Иммунный статус эндометрия у пациенток с аномальным маточным кровотечением, ассоциированным с хроническим эндометритом

На протяжении нескольких десятилетий хронический эндометрит (ХЭ) является актуальной проблемой акушерства и гинекологии, а также репродуктологии ввиду его негативного влияния на качество жизни пациенток. По сравнению с другими слизистыми оболочками иммунная система эндометрия совершенно уникальна, поскольку она сочетает сильную иммунную защиту от патогенов с толерантностью к плоду. Эндометрий вне беременности содержит значительное количество лимфоцитов, представленных в основном Т-клетками (6—60%) и NK-клетками (25—85%), которое постоянно изменяется в течение менструального цикла. Известно, что нарушение иммунного статуса эндометрия или децидуальной оболочки тесно связано с бесплодием, невынашиванием беременности и другими осложнениями беременности [1]. На основании современных научных и клинических данных ведущим звеном в развитии и прогрессировании воспалительного процесса в эндометрии является восходящая инсеминация через эндоцервикс патогенной микробиоты и микробов-комменсалов [2]. Стоит отметить, что основным звеном в патогенезе ХЭ служит локальный фактор нарушения иммунитета [3]. Несмотря на вышесказанное, до сих пор отсутствуют данные о сравнительном анализе локального иммунного статуса у пациенток с аномальным маточным кровотечением (АМК), ассоциированным с хроническим воспалением эндометрия различной степени выраженности.

В ретроспективное клинико-морфологическое исследование включено 95 пациенток репродуктивного возраста (от 21 года до 40 лет). В основную группу (n=60) вошли женщины с АМК и ХЭ. Средняя длительность маточного кровотечения составила 2,5±0,5 года. В ходе нашего исследования были исключены пациентки, имеющие в анамнезе патологию эндометрия, такую как полипы и гиперплазия эндометрия, субмукозные миомы, аденомиоз и наружный эндометриоз, онкологические заболевания репродуктивных органов, инфекции, передающиеся половым путем, вызванные Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, ВИЧ, вирусами гепатита B и C.

В группу сравнения (n=35) были отобраны женщины, проходившие диагностику перед программой суррогатного материнства, не имевшие в анамнезе аномальных маточных кровотечений и хронического эндометрита. Лечение проводилось в гинекологическом отделении клиники ООО «Лечебный центр». Все женщины, вошедшие в данное исследование, дали письменное информированное согласие, протокол одобрен этическим комитетом ФГБНУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского».

Забор диагностического материала осуществляли в среднюю стадию фазы пролиферации 28-дневного менструального цикла (7—11-й день) путем пайпель-биопсии эндометрия.

Проводили стандартную гистологическую обработку материала и гистохимическое окрашивание по Маллори, далее полученные гистологические препараты изучали под световым бинокулярным микроскопом DLMB с цифровой камерой и анализатором изображения Leica DM 2500 (Leica Microsystems, Германия). ИГХ-исследование выполняли с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена. ИГХ-окрашивание проводили в иммуностейнере Ventana BenchMark ULTRA IHC/ISH (США) на парафиновых срезах по стандартной методике с использованием антител Roche/Ventana CONFIRM^TM anti-CD4 (SP35) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (Ready-To-Use), Roche/Ventana CONFIRM^TM anti-CD8 (SP57) Rabbit Monoclonal Primary Antibody (Ready-To-Use), Roche/Ventana CONFIRM^TM anti-CD20 (L26) Primary Antibody (Ready-To-Use), CELL MARQUE CD45R (MB1) Mouse Monoclonal Antibody (Ready-To-Use), CELL MARQUE CD56 (MRQ-42) Rabbit Monoclonal Antibody (Ready-To-Use), CELL MARQUE CD138/syndecan-1 (B-A38) Mouse Monoclonal Antibody (Ready-To-Use).

На основании клинико-анамнестических данных, а также проведенного патоморфологического, гистохимического и ИГХ-исследований пациентки основной группы были ранжированы на 3 подгруппы, в каждую из которых вошли по 20 пациенток. Оценку морфологических параметров осуществляли при увеличении в 400 раз с анализом 20 полей зрения в каждом препарате, положительным результатом считали наличие признака в 5 полях зрения.

Степень выраженности ХЭ (рис.1) оценивали следующим образом:

Рис 1. Иммуногистохимическое исследование с антителом к CD138.

