Иммунофенотипическая характеристика тучных клеток в неметастатической семиноме

Герминогенные опухоли (ГО) занимают малую долю среди злокачественных новообразований у мужчин, частота их встречаемости приближается к 2%, средний возраст пациентов 35 лет [1]. Количество ГО в России составляет около 1480 случаев в год, половина из которых приходится на семиному [2]. Выживаемость пациентов при семиноме достигает 99%. Согласно pTNM-системе, в семиномах выделяют IA, IB, IS, IIA, IIB, IIC, IIIA, IIIB, IIIC стадии опухолевого роста, дополнительное стадирование проводят по уровням ХГЧ, АФП и ЛДГ [3]. Лечение семиномы включает хирургическое вмешательство, адъювантную химиотерапию, а также облучение лимфатических узлов при наличии метастазов [4—7].

Несмотря на то что описан гистологический, молекулярно-биологический и молекулярно-генетический статус семиномы, по-прежнему малоизученным остается взаимодействие опухолевой ткани и ее микроокружения (tumor microenvironment, TME), учитывая, что инфильтрация иммунными клетками является одной из черт, отличающих ее от других ГО.

Патоморфологические изменения в иммунном ландшафте семиномы: взаимодействие тучных клеток, T-, B-лимфоцитов и макрофагов с атипичными сперматогенными клетками и другими соматическими клетками, возможно, придает определенную уникальность семиноме, а их количество соответствует стадии опухолевого роста и обеспечивает взаимодействие с рецепторами PD-1 и PD-L1 [8]. Не менее актуальным остается вопрос о резистентности элементов семиномы к иммуно- и виротерапии [9].

Изучение регуляторного потенциала тучных клеток как элементов локального тканевого микроокружения (ЛТМ) в семиноме играет безусловную роль в канцерогенезе. Известно, что изменение численности тучных клеток в первичных опухолях различной локализации определяет неблагоприятный прогноз [10, 11]. Поэтому не исключено, что уменьшение их количества в семиноме в зависимости от ее стадии также носит прогностическое значение.

Взаимоотношение с атипичными клетками напрямую зависит от типа тучных клеток, который определяется их химическим составом.

Таким образом, учитывая, что тучные клетки обеспечивают поддержание иммунного статуса и гомеостаза нормального яичка, они могут выступать в качестве регулятора опухолевого роста, способствуя опухолевому росту. Данная гипотеза требует дальнейшего детального исследования с применением современных методов молекулярной биологии [12].

Цель исследования — иммунофенотипический анализ тучных клеток в неметастатической семиноме.

Согласно анамнестическим и клинико-морфологическим данным, были сформированы следующие группы:

— 1-я группа (n=73; возраст 20—53 года) — архивные парафиновые блоки операционного материала семиномы после орхифуникулэктомии, согласно pTNM-классификации: 1a подгруппа — T1N0M0 (n=31); 1б подгруппа — T2N0M0 (n=42);

— 2-я группа — сравнение (n=21, возраст 20—53 года) — аутопсийный материал интактных яичек, полученный в течение 6 ч после констатации биологической смерти. Проявлений онкологического процесса и/или воспаления, наблюдаемых макроскопически, не отмечено. В семейном анамнезе один ребенок и более. Причины смерти: язва желудка с прободением и/или кровотечением, обструктивный пиелонефрит, панкреатит, аневризмы различной локализации, врожденные пороки развития, но не мочевыделительной и/или репродуктивной системы, летальные травмы.

Фрагменты яичек / семиномы фиксировали в растворе забуференного формалина, дегидратировали, проводили и заливали в парафин. Для выявления тучных клеток использовали окрашивание толуидиновым синим, а для иммунофенотипирования гранул — иммуногистохимические реакции с антителами к триптазе, химазе, карбоксипептидазе.

Тучные клетки крупные, овально-округлой вытянутой формы, цитоплазма слабо базофильная с обилием темно-базофильных гранул (гистамин, гепарин, серотонин, хондриатинсерные кислоты, гиалуроновая кислота и др.); ядро компактное с грубыми глыбками хроматина. На основании содержания биологически активных веществ принято выделять серозные и мукозные тучные клетки.

Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартному протоколу, согласно рекомендациям производителя. Первичные антитела к Tryptase (Abcam; ab2378, 1:10000), Chymase (Abcam; ab2377, 1:10000), CPA3 (Abcam; ab251696, 1:10000); вторичные — универсальные антитела (HiDef Detection™ HRP Polymer system, «Cell Marque», США).

