В последние годы метод конфокальной лазерной эндомикроскопии (КЛЭМ) приобретает все более широкое распространение в клинической практике эндоскопистов. Наибольшую распространенность КЛЭМ приобрела в эндоскопии желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [1]. Это обусловлено рядом технических аспектов проведения исследования, а также особенностями трактовки получаемых изображений. В 2004 г. появились эндоскопы со встроенной системой для эндомикроскопического исследования, позволившие получать 1000-кратное увеличение структур слизистой оболочки. В настоящее время данный метод применяется для диагностики in vivo воспалительных и неопластических процессов в слизистой оболочке желудка, кишечника, желчных протоков, пищевода Барретта [2, 3].

В 2007 г. французская компания «Mauna Kea Technologies» выпустила новую систему для КЛЭМ — Cellvizio, принципиальным отличием которой было использование минизондов, применение которых предусматривало их проведение через инструментальный канал эндоскопических аппаратов. Такой подход сделал возможным недоступное ранее исследование дистальных отделов дыхательных путей с визуализацией структур ацинуса. Исследование впервые было проведено французскими исследователями и получило название «альвеоскопия» [4]. С тех пор рядом зарубежных исследователей предприняты попытки разработать систему оценки получаемых изображений, упорядочить структуру их морфометрического анализа, в том числе применяя варианты компьютерной обработки [5—8]. Однако все еще нет единого мнения относительно протокола альвеоскопии и четких критериев оценки эндомикроскопических изображений. Кроме того, большинство исследователей, понаслышке знакомых с методикой, не полностью представляют себе механизм достижения альвеол минизондом. Мировая практика располагает крайне скудным опытом в области КЛЭМ дистальных отделов дыхательных путей. В России же методика альвеоскопии начала осваиваться и разрабатываться лишь с 2011 г.

Цель работы — проведение морфометрического анализа и разработка критериев оценки альвеоскопических изображений.

За период с 2011 по 2013 г. в Федеральном научно-клиническом центре специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России с применением КЛЭМ обследованы 58 пациентов со следующими нозологическими формами: саркоидоз легких — 18, периферические образования (первичный рак легкого, метастазы рака, туберкуломы) — 16, пневмония — 7, эмфизема легких — 3, хронический бронхит — 1, альвеолярный протеиноз — 4, синдром Черджа—Стросса — 1, синдром Картагенера — 1, экзогенный аллергический альвеолит — 1, идиопатический легочный фиброз — 4, центральный рак — 1, лимфаденопатия без изменений паренхимы по данным компьютерной томографии — 1.

На основании этого опыта мы делимся особенностями и «подводными камнями» проведения КЛЭМ дистальных дыхательных путей.

Напомним, что метод КЛЭМ основан на принципе конфокальной флюоресцентной микроскопии. Лазер длиной волны 488 нм, расположенный в рабочей станции, генерирует лазерный луч и передает его с помощью систем зеркал, качающихся во взаимоперпендикулярных направлениях. На выходе из рабочей станции лазерный луч проходит через многоволоконный фиброоптический зонд и попадает на поверхность исследуемой ткани. Часть света поглощается, а индуцируемый лазером эффект флюоресценции вызывает свечение тканей, которое идентифицируется конфокальным микроскопом, обрабатывается компьютером, позволяя получить динамическое монохромное изображение на мониторе.

Для исследования бронхолегочной системы применяется минизонд Alveoflex аппарата Cellvizio («Mauna Kea Technologies», Франция), разрешающая способность которого составляет 3,5 мкм, диаметр оптического поля — 600 мкм, глубина исследования — 0—50 мкм. Важно, что при альвеоскопии в отличие от желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), не используются дополнительные флуорофоры, исследование базируется на естественной аутофлюоресценции структур бронхов и легочной паренхимы.

Известно, что такой структурой при проведении КЛЭМ дыхательных путей, прежде всего, является эластин. Эластические волокна составляют почти 50% объема соединительной ткани легкого. Именно от этого мы исходим при оценке альвеоскопических изображений.

Во время видеобронхоскопии всем 58 пациентам была выполнена последовательная двусторонняя посегментная оценка респираторных компартментов с помощью КЛЭМ и осуществлены видеозаписи и фотографирование.

