Введение

Колоректальная аденокарцинома (КРА) — одна из часто выявляемых злокачественных опухолей, в 2020 г. вышла на третье место в структуре онкологической заболеваемости в мире [1]. Согласно данным ежегодного отчета Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена филиала ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии», в 2018 г. КРА заняла четвертое место в структуре онкологической заболеваемости в России и выявлена в среднем у 29 человек на 100 тыс. населения с незначительным преобладанием у женщин [2]. Несмотря на активное внедрение программ профилактики и скрининга, среднегодовой темп прироста КРА демонстрирует одно из самых больших значений (2,86%) среди злокачественных новообразований [2]. Таким образом, поиск дополнительных методов ранней диагностики КРА остается актуальной задачей современной онкологии.

Ректороманоскопия и колоноскопия с биопсией по-прежнему остаются «золотыми стандартами» диагностики КРА. В последние годы активно исследуется возможность применения биосенсоров (БС) в диагностике злокачественных опухолей. БС — это устройства, которые позволяют выявить различные химические вещества в биохимических реакциях с вовлечением ферментов, антител и антигенов, субклеточных структур и отдельных клеток, тканей с помощью оптических, термических или электрических сигналов. Избирательность и высокая чувствительность БС в отношении исследуемого материала, портативность и невысокая стоимость, миниатюризация создают перспективы для широкого применения инвазивных и неинвазивных БС в повседневной клинической практике [3]. Признаки морфологического атипизма по-прежнему составляют основу для оценки степени злокачественности (grade) опухолей. Представляет интерес оценка маркеров функционального атипизма КРА с применением БС; одним из таких маркеров может служить щелочная фосфатаза (ЩФ). Кишечная изоформа этого фермента является маркером дифференцировки эпителия кишечника. Ранее показано что максимальная активность фермента выявляется лишь в высокодифференцированных клетках кишечного эпителия. В экспериментах на культурах клеток показано, что во многих низкодифференцированных клеточных линиях КРА уровень экспрессии ЩФ чрезвычайно низок, а активность фермента <0,0001 ед/мг белка, в то время как в дифференцированных колоноцитах активность может составлять >0,7 ед/мг белка [4].

Цель исследования — оценить эффективность электрохимического (хроноамперометрического) метода исследования с применением БС для оценки активности ЩФ как маркера функционального атипизма в биоптатах КРА.

Материал и методы

Проведена оценка материала от 78 пациентов, проходивших эндоскопическое исследование ободочной кишки. У каждого пациента забраны фрагменты опухоли и слизистой оболочки ободочной кишки (на расстоянии не менее 10 см от опухолевого узла) для оценки с помощью электрохимического метода с использованием БС. После электрохимического исследования проведено гистологическое и иммуногистохимическое исследование биоптатов (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика групп обследованных пациентов

Биоптаты, полученные от 48 пациентов, хранили в фосфатном буфере (ФБ), от 30 пациентов — в 10% нейтральном забуференном формалине в пробирках Эппендорфа при комнатной температуре не более 2 ч. За 30 мин до эксперимента все биотаты раздельно укладывали в лунки стерильного пластикового планшета для иммуноферментного анализа, содержащие 200 мкл ФБ в каждой лунке, затем трижды промывали путем перенесения из одной лунки в другую лунку, помещали в термостат с температурой 37 °C на 1 ч.

Электрохимическое исследование проводили с использованием восьмиканального высокочувствительного потенциостата Palm Sens, мультиплексора, устройства для непрерывного перемешивания, устройства автономного питания РИП-24, набора БС. БС представляли из себя классические миниатюризированные трехэлектродные ячейки. Каждый БС изготовлен из очищенной кремниевой пластины, на которую методом трафаретной печати наносили электроды на основе хрома, золота и солей серебра: рабочий электрод, противоэлектрод и электрод сравнения. К каждой кремниевой пластине с помощью эпоксидного клея приклеивали пластиковые цилиндрические камеры (лунки) объемом 300 мкл, ограничивая зону трех электродов.