Морфометрическое исследование проводили после сканирования гистологических срезов на сканере Leica Aperio AT2. Количество иммунопозитивных клеток определяли в абсолютном значении (на единицу площади, мм²) с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом для анализа изображений цифровой патологии QuPath V.5.1. [13].

Для анализа пространственного распределения клеточных популяций были экспортированы координаты иммунопозитивных и иммунонегативных клеток с последующей визуализацией в Microsoft Excel 2024. Используя инструмент «точечная диаграмма», проведено картирование распределения клеток: иммунонегативные клетки представлены зелеными точками, иммунопозитивные клетки — оранжевыми. Точки были точно позиционированы в соответствии с их координатами по осям X и Y, что позволило провести количественный анализ пространственного распределения исследуемых клеточных популяций.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ SPSS 12.0 (IBM Analytics, США). Нормальность распределения количественных данных в изучаемой выборке оценивали с помощью критерия Шапиро—Уилка. Распределение считали нормальным при p>0,05. Поскольку данные не соответствовали нормальному распределению, количественные групповые результаты сравнивали, используя непараметрический критерий Манна—Уитни (U-тест). Данные в таблицах представлены в виде M±m, где M — среднее арифметическое, m — стандартная ошибка среднего, а также в виде медианы и межквартильного интервала (Me [Q1—Q3]), при этом уровень статистической значимости значения p<0,05.

В образцах яичек пациентов 1-й группы (n=73; 100%) выявили ГО дольчатого строения с тотальной герминальной аплазией. Большинство атипичных клеток со светлой цитоплазмой и четкими границами, ядра многоугольные с одним или несколькими ядрышками. Стромальный компонент представлен волокнистой соединительной тканью, формирующей перегородки. В опухоли и паратуморальной ткани обнаруживали умеренную клеточную воспалительную инфильтрацию: скопление лимфоцитов, плазмоцитов и других иммунокомпетентных клеток. Кроме того, наблюдали межклеточный отек, наличие микрокист и очагов коагуляционного некроза особенно в белочной оболочке, где также присутствовала воспалительная инфильтрация.

В микропрепаратах 1a подгруппы визуализировалась морфологическая картина семиномы pT1-стадии (рис. 1, а), опухоль ограничивалась яичком и его сетью без сосудистой или лимфатической инвазии, местами у некоторых пациентов она прорастала в белочную (n=14; 45,2%), но не во влагалищную оболочку. Семинома в подгруппе 1б (рис. 1, б) характеризовалась наличием сосудистой или лимфатической инвазии, прорастанием в белочную (tunica albuginea) и влагалищную (tunica vaginalis) оболочки яичка.

Рис. 1. Тучные клетки в семиноме и нормальном яичке.

а , г — семинома pT1 стадии; б , д — семинома pT2 стадии; в , е — нормальное яичко; а — в — окраска гематоксилином и эозином, ×200; г — е — окраска толуидиновым синим, ×400.

В образцах интактных яичек (2-я группа) выявлялась нормальная гистоархитектоника с физиологическим сперматогенезом и единичными иммунными клетками (рис. 1, в).

При окраске толуидиновым синим в образцах семиномы 1a подгруппы определялось умеренное количество тучных клеток с интенсивной темно-фиолетовой метахромазией без признаков дегрануляции (рис. 1, г). В семиноме 1б подгруппы (pT2) медианное значение окрашенных клеток было в 8,07 раза меньше (p=0,001). Однако единичные тучные клетки располагались в неопухолевой части яичка (рис. 1, д). В группе сравнения тучные клетки располагались в межканальцевых пространствах (рис. 1, е) и белочной оболочке.

Экспрессия сериновых протеаз, специфичных для тучных клеток ферментов триптазы и химазы, обладающих трипсино- и химотрипсиноподобными свойствами, была вариабельной в зависимости от стадии опухолевого роста и степени инвазии. Аналогичная иммуногистохимическая картина наблюдалась в случае специфической протеазы секретома тучных клеток карбоксипептидазы А3 (СРА3).

Результаты иммуногистохимического исследования представлены на рис. 2, 3, а количественная характеристика маркеров тучных клеток — в таблице.

Рис. 2. Результаты иммуногистохимического исследования семиномы и нормального яичка.

Иммуногистохимические реакции с антителами к: а—в — Tryptase; г—е — Chymase; ж—и — CPA3, ×400.