После завершения этапа общего эндоскопического исследования по инструментальному каналу проводится Alveoflex, скользя по бронху, смещается в дистальном направлении до момента визуализации альвеолярных перегородок, подобно проведению биопсийных щипцов для выполнения трансбронхиальной биопсии, т.е. до достижения ощущения слабого сопротивления ткани легкого. Пациенты при этом могут отмечать умеренно выраженное покалывание или слабовыраженную болезненность в соответствующих отделах грудной клетки. На экране монитора появляется динамическая монохромная микроскопическая картина, которая может быть записана в виде фильмов и воспроизведена для анализа. С учетом увеличения продолжительности времени диагностической процедуры в интервале от 10 до 30 мин для исследования требуется хорошая анестезия, а оптимальным вариантом является наркоз.

Фиксация данных альвеоскопии осуществляется в режиме видеозаписи (формат MKT) в количестве 15—30 фильмов и 10—15 графических изображений для каждого пациента. В дальнейшем с использованием стоп-кадра производится анализ изображений с оценкой доступных визуализации на длине волны 488 нм структур.

Производится качественная оценка наиболее информативных фрагментов записей, а также выполняется количественная и полуколичественная оценка основных визуализирующихся структур: измеряется толщина альвеолярных стенок, диаметр сосудов, размер и количество альвеолярных макрофагов в случае их наличия. После этого следует описание эндомикроскопических изображений по критерию «норма или патология». В случае если исследователь трактует изображение как присущее какой-либо патологии, перечисляются параметры, характеризующие отклонение картины от нормальной: дистелектатические изменения, утолщение и/или изменение альвеолярных структур, отсутствие интерстициального каркаса, обилие секрета в просвете альвеол и др. Осуществляется протоколирование измерений, выявленных особенностей.

Для того чтобы каждое конкретное исследование считать информативным, прежде всего, необходимо достичь визуализации альвеолярных структур. Только при соблюдении данного условия КЛЭМ дыхательных путей можно назвать альвеоскопией.

Известно, что терминальные бронхиолы диаметром 1—2 мм переходят в респираторные диаметром не более 0,6 мм. Тогда каким образом зонд диаметром почти 1,5 мм проникает в альвеолярные ходы? Оказывается, в большинстве случаев, за исключением выраженного процесса атрофии, достижение альвеолярных структур осуществляется посредством пенетрации стенки бронхиолы (рис. 1).

В единичных наблюдениях провести зонд в альвеолы удается напрямую без повреждения стенки бронхиолы, в таком случае это дополнительно описывается с указанием формы и по возможности размера альвеолярного входа (рис. 2).

В бронхиолах мы оцениваем диаметр устья бронхиальных желез (рис. 3).

Структура альвеол в норме подразумевает наличие окружностей, визуализируемых полностью или частично, что зависит от угла, под которым Alveoflex подходит к конкретной структуре. Если же мы видим «сладж» межальвеолярных перегородок, можно констатировать ателектатические изменения (рис. 4).

После оценки воздушности паренхимы необходимо определить толщину эластических волокон и межальвеолярных перегородок (рис. 5, 6),

Обилие альвеолярных макрофагов в просвете альвеол — первое, что мы замечаем у курящих пациентов. Визуализация их методом КЛЭМ обусловлена обилием табачных смол в их структуре, которые также хорошо флюоресцируют на длине волны

488 нм. Оценивать их количество мы предлагаем полуколичественным методом по 5-балльной шкале: 1 — единичные в поле зрения (в этом случае дополнительно измеряется размер клетки), 2 — занимают менее половины поля зрения, 3 — занимают половину, 4 — более половины поля зрения, 5 — покрывают все поле зрения (рис. 9).

При этом следует учитывать наличие и качественные характеристики секрета в альвеолах. Он может визуализироваться пузырями прозрачной жидкости или как вязкий, «пачкающий» минизонд, компонент (рис. 10).

Попадающие в поле зрения сосуды должны быть оценены по количеству, диаметру, извилистости и наличию ветвления или анастомозов (рис. 11, 12).