Для выявления ЩФ в тканях биоптатов использовали специфический субстрат 1-нафтил фосфат (производство «Sigma Aldrich», Великобритания, CAS No. 1136-89-6). Биоптаты раздельно помещали в лунки БС, каждая из которых содержала 270 мкл рабочего буфера. БС устанавливали в отсеки перемешивающего устройства. Все электроды соединялись восьмиканальным мультиплексором и работали в непрерывном режиме в условиях перемешивания с подачей воздуха по пипеткам перемешивающего устройства. Мультиплексор соединяли с перемешивающим устройством и потенциостатом. Потенциал относительно хлорсеребряного электрода сравнения был равен 300 мВ, интервал времени измерения составлял 1 с. Каждый эксперимент проводился на протяжении 33 мин. Химическая реакция между ЩФ и 1-нафтил-фосфатом вызывала выделение веществ (1-нафтола и др.), обладающих электрохимической активностью, т.е. при постоянном напряжении генерирующих электрический ток. Результаты электрохимического исследования оценивали по хроноамперометрограмме. По силе тока, получаемой в ходе эксперимента, судили о количестве выделяемых продуктов реакции, и, следовательно, об активности исследуемой ЩФ.

Исследованные биоптаты оценивали с помощью гистологического метода с окраской гематоксилином и эозином стандартным способом. Проводили также иммуногистохимическое исследование биоптатов и операционного материала с антителами к ЩФ. Для оценки экспрессии ЩФ использовали парафиновые срезы толщиной 5 мкм, нанесенные на адгезивные стекла («Dako») и инкубированные с кроличьими моноклональными антителами к ЩФ («Abcam», Великобритания, # ab65834). Хромогеном служил диаминобензидин. Для восстановления антигенной активности гистологические срезы обрабатывали в специализированном миниавтоклаве Retrivale-2100 при температуре 120 °C в течение 20 мин с последующим охлаждением в течение 2 ч. Время инкубации срезов с антителами при температуре 20 °C составляло 60 мин. После проведения реакции срезы докрашивали гематоксилином. Экспрессия ЩФ проявлялась в виде коричневого окрашивания структур клеток. Интенсивность экспрессии ЩФ оценивали как слабую, умеренную и выраженную, очаговую и диффузную. Сравнивали результаты электрохимического и морфологического исследований.

Статистическая обработка полученных данных проведена на ПК с использованием программы Microsoft Office Excel («Microsoft», 2016), авторского (В.С. Шелудько, 2001—2016) пакета прикладных электронных таблиц (ППЭТ) Stat2015 [5]. При представлении меры центральной тенденции и ее доверительного интервала (ДИ) и при оценке статистической значимости различий (p) количественных переменных предварительно исследовали нормальность распределения каждой выборки с помощью критерия Колмогорова—Смирнова. При нормальном распределении выборок описательная статистика представлена средней и 95% ДИ, статистическую значимость различий оценивали соответствующими критериями Стьюдента для независимых и зависимых выборок. При ненормальном распределении количественных переменных мера центральной тенденции и ее ДИ представлены медианой, 25% и 75% квартилями, статистическая значимость различий при ненормальном распределении хотя бы одной из сравниваемых выборок оценивалась с помощью критерия U Манна—Уитни для независимых выборок и критерия W Вилкоксона для зависимых выборок.

Качественные данные представлены в виде количества значений n и процентной доли, статистическая значимость различий качественных переменных оценивалась с помощью критерия χ².

Различия считались статистически значимыми при уровне значимости p<0,05.

Результаты и обсуждение

На основании анализа результатов гистологического и электрохимического исследований все пациенты разделены на две группы. В 1-ю группу вошли пациенты, у которых результаты электрохимического и гистологического исследований коррелировали между собой. Группа 2-я представлена пациентами, материал которых (частично или полностью) содержал ткани, не являющиеся опухолью или слизистой оболочкой.

