополнена редкими вариативными транслокациями PAX3::FOXO4/NCOA1/INO80D и FOXO1::FGFR1 [10—13]. К ранее неописанным вариантам (и как следствие частично включенные в классификацию опухолей мягких тканей 2020 г.) относятся эпителиоидная и веретеноклеточная внутрикостная РМС с транслокацией EWSR1/FUS::TFCP2 [14], веретеноклеточная внутрикостная РМС с транслокацией MEIS1::NCOA2 [15—17]. Помимо этого, появляется все больше статей с описанием единичных случаев РМС с редкими множественными транслокациями [16].
Особый интерес представляет группа альвеолярной РМС, поскольку в ряде случаев транслокация PAX3/7::FOXO1 сочетается с амплификацией соответствующего химерного гена. Согласно данным литературы, частота транслокации PAX3::FOXO1 составляет 70—90%, а PAX7::FOXO1 — 10—30%. При этом транслокация в сочетании с амплификацией в большей степени характерна для PAX7::FOXO1, чем для PAX3::FOXO1 (93% против 9% соответственно) [18—23]. Ряд крупных исследований [24—26] показал, что прогноз заболевания для пациентов с PAX3::FOXO1 хуже, чем для пациентов с PAX7::FOXO1. В 2023 г. в International Collaboration on Cancer Reporting (ICCR) установлены рекомендации и стандартизированный протокол для исследования РМС у детей, где одним из ключевых критериев указано определение не только статуса гена FOXO1, но и указание конкретного транслокационного партнера [27]. Поэтому исследование вариативного партнера при транслокации локуса FOXO1 может стать дополнительным стратификационным критерием для пациентов с альвеолярной РМС.
Цель данного исследования — оценка частоты встречаемости вариативных транслокаций гена FOXO1 в группе альвеолярной рабдомиосаркомы у детей.
Материал и методы
Проводился ретроспективный анализ группы пациентов, у которых за период с 2020 по 2024 г. была верифицирована альвеолярная РМС. В качестве материала были использованы гистологические образцы опухолевой ткани, заключенные в парафиновые блоки. Критериями включения считались верифицированный диагноз альвеолярной РМС, наличие гистологического материала первичной опухоли или гистологического материала опухоли с посттерапевтическими изменениями не более 1-й степени. Критериями исключения являлись отсутствие гистологического материала первичной опухоли или наличие гистологического материала опухоли с посттерапевтическими изменениями более 1-й степени, а также недостаточный для исследования объем гистологического материала опухоли.
На основании критериев включения и исключения была сформирована группа исследования из 32 образцов.
Каждый случай альвеолярной РМС исследовала группа патологоанатомов, специализирующихся на диагностике опухолей мягких тканей. Для подтверждения диагноза были проведены гистологические и иммуногистологические исследования с применением высокоспецифичных антител (Myogenin, MyoD1). Гистологическими критериями альвеолярной РМС считали наличие опухоли из мономорфных округлых клеток с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением, организованных в виде тяжей и гнезд, которые разделены фиброзными септами, и/или расположение клеточных элементов в виде солидных полей без септ (рис. 1). К иммуногистохимическим критериям альвеолярной РМС относили наличие ядерной экспрессии миогенных факторов: интенсивную диффузную экспрессию Myogenin и фокальную или диффузную экспрессию MyoD1. После этого материал подвергали цитогенетическому исследованию статуса гена FOXO1 с использованием локусспецифичного ДНК-зонда на точку разрыва FOXO1 break apart. Параллельно с этим проводили исследование химерных транскриптов PAX3-FOXO1 (COSF247) и PAX7-FOXO1 (COSF287) с использованием ПЦР в режиме реального времени.
Рис. 1. Гистологические критерии альвеолярной рабдомиосаркомы.
Опухоль представлена мономорфными округлыми клетками с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением, организованными в виде тяжей и гнезд, которые разделены фиброваскулярными септами.
