Введение
Баклофен (баклосан, лиорезал) — миорелаксант, отличающийся от других препаратов этой группы по молекулярной структуре. Баклофен представляет собой хлорфенильное производное гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), что определяет своеобразие его фармакологических эффектов [1—3]. Он является рецептурным препаратом и доступен как в пероральной форме, так и в форме для подоболочечного введения (интратекальная форма) [1, 4].
Доказана эффективность баклофена при спазмах мышц, возникающих в результате повреждения спинного мозга разного происхождения, острых нарушениях мозгового кровообращения и менингите [1]. Баклофен в интратекальной форме показан в случаях невозможности его применения в пероральной форме. В ряде исследований изучалась эффективность баклофена у пациентов с алкоголизмом [5—11], наркоманией [12], однако этот вопрос требует дальнейшего рассмотрения. Также была показана эффективность баклофена при церебральном параличе [13, 14].
На сегодняшний день некоторые особенности механизма действия баклофена остаются выясненными не до конца. Установлено, что этот препарат вызывает селективную активацию пресинаптических ГАМКб-рецепторов, что приводит к уменьшению выделения возбуждающих аминокислот (глутамата и аспартата), которые играют важную роль в формировании спастической реакции [1, 15].
Баклофен имеет выраженный психотропный эффект и часто является предметом злоупотребления преимущественно среди лиц молодого возраста [16—18]. В этом случае доза баклофена увеличивается до 6—14 таблеток, зачастую этот препарат сочетают со слабоалкогольными напитками [17, 18].
Во всех случаях, подозрительных на отравление баклофеном, требуется дифференциальная диагностика с другими отравлениями для наиболее эффективного проведения последующих реабилитационных мероприятий [19—21]. В случае летального исхода необходимо обоснование непосредственной причины смерти [22].
Морфологические изменения в легких при введении баклофена остаются недостаточно изученными [23]. В то же время выяснение структурных изменений, возникающих в легких при отравлении этим препаратом, является крайне важным условием разработки эффективных лечебных мероприятий, а также будет полезно при установлении непосредственной причины смерти.
Цель исследования — выявление патологических изменений в легких при отравлении баклофеном и оценка их динамики.
Материал и методы
В эксперимент были включены 20 половозрелых (возраст 20 нед) крыс-самцов линии Wistar массой 290—350 г. Животных распределили на 3 группы исследования и контрольную группу (по 5 крыс в каждой). Эксперименты проводили в соответствии с требованиями Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях [24]. Баклофен в дозе 85 мг/кг вводили животным под общим наркозом (хлоролаза) через назогастральный зонд.
Выделили следующие группы животных:
— контрольная группа — животные, не получавшие баклофен;
— 1-я группа — животные, получавшие баклофен в дозе 85 мг/кг, длительность эксперимента 3 ч;
— 2-я группа — животные, получавшие баклофен в дозе 85 мг/кг, длительность эксперимента 4,5 ч;
— 3-я группа — животные, получавшие баклофен в дозе 85 мг/кг, длительность эксперимента 24 ч.
После введения баклофена крыс выводили из наркоза и оставляли в виварии со свободным доступом к воде, но без пищи. Через 3; 4,5 и 24 ч проводили эвтаназию животных путем смещения шейных позвонков под наркозом (хлоролаза). Вскрывали грудную полость, легкие извлекали и помещали в 10% нейтральный формалин, а затем заключали в парафин. Готовили срезы легких толщиной 5 мкм, наносили их на предметные стекла, окраску осуществляли согласно общепринятой методике гематоксилином и эозином. Проводили также ШИК-реакцию (реакция с Шифф-йодной кислотой). Гистологические препараты изучали при увеличении ×400. Использовали микроскоп Nikon E-400 с видеосистемой на основе камеры Watec 221S.
При морфометрическом анализе применяли сетку Г.Г. Автандилова. Оценивали следующие показатели (в объемных процентах, об.%): площадь, занятую альвеолами, межальвеолярными перегородками (МАП), сосудами, лейкоцитами, отеком, а также долю лейкоцитов в МАП. Вычисляли долю лейкоцитов, дающих ШИК-положительную реакцию. Для статистической обработки полученных данных использовали программы Microsoft Excel, Statistica 12.0.
Результаты
В легких животных контрольной группы патологические изменения отсутствовали.
У животных 1-й группы через 3 ч после введения баклофена бронхиолы были деформированы. Отмечалось развитие венозного и капиллярного полнокровия, кровоизлияния в МАП. Наблюдали эмфизему, появление ателектаз и дистелектаз, расположенных преимущественно субплеврально, развитие клеточной реакции (инфильтрация МАП лейкоцитами) (рис. 1 на цв. вклейке). Многие МАП были утолщены за счет полнокровия капилляров, кровоизлияний, пропитывания серозной жидкостью. Артериовенозные анастомозы расширены, полнокровны. Визуализировался отек перибронхиальной и периваскулярной соединительной ткани. В венулах и посткапиллярах было выявлено скопление сегментоядерных лейкоцитов. Часть лейкоцитов давала ШИК-положительную реакцию.