а — отсутствие экспрессии CD138 в группе сравнения. Положительная экспрессия CD138 в биоптатах исследуемых подгрупп: б — слабовыраженный ХЭ; в — умеренно выраженный ХЭ; г — выраженный ХЭ; а — ув. ×200; б—г — ув. ×400.

— при выявлении одной CD138+ клетки — слабовыраженный хронический эндометрит (СХЭ);

— при выявлении от двух до трех CD138+ клеток — умеренно выраженный хронический эндометрит (УХЭ);

— при выявлении четырех и более CD138+ клеток — выраженный хронический эндометрит (ВХЭ).

Фиброз оценивали по наличию синего окрашивания на препаратах с окраской по Маллори. В результате фиброз стромы эндометрия диагностирован у 11 (55,5%) пациенток со СХЭ, у 8 (37,5%) с УХЭ и у 12 (61%) с ВХЭ.

В каждой группе проводили подсчет уровня экспрессии маркеров местного иммунитета у пациенток с АМК. Полученные данные при морфометрическом исследовании обрабатывали стандартными статистическими методами с помощью программы Statistica 10 for Windows (Stat Soft, США). Для оценки нормальности распределения данных каждой группы использовали критерии Колмогорова—Смирнова и Шапиро—Уилка. Количественные признаки представлены в виде медианы (Me) и верхнего и нижнего квартилей (Q1, Q3). Для анализа количественных признаков применяли U-критерий Манна—Уитни. Критический уровень значимости составил p<0,02.

Средний возраст пациенток основной группы и группы сравнения достоверно не отличался: СХЭ (n=20) — 36,4±6,8 года, УХЭ (n=20) — 34,3±7,1 года, ВХЭ (n=20) — 34,4±8,1 года, группа сравнения (n=35) — 35,3±6,7 года. Особенности менструальной функции исследуемых пациенток представлены в табл. 1.

Таблица 1. Изменение менструальной функции в основной группе и в группе сравнения

На следующем этапе нашего исследования провели оценку иммунного статуса с подсчетом числа клеток CD4+, CD8+, CD20+, CD56+. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2. Уровень экспрессии маркеров местного иммунитета у пациенток с аномальным маточным кровотечением, ассоциированным с хроническим эндометритом, Me (Q1; Q3)

Примечание. Здесь и в табл. 3: * — различия между изучаемыми параметрами статистически достоверны (p≤0,02); кл/п.з. — клетки в поле зрения.

Морфологическим признаком, свидетельствующим об изменении в иммунном статусе у пациенток с АМК в анамнезе, ассоциированным с ХЭ, является достоверное (p<0,02) повышение числа лимфоцитов с экспрессией маркеров CD4, CD8, CD20, CD56 (рис. 2—5), прямо пропорциональное степени выраженности ХЭ (рис. 6).

Рис. 2. Иммуногистохимическое исследование с антителом к CD4.

а — нормальная экспрессия CD4 у пациенток группы сравнения. Повышение экспрессии CD4 в биоптатах исследуемых подгрупп: б — слабовыраженный ХЭ; в — умеренно выраженный ХЭ; г — выраженный ХЭ; а—г — ув. ×400.

Рис. 3. Иммуногистохимическое исследование с антителом к CD8.

а — нормальная экспрессия CD8 у пациенток группы сравнения. Повышение экспрессии CD8 в биоптатах исследуемых подгрупп: б — слабовыраженный ХЭ; в — умеренно выраженный ХЭ; г — выраженный ХЭ. Имуногистохимическая реакция, а — г — ув. ×400.

Рис. 4. Иммуногистохимическое исследование с антителом к CD20.

а — нормальная экспрессия CD20 у пациенток группы сравнения. Повышение экспрессии CD20 в биоптатах исследуемых подгрупп: б — слабовыраженный ХЭ; в — умеренно выраженный ХЭ; г — выраженный ХЭ; а—г — ув. ×400.

Рис. 5. Иммуногистохимическое исследование с антителом к CD56.

а — нормальная экспрессия CD56 у пациенток группы сравнения. Повышение экспрессии CD56 в биоптатах исследуемых подгрупп: б — слабовыраженный ХЭ; в — умеренно выраженный ХЭ; г — выраженный ХЭ; а—г — ув. ×400.

Рис. 6. Характеристика экспрессии маркеров.

а — CD4; б — CD8; в — CD20; г — CD56.