Рис. 3. Картирование семиномы.

Иммуногистохимическое исследование с антителами к Tryptase. Слева — гистоскан; справа — точечная диаграмма, отображающая распределение триптаза-позитивных тучных клеток в гистоскане (оранжевые точки — триптаза-позитивные клетки; зеленые — триптаза-негативные).

Количественная характеристика маркеров тучных клеток в семиноме и интактном яичке на 1мм²

Примечание. * — pT2 по сравнению с pT1.

В соответствии с химическим составом секреторных гранул, содержащих данные ферменты, проводили фенотипирование тучных клеток: серозные (триптаза+, химаза+) и мукозные (триптаза+, химаза-).

Медианные значения Tryptase- и Chymase-позитивных тучных клеток, выявленных в семиноме pT2, в 7,30 раза (p=0,002) и 10,43 раза (p=0,001) меньше, чем в pT1 соответственно.

В то же время Tryptase- и Chymase-позитивные клетки определяли в белочной оболочке яичка («внутренний контроль») как и в образцах группы сравнения (с физиологическим сперматогенезом).

Иммуногистохимический анализ выявил снижение уровня экспрессии CPA3, в семиноме pT2 стадии медианные значения в 4,29 раза меньше (p=0,010), чем при pT1 стадии.

Некоторые тучные клетки наблюдали в межканальцевых пространствах яичек с физиологическим сперматогенезом (2-я группа) в основном вокруг кровеносных сосудов.

Данное исследование посвящено количественному и качественному анализу тучных клеток, учитывая их иммунофенотипические особенности (наличие специфических протеаз — триптазы, химазы и CPA3), в семиноме pT1 и pT2 стадий.

В антенатальном периоде предшественниками тучных клеток, находящихся в желточном мешке, в основном экспрессируют мембранный CD34+, а в постнатальном развитии они дифференцируются, в начале в красном костном мозге, теряя тирозинкиназные рецепторы, и окончательно созревают непосредственно в органах-мишенях, располагаясь преимущественно по ходу кровеносных сосудов и нервных волокон, элементов соединительной ткани. Зрелые формы способны продуцировать триптазу, химазу и карбоксипептидазу — специфические маркеры тучных клеток. Они являются регуляторами иммунных процессов, прежде всего реакций гиперчувствительности. Им принадлежит лидирующая роль в развитии большинства аутоиммунных заболеваний, острого и хронического воспаления [14 — 16].

В то же время вопрос об участии тучных клеток в прогрессии злокачественных опухолей остается дискутабельным.

В некоторых карциномах (меланоцитарные опухоли, рак молочной железы, плоскоклеточный рак пищевода, колоректальный рак, аденокарцинома легких и др.) количество тучных клеток увеличивается уже на ранних стадиях, демонстрируя их парадоксальное участие в прогрессировании опухоли за счет продукции ряда биологически активных веществ, в том числе проангиогенных и митогенных факторов (VEGF, PDGF, FGF-2, MMP-9, IL-6, TNF-α, Cox2, i-NOS и CCL2). Также тучные клетки оказывают иммуносупрессивное действие. В других злокачественных новообразованиях (рак шейки матки, ацинарная аденокарцинома предстательной железы) доля тучных клеток ниже [17, 18].

При этом количественные и качественные данные о тучных клетках в семиноме, в том числе учитывающие стадию опухолевого роста, отсутствуют. Однако мы не исключаем, что тучные клетки также можно рассматривать в качестве одного из градирующих факторов в семиноме.

На ранних стадиях семиномы во всех изучаемых образцах опухоли тучные клетки визуализировались как в самой опухоли, так и в перитуморальной зоне, но их количество варьировало в зависимости от стадии.

Разницу в окрашивании при гистохимических реакциях можно объяснить различным химическим составом гранул тучных клеток, в связи с чем принято выделять серозные и мукозные типы тучных клеток. Мукозные тучные клетки — это, как правило, зрелые формы, которые в большом количестве располагаются в прослойках рыхлой волокнистой соединительной ткани и активно продуцируют гепарин, соединяющийся при гистохимическом окрашивании с толуидиновым синим, проявляя свойства метахромазии [19].

На основании проведенных гистохимических реакций, подтвержденных иммуногистохимическим исследованием, в семиноме преобладают зрелые тучные клетки, при этом их количество обратно пропорционально pTNM-стадии.

