Введение

Человеческий кишечник — место обитания большого количества синантропных микроорганизмов, включая бактерии, дрожжи и вирусы, известных под общим названием «кишечная микробиота», которые имеют важное значение для сохранения барьерной функции слизистой оболочки, поглощения питательных веществ и гомеостаза. Они взаимодействуют друг с другом и хозяином, участвуют в регулировании местного и системного иммунитета, обменных и трофических функций. Последние данные свидетельствуют о том, что кишечная микробиота может играть важную роль в развитии ожирения и его осложнений [1, 2]. Не только ожирение и энергетически насыщенная диета изменяют микрофлору кишечника, но и изменение микробиоты также влияет на обмен веществ хозяина и вызывает воспаление и повышенное отложение жира в организме [3]. Многочисленные исследования моделей на животных показали, что микробиота кишечника изменяет энергетический гомеостаз с помощью различных механизмов, таких как индуцированное липополисахаридами хроническое воспаление, трансформация тканевого состава жирных кислот, повышение экспрессии генов, кодирующих синтез кишечных белков и пептидов в тканях хозяина, которые контролируют энергетический гомеостаз и наличие питательных элементов [4, 5].

Изменение качественного и количественного состава кишечной микрофлоры (дисбактериоз) стимулирует отложение жира с использованием разных механизмов: через изменение метаболизма бактерий с продукцией эндогенного этанола, нарушение обмена желчных кислот и холина, проницаемости кишечной стенки и стимуляции системного воспаления [6].

Состав и разнообразие кишечной микробиоты оценивают с помощью культурально независимых генетических и метагеномных технологий, получивших мощный толчок к развитию в настоящее время. Метагеномный анализ и генетическое секвенирование 16S рибосомальной РНК показали, что бактериальные типы Firmicutes, Bacteriodetes, Actinobacteria, Proteobacteria, Fusobacteria, Spirochaetae и Verrucomicrobia преобладают среди кишечных бактерий у взрослых [7, 8]. Вместе с тем изучение популяционных различий показывает изменения в составе микробиома здорового человека в зависимости от места проживания и/или типа питания, так, например, для жителей РФ характерно преобладание видов микроорганизмов, относящихся к типам Firmicutes и Actinobacteria, а бактерии рода Bacteroides, наоборот, менее представлены [9]. Аналогичным образом ряд исследований показал, что у человека ожирение связано с низкой численностью кишечных Bacteroides и высокой численностью Firmicutes, а также с уменьшением бактериального разнообразия [10—12]. Kemppainen и соавторами показали при высокопроизводительном секвенировании 16S ГРНК, что микробиом младенцев возможно связан с высоким риском развития диабета 1 типа в популяции однородных генотипов HLA II класса в Финляндии, где наблюдается значительно более низкое бактериальное разнообразие при расчете индекса разнообразия Шеннона, высокий уровень Bacteroides (p=0,051) и Veillonella (p=0,02), низкое отношение Bifidobacterium (p=0,02), Akkermansia (p=0,001) и Ruminococcus (p=0,03) по сравнению со шведами [13]. Необходимо помнить, что секвенирование 16S ГРНК дает представление о филогенетической характеристике бактерий в сообществе, но не предоставляет информации о функциях, закодированных остальной частью генома. При этом анализ метагенома или геномов определенных представителей микробного сообщества позволяет получить представление о потенциальной функции сообщества.

Протеомный и метаболомный анализы, изучающие функции микробиома, используют усовершенствованные методы масс-спектрометрии для измерения относительного содержания белков и метаболитов (включая пептиды, олигосахариды и липиды, а также общих метаболитов человека и микробиоты), поэтому являются истинной мерой метаболической среды микробиома [6].

Эти исследования показывают не только важность изучения кишечного микробиома, в котором в настоящий момент до 80% секвенированных метагеномов не может быть отнесено к какому-либо виду микроорганизмов, но и необходимость точной микробиологической идентификации микроорганизмов. Регулирование кишечной микробной экосистемы с помощью диеты или пробиотиков и пребиотиков в качестве средства для лечения ожирения и его осложнений — предмет дальнейших научных исследований.

Цель исследования — оценить возможности современной лабораторной диагностики микробиоты кишечника путем сопоставления результатов, полученных рутинными лабораторными методами (культуральными и хроматографическими).

Материал и методы

У 30 пациентов проведено изучение полостной микробиоты кишечника при исследовании фекалий хроматографическим методом с масс-спектрометрией микробных метаболитов/маркеров (МСММ) и количественным бактериологическим посевом (БП). Критерии включения: все исследования назначены пациентам врачом-гастроэнтерологом; единовременное поступление биоматериала для исследования.

БП проведен с использованием широкого перечня питательных сред для культивирования факультативно-анаэробных, облигатно-анаэробных микроорганизмов, грибов. Идентификация микроорганизмов проведена методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (Microflex, «Bruker Daltonics Inc.», США). Исследование МСММ выполнено по авторской методике профессора Г.А. Осипова.