Результаты и обсуждение
В результате проведенного цитогенетического исследования методом FISH с применением локусспецифичного ДНК-зонда к локусу FOXO1 был выявлен 81% (26/32) образцов с перестройкой в исследуемом локусе и 19% (7/32) без перестройки (рис.2). С помощью ПЦР в реальном времени в подгруппе с перестройкой гена FOXO1 в 58% (15/26) выявлен транслокационный партнер PAX3, а в 42% (11/26) — PAX7. В группе альвеолярных рабдомиосарком без транслокации химерных транскриптов PAX3-FOXO1 и PAX7-FOXO1 не обнаружено.
Рис. 2. Цитогенетическая неоднородность группы альвеолярной рабдомиосаркомы.
Помимо этого, были идентифицированы 4 цитогенетических паттерна, которые прослеживались в подгруппе с перестройками локуса FOXO1 (рис. 3—6). В 31% (8/26) случаев исследуемая транслокация характеризовалась стандартным распределением сигналов 1F1R1G. В 61% (16/26) случаев исследуемая транслокация сочеталась с амплификацией проксимального 3’-конца FOXO1, в таком случае распределение сигналов можно было описать как 1F1RnG. Причем амплификация подразделялась по уровню копийности на низкокопийную (n≤9 дополнительных сигналов от проксимального участка) и высококопийную (n>9 дополнительных сигналов или наличие гомогенно окрашенных регионов). В 8% (2/26) случаев была выявлена транслокация с дополнительной аберрацией в виде моноаллельной потери сигналов от дистального 5’-участка FOXO1 — 1R2G.
Рис. 3. Цитогенетический паттерн классической транслокации гена FOXO1 — 1F1R1G.
Присутствуют слитный сигнал от нормального гена и расщепленные красный и зеленый сигналы от гена, вовлеченного в транслокацию, ×1000. Локусспецифический зонд FOXO1 break-apart.
Рис. 4. Цитогенетический паттерн транслокации в сочетании с низкокопийной амплификацией проксимального участка гена FOXO1 -1F1RnG.
Стрелками указаны ядра с амплификацией. Дистальный участок гена окрашен красным цветом, проксимальный — зеленым, ×630. Локусспецифический зонд FOXO1 break-apart.
Рис. 5. Цитогенетический паттерн транслокации в сочетании с высококопийной амплификацией проксимального участка гена FOXO1 –1F1RnG.
Стрелками указаны ядра с амплификацией. Дистальный участок гена окрашен красным цветом, проксимальный — зеленым, ×630. Локусспецифический зонд FOXO1 break-apart.
Рис. 6. Цитогенетический паттерн транслокации в сочетании с дополнительной аберрацией, в данном случае делецией 5’-участка FOXO1.
Дистальный участок гена окрашен красным цветом, проксимальный — зеленым. Во всех представленных ядрах присутствует 1 красный сигнал от дистального участка гена и 2 зеленых от проксимального участка, ×1000. Локусспецифический зонд FOXO1 break-apart.
Среди случаев, где наблюдалось сочетание транслокации и амплификации, распределение транскриптов PAX3-FOXO1 и PAX7-FOXO1 оказалось 1:1.
Наличие различных цитогенетических паттернов прослеживалось и в подгруппе, где перестройка гена FOXO1 не была обнаружена. Цитогенетическое распределение сигналов варьировало от нормального диплоидного набора (2F) до гипердиплоидного с соответствующим количеством сигналов (3—6F), что может свидетельствовать о наличии числовых хромосомных аномалий.
Не менее важно и то, что в некоторых образцах строение опухоли не в полной мере отвечало гистологическим критериям, однако интенсивная диффузная экспрессия Miogenin и наличие классической транслокации PAX3::FOXO1 позволили утверждать, что опухолевый материал представляет собой альвеолярную РМС (рис. 7). В то же время присутствовали образцы с характерной для альвеолярной РМС гистологической картиной, не имеющие четкой ассоциации с транслокациями PAX3/7::FOXO1 (рис. 8, 9).