В материале от пациентов 1-й группы ввиду высокой активности ЩФ в биоптатах слизистой оболочки ободочной кишки регистрировали силу тока, которая была в выше 2,4 раза (нефиксированный материал) и в 1,8 раза (материал, фиксированный в формалине), чем при исследовании фрагментов опухолевой ткани (табл. 2). Поскольку 10% забуференный нейтральный формалин приводит к частичной деструкции ЩФ, это в свою очередь снижает в биоптатах активность ЩФ, реагирующей с субстратом, и, как следствие, обусловливает более низкую силу тока на хроноамперограмме.

Таблица 2. Сила тока, полученная при исследовании биоптатов опухолей и неизмененной слизистой оболочки толстой кишки у пациентов 1-й группы

Примечание. * — различие статистически значимо (p<0,05).

Гистологически биоптаты опухоли представлены аденокарциномой различной степени дифференцировки (рис. 1, а, б); фрагменты слизистой оболочки вне опухоли не содержали патологических изменений (рис. 2, а, б).

Рис. 1. Гистологическая структура биоптатов опухолей, полученных в ходе исследования №4.

Ткань опухоли состоит из железистоподобных и криброзных структур, фокально — с некротическим детритом в просвете, разделенных прослойками десмопластической стромы с воспалительно-клеточной инфильтрацией — аденокарцинома низкой степени злокачественности (G1). Окраска гематоксилином и эозином, а — ×200, б — ×400.

Рис. 2. Гистологическая структура биоптатов слизистой оболочки вне опухоли, полученных в ходе исследования №4.

В собственной пластинке слизистой оболочки выявляются многочисленные железистые крипты, выстланные бокаловидными клетками. Окраска гематоксилином и эозином, а — ×200, б — ×400.

При иммуногистохимическом исследовании биоптатов с антителами к ЩФ экспрессия фермента отсутствовала в клетках опухолей (рис. 3, а). В свою очередь поверхностный эпителий и эпителий железистых крипт слизистой оболочки демонстрировал выраженную диффузную мембранную экспрессию ЩФ (рис. 3, б).

Рис. 3. Биоптаты опухоли (а) и слизистой оболочки толстого кишечника вне опухоли (б), полученные в ходе исследования №8.

Выявляются отсутствие экспрессии фермента в опухолевых клетках и выраженная диффузная мембранная экспрессия щелочной фосфатазы в покровном эпителии слизистой оболочки. Иммуногистохимическое исследование с антителами к щелочной фосфатазе, ×400.

Случаи с неоднородными результатами электрохимического и гистологического исследований вошли во 2-ю группу. В качестве примера демонстрируем одно из исследований (№25). Из клинических данных известно, что материал получен у пациента О. (мужчина, 73 лет) с опухолью сигмовидной кишки при эндоскопическом обследовании толстой кишки. При плановом гистологическом исследовании выявлено, что опухоль представлена умеренно дифференцированной (G2) аденокарциномой. Для электрохимического исследования получено 4 биоптата опухоли (БС №1—4) и 3 биоптата неизмененной слизистой оболочки (БС №5—7). Изначально выявлено, что сила тока при электрохимическом исследовании опухоли в 1,5 раза превышает таковую при исследовании слизистой оболочки (рис. 4).

Рис. 4. Сила тока при электрохимическом исследовании биоптатов слизистой оболочки толстого кишечника (а — 16,82±2,41 нА) и опухоли (б — 25,9±16,12 нА) в исследовании №25.

В ходе контрольного гистологического исследования биоптатов из БС получены данные о том, что опухолевой ткани в исследуемом материале нет. В БС выявлены следующие фрагменты: БС №1, №2 — фрагменты слизистой оболочки с MALT-структурами, БС №3 — неизмененная слизистая оболочка, БС №4 — фрагмент гладкомышечной ткани, БС №5—7 — неизмененная слизистая оболочка. Неоднородность полученных данных послужила основанием для оценки силы тока при исследовании каждого биоптата в отдельности (табл. 3).

Таблица 3. Средняя величина силы тока, полученного в ходе электрохимического исследования биоптатов №25

Примечание. БС — биосенсор.