Статистический анализ результатов проведен с использованием статистических программ MedCalc (MedCalc «Software», Бельгия), Statistica 8 («StatSoft», США). Выборочные параметры, приводимые далее в таблицах, имеют следующие обозначения: M — среднее, SD — стандартное (среднеквадратичное) отклонение, % — доля от числа.

Результаты

Рутинное сравнение результатов БП и МСММ представляет определенные трудности, связанные с особенностями отражения данных на бланке МСММ, например нет данных по общему количеству анаэробов, полученных путем суммирования разных родов, и факультативных анаэробов, что затрудняет оценку микробного сообщества. При этом определяется 56 показателей, представленных родами, видами и штаммами микроорганизмов, что усложняет интерпретацию результатов. На рис. 1 представлены бактерии, дифференцируемые данным методом. МСММ имеет всего одну границу нормируемых показателей, что отличается от требований к представлению лабораторных данных.

Рис. 1. Перечень микробных маркеров бактерий, определяемых методом хромато-масс-спектрометрии микробных метаболитов/маркеров.

Ранжирование микроорганизмов приведено по роду и количественным характеристикам. Сохранено написание названий в соответствии с бланком результатов исследования.

Для объективности сравнения результатов все микроорганизмы (бактерии и грибы) разделены на две группы: анаэробные и факультативно анаэробные (см. таблицу), вирусы исключены из оценки. При бактериологическом посеве эти группы дифференцируются в процессе культивирования микроорганизмов в соответствующих условиях, а для МСММ — получены путем суммирования результатов микроорганизмов с соответствующими характеристиками.

Количественные характеристики кишечной микробиоты

Примечание. МСММ — хромато-масс-спектрометрия микробных маркеров; БП — бактериологический посев; ОМЧ — общее микробное число.

В методе МСММ при оценке референтных интервалов доминирует род Eubacterium (35%). Далее по ранжиру следуют Lactobacillus spp. (22%), Bifidobacterium spp. (17%), Clostridium spp. (7%) и Bacteroides spp. (1%), что противоречит генетическим и культуральным референтным интервалам, а также данным автора методики. Отсутствует видовая дифференцировка Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp., Enterobacteriaceae. У некоторых пациентов результаты двух методов не коррелируют между собой по ряду параметров (рис. 2). Противоречивые результаты получены преимущественно для факультативно-анаэробных микроорганизмов: Enterococcus spp. (77%), Enterobacteriaceae (60%), Staphylococcus spp. (67%). Для традиционно культивируемых анаэробных микроорганизмов доля несоответствующих ответов по Lactobacillus spp. составила 30%, по Bifidobacterium spp. и Bacteroides spp. — 17%.

Рис. 2. Несоответствие результатов количественного определения бактерий разными методами (в долях).

П — результаты бактериологического посева; Э — экспресс-метод выявления микробных маркеров МСММ. Исключены результаты сопоставления методов при показателях бактериологического посева ниже нормируемых величин.

Пояснение к рисунку: бактериологический метод является «золотым стандартом» роста для культивируемых микроорганизмов. На рисунке изображены только бактериологические результаты с превышением или соответствием нормируемым диапазонам, что исключает влияние погрешностей преаналитического этапа. На примере Bacteroides spp. показано, что при бактериологическом посеве (П) количественные характеристики соответствуют нормальным значениям, следовательно, количество жизнеспособных микроорганизмов в исходном материале равно или больше этого уровня. При этом микробные маркеры, определяемые МСММ (Э) в 17% случаев находятся ниже нормируемых показателей, что указывает на ложноотрицательные результаты. В 67% они выше верхней границы, что не является несоответствием. Красным выделены ложноотрицательные результаты по данным масс спектрометрии.

Среди лактобактерий при БП преобладают виды L. salivarius, L. rhamnosus, L. ruminis, L. casei, L. plantarum. Высока доля неудач при внутривидовом типировании Lactobacillus spp. (53%) с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии, при этом дифференцировка Bifidobacterium spp. невозможна только в 23% случаев, доминируют Bifidobacterium longum (53%), а также типированы B. adolescentis, B. bifidum, B. dentium, B. animals. Необходимо обратить внимание, что проведение внутривидового типирования анаэробов позволяет выявить микроэкологические сдвиги внутренней среды, которые оказывают влияние на клеточные структуры Lactobacillus spp., изменяя белковый профиль, а также оценить изменение типичных свойств бактерий, приобретение ими факторов патогенности.

Обсуждение

Несмотря на то что врачи клинических специальностей (гастроэнтерологи, терапевты, педиатры) для выявления нарушений кишечного микробиоценоза практикуют использование различных культуральных (количественное определение полостной/пристеночной микробиоты) и некультуральных (метагеномные технологии, газовая хроматография и масс-спектрометрия) [14] методов, необходимо внимательно подходить к выбору диагностических тестов и быть готовым к интерпретации всех полученных результатов.