Для оценки нарушения клеточного иммунитета также было проведено вычисление соотношения CD4+/CD8+ лимфоцитов, снижение которого менее <1,5 говорит о наличии иммунного дисбаланса (патент №RU 2820619). В ходе нашего исследования выявлены значимые (p<0,02) по отношению к группе сравнения различия между показателями соотношения CD4+/CD8+ лимфоцитов у пациенток исследуемых подгрупп основной группы (табл. 3), которые свидетельствуют о нарушении иммунного статуса у пациенток с хроническим воспалением.

Таблица 3. Соотношение CD4+/CD8+ лимфоцитов у пациенток с аномальным маточным кровотечением, ассоциированным с хроническим эндометритом, Me (Q1; Q3)

В условиях хронического воспаления в эндометрии в среднюю стадию фазы пролиферации установлены статистически значимые различия у пациенток исследуемых групп. Так, выявлено достоверное (p<0,02) увеличение числа лимфоцитов, экспрессирующих CD4+, CD8+, CD20+ и CD56+, по отношению к группе сравнения. Учитывая полученные результаты, следует сделать вывод: у пациенток с ХЭ статистически значимо нарушается баланс клеток иммунной системы по сравнению с женщинами без ХЭ (p<0,02), выражающийся в увеличении содержания T-лимфоцитов (CD4+ и CD8+), B-лимфоцитов (CD20+) и NK-клеток (CD56+) пропорционально степени выраженности ХЭ. Наши данные коррелируют с исследованием C. Iweha и соавт. [4], в котором было выявлено повышение числа CD56+ клеток, а также CD8+ клеток у женщин с АМК в анамнезе, а также с исследованием Jw. Li и соавт. [5], в котором повышение количества CD20+ клеток было пропорционально степени выраженности ХЭ. На основании актуальных данных литературы, при хроническом персистирующем воспалении эндометрия наблюдается тенденция к уменьшению выработки интерлейкина 11, который активизирует децидуализацию стромальных клеток эндометриальной ткани. Более того, происходит снижение синтеза хемокинов, рекрутирующих из плазмы натуральные клетки-киллеры (NK-клетки). Эти клетки инициируют васкулоэндотелиальный фактор роста (VEGF), который является основополагающим показателем формирования спиральных артерий слизистой оболочки полости матки [6]. Цитокины активизируют рост капиллярной сети, контролируют дифференцировку и пролиферацию эндотелия [3]. Таким образом, активация эндотелиальных факторов роста провоцирует гиперпролиферацию эндотелиальных клеток и нарушает структуру спиральных артерий. Результат вышеописанных процессов — аномальное маточное кровотечение. Известно, что повышенное количество клеток CD56+ в железисто-стромальном компартменте наблюдается при интенсификации персистирующего воспалительного процесса в ткани [8]. Кроме того, мы провели анализ соотношения CD4+/CD8+ лимфоцитов, где снижение этого показателя менее 1,5 указывает на наличие дисбаланса местного иммунитета (патент №RU 2820619). В нашем исследовании зафиксировали значимые различия (p<0,02) в показателях иммунного статуса между группами, что подтверждает наличие нарушений у пациенток с ХЭ. Известно, что снижение иммунорегуляторного показателя CD4+/CD8+ возникает при различных хронических инфекциях [9]. Клетки иммунной системы эндометрия играют ключевую роль в поддержании гомеостаза и нормального функционирования репродуктивной системы. Их количество и соотношение изменяются в течение менструального цикла и беременности, выполняя важные функции, связанные с имплантацией эмбриона, а также разрушением функционального слоя эндометрия во время менструации в отсутствие имплантации.

Проведенное исследование выявило нарушение иммунного статуса у пациенток с ХЭ и АМК в анамнезе. Установлено достоверное (p<0,02) повышение числа клеток, экспрессирующих CD4, CD8, CD20, CD56, а также нарушение клеточного иммунитета, выражающееся в виде отношения CD4+/CD8+ лимфоцитов, прямо пропорционального степени выраженности ХЭ. Баланс клеток локальной иммунной системы эндометрия играет существенную роль в координировании менструального цикла и репродуктивной деятельности. Местный иммунный дисбаланс, вероятно, служит одним из основных патогенетических факторов формирования функциональной несостоятельности эндометрия, следствием которого является нарушение менструальной функции женщины.

Участие авторов

Концепция и дизайн исследования — Михалева Л.М., Оразов М.Р., Радзинский В.Е.

Сбор и обработка материала — Митрелис Р.Ю., Михалев С.А., Вандышева Р.А., Кобызева Т.Ю., Хомская Е.Г.

Написание текста — Митрелис Р.Ю., Масалимова Д.Н.

Редактирование — Михалева Л.М., Оразов М.Р., Радзинский В.Е.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.