На рис. 5, а приведена микрофотография фрагмента, находившегося в БС №2. Биоптат представлен слизистой оболочкой кишки с подслизистой основой, содержащей единичный крупный лимфоидный фолликул. На рис. 5, б представлена микрофотография фрагмента, находившегося в БС №4: биоптат состоял из зрелой гладкой мышечной ткани. Гистологическое исследование биоптатов, предварительно подвергнутых электрохимическому исследованию, позволило уточнить причины неоднородности силы тока: в ряде БС характер материала не соответствовал первоначальной маркировке. Последнее, очевидно, могло быть вызвано неоднородностью опухолевой ткани: возможностью присутствия в биоптатах наряду с опухолевыми клетками грануляционной и волокнистой соединительной, мышечной тканей, что подтверждается данными, полученными в исследовании материала пациентов 2-й группы.

Рис. 5. Гистологическая структура биоптатов, полученных в ходе исследования №25.

Морфологическая картина соответствует слизистой оболочке и подслизистой основе с лимфоидным фолликулом (а — биосенсор №2), и гладкомышечной ткани (б — биосенсор №4). Окраска гематоксилином и эозином, ×200.

При иммуногистохимическом исследовании с антителами к ЩФ выявлена слабая диффузная мембранная и цитоплазматическая экспрессия фермента в макрофагах, инфильтрирующих опухолевую ткань, а также в мультиполярных нейронах нервных сплетений. Элементы сосудистой стенки (эндотелий, перициты), волокнистой и рыхлой соединительной ткани (фибробласты, фиброциты, волокна) в составе как опухолевой стромы, так и собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы стенки толстой кишки, а также клетки мышечной ткани не экспрессировали ЩФ (рис. 6, а, б).

Рис. 6. Биоптаты, полученные в ходе исследований №2 (а — биосенсор №2) и №26 (б — биосенсор №4).

Выявляется выраженная диффузная цитоплазматическая экспрессия щелочной фосфатазы в макрофагах (а) и ганглиозных клетках межмышечного нервного сплетения (б). Иммуногистохимическое исследование с антителами к щелочной фосфатазе, ×400.

Таким образом, в ходе настоящей работы показана высокая эффективность электрохимического исследования с применением нанотехнологических БС для оценки активности ЩФ в биоптатах опухолей и слизистой оболочки ободочной кишки у пациентов с КРА.

Секреторная активность эпителиальных клеток в опухолях значительно снижается, что отражает нарушение их дифференцировки и функциональный атипизм. Низкая сила тока, полученная при исследовании фрагментов опухолевой ткани в образцах 1-й группы, является следствием низкой концентрации ЩФ в клетках паренхимы опухоли, и, следовательно, нарушением клеточной дифференцировки. Аналогичные различия выявлены при гистологическом и иммуногистохимическом исследовании фрагментов опухолей и слизистой оболочки ободочной кишки.

Более низкие значения силы тока, полученные при электрохимическом исследовании фиксированных в формалине биоптатов, связаны со снижением активности ЩФ в них. Тем не менее получены статистически значимые различия в хроноамперограммах опухолевой ткани и слизистой оболочки ободочной кишки, аналогичные таковым в нефиксированных биоптатах. Полученные данные свидетельствуют о том, что исследование активности энзимов в операционном и биопсийном материале с помощью электрохимического метода предпочтительно проводить в свежем материале либо после его минимальной фиксации в формалине.