При иммунофенотипической оценке тучных клеток мы также наблюдали снижение экспрессии специфических протеаз, особенно триптазы, в зависимости от pTNM-стадии семиномы. По химическому составу секреторных гранул выделяют два основных типа тучных клеток: ТК_(T) и (Mast cells_Tryptase) и ТК_(TX) (Mast cells_{Tryptase-Chymase}). Секреторные гранулы первых богаты триптазой и играют ключевую роль в иммунных реакциях. У вторых гранулы содержат триптазу вместе с химазой и карбоксипептидазой, участвующих в основном в регенеративных процессах.

Триптаза — это нейтральная сериновая протеаза, являющаяся одним из ключевых компонентов секретома тучных клеток, гранулы которых у человека содержат α- и β-изоформы, кодируемые генами TPSAB1, TPSAB1, TPSB2, TPSD1, TPSG1, PRSS22.

По мнению ряда авторов, для некоторых злокачественных опухолей (например, рак молочной железы, аденокарцинома легкого, B-клеточная неходжкинская лимфома и др.) характерно увеличение триптаза-позитивных тучных клеток, инициирующих ангиогенез и как следствие — опухолевый рост, что указывает на их прямо пропорциональную связь между агрессивностью опухоли и неблагоприятным прогнозом [20—22]. Кроме того, триптаза способствует деградации внеклеточного матрикса и фибриногена, активации латентной коллагеназы и матричных металлопротеиназ. Также показано, что триптаза оказывает прямое влияние на пролиферацию и внутриклеточную сигнализацию в атипичных клетках колоректальной аденокарциномы за счет стимуляции протеазного активированного рецептора-2 (ПАР-2, PAR-2).

Обнаруженное снижение прежде всего доли триптаза-позитивных гранул тучных клеток скорее всего объясняется особенностью местных иммунологических реакций и их взаимодействия с элементами гематотестикулярного барьера. В семиноме активация фактора смерти — Fas-L и аутоиммунных реакций в результате опухолевой трансформации сперматогенных клеток приводит к усилению фагоцитирующих свойств клеток Сертоли, которые максимально утилизируют в том числе и тучные клетки. Как следствие — рост опухоли усиливает описанные локальные иммунные реакции, что приводит к уменьшению доли тучных клеток. Полученные данные в большей части не противоречат выводам некоторых авторов относительно других первичных опухолей.

Химаза — это мономерная эндопептидаза, обладающая химотрипсин-подобной специфичностью. Данная сериновая протеаза также содержит a- и β-изоформы, влияющие на преобразование ангиотензина I в ангиотензин II. В некоторых экспериментальных работах [23, 24] с использованием химостатина (ингибитор химазы) выявили уменьшение уровня ангиотензина II, что коррелировало со снижением доли кровеносных сосудов. Напротив, использование активатора тучных клеток способствовало увеличению активности химазы и VEGF и как следствие повышенному ангиогенезу [25].

Не менее важной специфической протеазой, входящей в состав секретома тучных клеток, является карбоксипептидаза А3 (СРА3), которая принимает участие в регуляции иммунных реакций и механизмах ангиогенеза [26].

Таким образом, на нашей выборке показано, что уменьшение количества тучных клеток, а также снижение продукции Tryptase-, Chymase- и CPA3-гранул коррелирует со стадией семиномы. Качественную и количественную характеристику тучных клеток можно использовать как прогностический маркер ее стадии. Для более детального анализа необходимо проведение дополнительных исследований с использованием в том числе метода мультиплексной иммуногистохимии с флюоресцентной микроскопией.

Иммунофенотипическое распределение гранул секретома указывает на уменьшение количества Tryptase-, Chymase- и CPA3-тучных клеток, которое обратно пропорционально pT-стадии неметастатической семиномы.

Коллектив авторов выражает благодарность директору НОРЦ «Инновационных технологий иммунофенотипирования, цифрового пространственного профилирования и ультраструктурного анализа (Молекулярной морфологии) ФГАОУ ВО РУДН им. П. Лумумбы, д.м.н., доц. Д.А. Атякшину.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Шегай П.В., Каприн А.Д., Демяшкин Г.А.

Сбор и обработка материала — Крашенинников А.А., Щекин В.И., Волченко Н.Н.

Статистическая обработка — Щекин В.И.

Написание текста — Щекин В.И., Демяшкин Г.А.

Редактирование — Демяшкин Г.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.