Рис. 7. Альвеолярная рабдомиосаркома с классической транслокацией PAX3::FOXO1 и неклассической гистологической картиной.
Опухолевая ткань представлена среднего размера клеточными элементами овоидной или веретеновидной формы, расположенными в коллагеновой строме.
Рис. 8. Альвеолярная рабдомиосаркома с классической гистологической картиной и отсутствием перестроек гена FOXO1.
Рис. 9. Цитогенетические паттерны в подгруппе без перестройки FOXO1.
Цитогенетическое распределение сигналов варьировало от нормального диплоидного набора (2F) до гипердиплоидного с соответствующим количеством сигналов (nF), ×630. Локусспецифический зонд FOXO1 break-apart.
Наши результаты лишь отчасти согласуются с опубликованными данными в литературе.
Так, например, полученные процентные соотношения случаев с транслокацией гена FOXO1 и случаев с ее отсутствием согласуются с многочисленными исследованиями [1]. Даже внутри группы РМС с транслокацией FOXO1 частота встречаемости вариативных партнеров укладывается в диапазоны 70—90 и 10—30% для PAX3 и PAX7 соответственно. Однако внутри группы РМС, где наблюдалось сочетание транслокации и амплификации, распределение вариативных партнеров оказалось иным. В данной группе с учетом данных литературы [18—23] мы предполагали получить преобладание транскрипта PAX7-FOXO1, распределение вариативных транскриптов оказалось равнозначным.
В 2 случаях с транслокацией и дополнительной аберрацией в виде моноаллельной потери сигналов от дистального 5’-участка FOXO1 также был определен транскрипт, им оказался PAX3-FOXO1. Причина моноаллельной делеции не была установлена в связи с отсутствием доступных и достоверных методов исследования подобного рода изменений. Вполне вероятно, что эта делеция может являться своеобразным артефактом вследствие несбалансированной транслокации, произошедшей в нестандартном участке гена FOXO1. Подобные артефакты встречаются при перестройках других генов, например MYC (8q24), и называются «несбалансированные транслокации по типу RF (red-fusion, красный слитный сигнал) или GF (green-fusion, зеленый слитный сигнал)» [28, 29].
Отсутствие цитогенетических признаков перестройки FOXO1 почти в 20% образцов может быть связано с наличием более редких вариативных транслокаций PAX3::FOXO4/NCOA1/INO80D, которые достаточно проблематично исследовать в рутинной практике. Тем не менее при соответствующей морфологии и иммунофенотипе образцы без транслокации FOXO1 верифицируются как альвеолярная рабдомисаркома [10—13]. Относительно разнообразия числа флюоресцентных сигналов от нормальных аллелей FOXO1 надо сказать, что гипердиплоидный хромосомный набор в большей степени характерен для эмбриональной и плеоморфной РМС, это никак не исключает наличия полисомии хромосомы 13 в альвеолярной РМС [30].
Заключение
С генетической точки зрения альвеолярные рабдомиосаркомы характеризуются неоднородностью и разнообразием цитогенетических паттернов. Соотношение частот встречаемости вариативных транскриптов PAX3/PAX7-FOXO1 составляет 1:1. Примерно 20% случаев альвеолярных рабдомиосарком не имеет цитогенетических признаков перестроек гена FOXO1. Отсутствие перестроек гена FOXO1 при классической гистологической картине альвеолярной рабдомиосаркомы не исключает диагноз последней, однако составляет значимый повод для продолжения поиска патогномоничных аномалий в контексте клинической значимости выделения рабдомиосарком без перестроек генов FOXO1/FOXO4/NCOA1/INO80D/FGFR1. Идентификация типа химерного гена в дальнейшем может лечь в основу стратификации групп риска и модификации терапии для данной группы пациентов.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования —Коновалов Д.М.
Сбор и обработка материала —Сидоров И.В., Шарлай А.С.
Статистическая обработка — Сидоров И.В., Шарлай А.С.
Написание текста — Коновалов Д.М., Сидоров И.В., Шарлай А.С.
Редактирование — Коновалов Д.М.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.