Особый интерес представляют результаты обследования пациентов 2-й группы. При гистологическом исследовании биоптатов, ранее изученных в ходе электрохимического исследования, выявлено, что часть биоптатов содержала не только ткань опухоли, но и фрагменты грануляционной и волокнистой соединительной ткани, гладкой мышечной ткани с различной степенью выраженности воспалительно-клеточной инфильтрации. Можно предположить, что фрагменты волокнистой соединительной ткани — это элементы опухоли с участками выраженного преобладания стромы и отсутствием опухолевых клеток либо элементы подслизистой основы стенки кишки; фрагменты мышечной ткани — это элементы мышечного слоя стенки толстой кишки; фрагменты грануляционной ткани — это участки постнекротического «заживления» опухолевой ткани либо материал из поврежденной слизистой оболочки толстой кишки непосредственно вблизи роста опухоли. Кроме этого, показано, что в состав фрагментов слизистой оболочки толстой кишки могут входить MALT-структуры и прилежащая подслизистая основа стенки толстой кишки. Из полученных данных следует, что при взятии материала врачом-эндоскопистом следует учитывать возможность попадания в исследование тканей, дающих ложноположительный результат при электрохимическом исследовании в виде увеличения силы тока, несмотря на фиксированный размер биоптатов. По данным ряда исследователей [6, 7], ЩФ может выявляться в лимфоцитах MALT-структур слизистой оболочки кишечника, фибробластах подслизистого слоя стенки кишки, эндотелиальных клетках кровеносных сосудов подслизистого слоя стенки кишечника, дифференцированных нейтрофилах и моноцитах. Последние наряду с макрофагами и NK-клетками являются важным звеном системы противоопухолевого иммунитета, выявляются в строме опухоли [8]. Нейтрофилы могут выявляться в опухолевой ткани при развитии в ней некротических процессов, обычно на поздней стадии заболевания; показано, что концентрация ЩФ в них возрастает при КРА [9].

Гетерогенность строения опухолевой ткани КРА, проявляющаяся в недетерминированном соотношении опухолевого и стромального компонентов в каждом из биоптатов, также не позволяет стандартизировать количественно результаты электрохимического исследования активности ЩФ в биоптатах опухолей. При анализе литературы нами не выявлены данные о частоте обнаружения в биоптатах различных типов тканей, не являющихся опухолью, при биопсии КРА в ходе эндоскопического исследования, но на примере одного из исследований показано, что количество ложноотрицательных результатов колоноскопии при выявлении КРА минимально, составляет не более 3 (3,5%) из 85 случаев [10].

В ходе иммуногистохимического исследования опухолевой стромы, а также элементов стенки толстой кишки (собственной пластинки слизистой оболочки, подслизистой основы и мышечного слоя) нами установлено, что ЩФ может экспрессироваться в различных клеточных элементах, не являющихся эпителиальной тканью, что объясняет неоднородность результатов электрохимического исследования материала пациентов 2-й группы. Нами выявлена умеренная экспрессия ЩФ в нейронах мышечного слоя стенки толстой кишки, что также соотносится с данными литературы [11]. Таким образом, иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных антител к ЩФ позволило уточнить причину ложноположительных результатов, полученных в ходе электрохимического исследования биоптатов ряда пациентов. Учитывая результаты, полученные при исследовании биоптатов от пациентов 2-й группы, можно заключить, что ввиду возможности одновременной перекрестной реакции различных изоформ ЩФ (кишечной, неспецифической) с субстратом (1-нафтил фосфатом), электрохимическое исследование фермента с целью изучения степени дифференцировки кишечного эпителия имеет низкую практическую значимость.

Заключение

Настоящее исследование показало, что электрохимический метод с применением нанотехнологических биосенсоров может использоваться для быстрой прямой и недорогой по стоимости оценки содержания щелочной фосфатазы в биоптатах колоректальной карциномы. Полученные результаты позволяют рассматривать электрохимический метод как дополнительный метод оценки функционального атипизма опухолевых клеток. Представляет научный и практический интерес продолжение исследования с целью поиска более специфических маркеров как колоректальной карциномы, так и опухолей других локализаций, изучение корреляции результатов электрохимического и лабораторных методов исследования, улучшение методологии.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Фрейнд Г.Г.

Сбор и обработка материала — Белкин А.Н., Фрейнд Г.Г.

Статистическая обработка данных — Белкин А.Н., Кочетов А.Г.

Написание текста — Белкин А.Н.

Редактирование — Кочетов А.Г., Фрейнд Г.Г., Белкин А.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.