Эластические волокна обладают свойствами растяжимости и упругости, все же разорвать их при альвеоскопии не составляет труда. Как и в случае перфорации стенки терминальной бронхиолы при выполнении исследования альвеол, часть из них утрачивает свою целостность, однако это не представляет опасности для пациента ввиду незначительности данных повреждений в масштабе объема всей легочной паренхимы. Таким же образом происходит и разрыв мелких кровеносных сосудов и их ветвей (рис. 13).

В случае достижения минизондом субплевральных отделов или самой плевры может визуализироваться характерная структура (рис. 14),

Для систематизации оценки полученных изображений сформирован протокол исследования, включающий качественную и количественную оценку доступных визуализации структур и субстанций. Анализ получаемых при КЛЭМ данных мы предлагаем проводить по схеме, представленной в приведенной ниже таблице.

Дополнительно в протоколе исследования указываются переносимость процедуры (отмечается наличие неприятных ощущений в проекциях зон исследования, указываются другие нежелательные явления) и осложнения (пневмоторакс, кровотечение) в случае их возникновения.

Исследователи из Франции, США, Бельгии и Германии, разрабатывающие метод альвеоскопии, признают ее безопасной. Так и большинство наших пациентов не отмечали никаких ощущений во время проведения альвеоскопии, 7 (12,3%) из них указали на покалывание и умеренно выраженную боль в проекции соответствующего зоне исследования сегмента легкого, что означало достижение минизондом субплевральных отделов. L. Thiberville в своей работе [5], которая на является основным фундаментальным трудом в данной области, также отмечает это как единственный признак дополнительного дискомфорта (помимо самой бронхоскопии) для пациентов в процессе исследования.

«Mauna Kea Technologies» последние 5 лет ежегодно организует международные конференции (ICCU — International Conference of Cellvizio Users) для клиник, располагающих соответствующим оборудованием. И если в среднем число участников ICCU-2013 составило около 250, то на секции по вопросам применения КЛЭМ для оценки дистальных дыхательных путей присутствовали не более 20 исследователей, что отражает мировой интерес и достижения в данной области, а также объясняет, почему метод развивается так медленно. Исследователям гораздо проще заниматься эндомикроскопией ЖКТ (где все понятнее и проще), чем пытаться разобраться с тем, какие структуры мы видим при альвеоскопии.

Далеко не все диагностические возможности альвеоскопии использованы в настоящее время исследователями. Например, можно пытаться дифференцировать кровеносные сосуды на артериальные и венозные по принципу оценки интенсивности флюоресценции и извитости. Так как стенка артериол содержит большее количество эластических волокон, соответственно эффект аутофлюоресценции их стенок будет более интенсивным, артериолы будут также иметь извилистый ход.

Обилие альвеолярных макрофагов не всегда служит признаком того, что обследуемый пациент является курильщиком. Визуализация этих клеток встречается также при различных патологических процессах в отсутствие анамнеза курения пациента, например, при саркоидозе, выраженной интерстициальной пневмонии, выраженном воспалении вследствие трансплантации органа [6, 7]. Одними исследователями выдвигается предположение, что это так называемые активированные макрофаги, в которых происходит активное накопление биологически активных веществ, что, вероятнее всего, и приводит к их флюоресценции, другие высказываются о том, что это могут быть лимфоциты [8—10].

Весьма привлекательным представляется также изучение КЛЭМ-картины редких болезней накопления различных субстанций в просвете альвеол (альвеолярный протеиноз, легочный микролитиаз, амилоидоз, деструктивные воспалительные заболевания легких) и тех, при которых происходит деформация альвеолярного каркаса (лимфангиолейомиоматоз, гистиоцитоз Х).

Однако чтобы доказать эти и многие другие предположения, необходимо дальнейшее изучение КЛЭМ-картины у пациентов с различными заболеваниями и нормальных добровольцев, а также проведение экспериментов ex vivo.

По нашему мнению, КЛЭМ дистальных дыхательных путей является чрезвычайно интересным, прежде всего, с научной точки зрения, и еще не раскрывшим весь свой потенциал методом. В настоящее время он может применяться для получения дополнительной информации о состоянии дыхательного компартмента, что весьма актуально ввиду нерешенности проблемы минимально инвазивной диагностики различных заболеваний легких.