С лабораторной точки зрения бактериологический метод остается актуальным и доступным для оценки патологических изменений микробиоценоза. Преимущество исследования заключается в полноценном изучении патогенной и условно-патогенной микрофлоры в релевантном материале. При наличии хорошего анаэробного культивирования и возможности масс-спектрометрической идентификации можно отдельно судить о бактероидах, связанных с многими кишечными патологиями, и о микроорганизмах, которые обычно не изучают (Aeromonas hydrophila group, Aeromonas caviae, Aeromonas veronii, Vibrio damsela и т.п.), вызывающих, например, пищевые отравления, ассоциированные с морепродуктами. Бактериологический посев на стандартный перечень питательных сред для культивирования патогенных кишечных бактерий, например посев на дизентерийно-паратифозную группу или условно-патогенную микрофлору, не позволяет провести аналогичную диагностику. Метод МСММ не дает расшифровки видового состава семейства Enterobacteriaceae, поэтому может применяться только в сочетании с классическими культуральными методами, не заменяя их.

Хроматографические методики для количественной детекции микробиома и микробных метаболитов в таких биологических субстратах, как кровь, фекалии, отделяемое половых органов, вызывает определенные вопросы, связанные с процедурой валидации методики и определения референтных значений для некультивируемых микроорганизмов. В публикациях автора методики МСММ д.б.н., профессора Г.А. Осипова не приведены убедительные доказательства правильности и точности методики для количественных целей оценки результатов, нет сравнительных исследований по определению чувствительности и специфичности методики для диагностики инфекций, вызванных одним патогеном (например, септические состояния) [15]. Несомненно, что органический химический состав метаболитов микробиоты видоспецифичен и может информативно использоваться для видовой идентификации в чистой культуре микроорганизмов. Автор методики МСММ неоднократно ссылается в публикациях на сопоставление распределения ключевых жирных кислот с алгоритмом Microbial Identification System («MIDI Inc.», США) [15, 16], однако данный алгоритм не предполагает оценки количественных характеристик микроорганизмов.

Доступная информация, предоставленная автором МСММ, о данных состава жирных кислот, распространенных в организме человека микроорганизмов, показывает, что эти маркеры использованы с целью составления расчетных формул для вычисления их концентрации [16]. Формула расчета приведена в статье профессора Г.А. Осипова и соавт. как площадь пика маркера, характерного для одного микроорганизма, пропорциональная концентрации микроорганизма в единице объема или веса пробы по формуле [17]: «N1=Ai[Mst/(q2×Msam×Ast)]/Ri₁, где выражение в квадратных скобках, постоянный коэффициент к=Mst/q2/Msam/Ast=Mst(mg)/5,1×10^(–15)g/Msam(mg)/Ast.

В этих формулах Ai — площадь пика маркера, Mst — количество введенного в пробу стандарта в мг, Msam — соответственно количество пробы, Ast — площадь пика стандарта, Ri₁ — доля в % маркера с индексом i в профиле ЖК (жирные кислоты, ред.) определяемого микроба с номером 1 (N1), q2 — коэффициент, равный 5,1×10^(–15)g, в котором содержится основополагающая в пересчете на количество клеток величина 5,9×10¹² клеток микробов, содержащихся в 1 г микробной биомассы, и доля жирных кислот в клетке, принятая в среднем равной 3%. Соответственно количество клеток любого следующего микроорганизма можно рассчитать по аналогичной формуле — N2=Ai×k/Ri₂ и так далее, умножая площади пика Ai маркера, по которому проводятся вычисления, на коэффициент k и деля на долю маркера в % в составе ЖК этого микроорганизма».

Не опубликованы подтверждения правильности расчетных данных и количественного соотнесения данных микробных маркеров для разных видов микроорганизмов, особенно если они являются комменсалами разных биологических локусов (как и энтеро- и лактобактерии). Отсутствие методики МСММ для диагностики сепсиса — состояния крайне важного с точки зрения срочности и востребованности диагностики данным методом — подтверждает подозрения в коммерческой подоплеке использования данного метода. Несмотря на коммерческий успех МСММ, отсутствуют публикации по валидации и верификации метода, в том числе по сопоставлению данных с результатами метагеномных технологий. При этом определение метаболитов микробиоты, доступное для изучения хроматографическими методами, и выявление связи с различными заболеваниями представляет научный интерес как возможность для терапии многих состояний, поэтому метод МСММ, несомненно, имеет перспективы для дальнейшего развития.

Заключение

Необходимо ранжирование информативности лабораторных технологий и тщательная подготовка практикующих врачей по применению новых лабораторных методов в практике. С точки зрения лабораторной медицины мы считаем необходимыми более открытое обсуждение при внедрении новых технологий и определение показаний для их клинического применения, а также включения в рекомендации по диагностике с медицинской целью. В настоящий момент метод хромато-масс-спектрометрии микробных метаболитов/маркеров может быть применен только с научной целью при определении микробных метаболитов, для количественной оценки микробных сообществ требуются валидация и верификация метода.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Эмануэль В.Л., Корноухова Л.А.

Сбор и обработка материала — Денисов Н.Л., Корноухова Л.А.

Статистический анализ данных — Корноухова Л.А.

Написание текста — Корноухова Л.А.

Редактирование — Эмануэль В.Л.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.