Рис. 1. Легочная ткань животного 1-й группы через 3 ч после введения баклофена.
а — увеличение числа лейкоцитов на территории МАП. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200; б — ШИК-реакция, ШИК-положительные лейкоциты. Ув. 400.
Во 2-й группе через 4,5 ч после введения баклофена деформация бронхиол сохранялась, просветы некоторых бронхиол приобретали щелевидную форму. Наблюдалось развитие нарушений кровообращения (артериальное, венозное, капиллярное полнокровие, появления единичных сладжей, кровоизлияния в МАП). В легких животных отмечалось чередование очагов ателектазов, дистелектазов и эмфиземы. В участках эмфиземы МАП были истончены. В просветах бронхов было выявлено наличие слущенных эпителиальных клеток (рис. 2 на цв. вклейке), макрофагов, лейкоцитов, эритроцитов. Ядра эпителиальных клеток были гипо- либо гиперхромными (чего не было отмечено в 1-й группе). Часть лейкоцитов также давала ШИК-положительную реакцию.
Рис. 2. Легочная ткань животного 2-й группы через 4,5 ч после введения баклофена.
Слущенный эпителий в просвете бронха. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200.
У животных 3-й группы через сутки после введения баклофена наблюдали нарушение кровообращения. В просветах легочных артерий и вен обнаруживались единичные сладжи. Венулы были расширены, полнокровны, отмечались агрегация эритроцитов и краевое стояние лейкоцитов, часть из которых давала ШИК-положительную реакцию. Капилляры МАП были полнокровны, со скоплением лейкоцитов. Было установлено наличие кровоизлияний в альвеолы (рис. 3 на цв. вклейке); появление ателектазов и дистелектазов, расположенных преимущественно субплеврально. Эластические волокна межальвеолярных перегородок в зонах отека были или не окрашены, или фрагментированы.
Рис. 3. Легочная ткань животного 3-й группы через 24 ч после введения баклофена.
Дистелектазы, единичные кровоизлияния в альвеолы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200.
Результаты морфометрического исследования легких при отравлении баклофеном представлены в таблице.
Результаты морфометрического исследования легких при отравлении баклофеном и его комбинацией с этанолом
| Показатель | Контрольная группа | 1-я группа (баклофен, 3 ч) | 2-я группа (баклофен, 4,5 ч.) | 3-я группа (баклофен, 24 ч) |
| Альвеолы | 36,50 [32,25; 43,0] | 41,50 [36,00; 48,5] | 39,00 [31,25; 45,75] | 36,50 [31,00; 46,00] |
| Лейкоциты | 9,00 [7,00; 11,00] | 8,00 [7,00; 10,00] | 12,00* [10,00; 15,00] | 8,00# [5,25; 11,75] |
| Отек | 6,00 [4,00; 8,00] | 8,00 [5,25; 9,75] | 9,00 [7,00; 13,00] | 11,00* [8,00; 13,75] |
| Сосуды | 3,0 [2,00; 3,00] | 4,0 [3,00; 5,00] | 6,0* [5,00; 7,00] | 7,50* # [6,00; 9,00] |
| Соотношение лейкоц./МАП | 0,14 [0,11; 0,18] | 0,16 [0,12; 0,18] | 0,21* [0,16; 0,25] | 0,15 [0,08; 0,20] |
| МАП | 63,50 [57,00; 67,75] | 58,50 [51,50; 64,00] | 61,00 [54,25; 68,75] | 63,50 [54,00; 69,00] |
Примечание. * — p<0,01 по отношению к контролю; # — p<0,01 по отношению к 1-й группе. Данные представлены в виде Me [LQ; HQ].
Из таблицы видно, что через 24 ч после введения баклофена у животных 3-й группы площадь, занятая сосудами, была статистически значимо больше, чем в группе контроля.
Площадь, занятая сосудами, через 4,5 ч после введения баклофена (2-я группа) была статистически значимо больше, чем в группе контроля, а через 24 ч статистически значимо больше, чем через 4,5 ч. Площадь, занятая лейкоцитами, и соотношение лейкоциты/МАП через 4,5 ч после введения баклофена были статистически значимо больше, чем в группе контроля и через 3 и 24 ч после введения препарата.
Индекс воздушности через 3 ч после введения баклофена (1-я группа) был статистически значимо выше, чем в группе контроля, а затем, наоборот, ниже.
В группе контроля доля лейкоцитов, дающих положительную ШИК-реакцию, оказалась меньше 0,3 (0,29), что соответствует норме. Доля лейкоцитов, дающих положительную ШИК-реакцию, в 1, 2, 3-й группах составила 0,59; 0,61 и 0,63 соответственно, что статистически значимо больше, чем в группе контроля.
Обсуждение
Одним из наиболее ранних признаков, обнаруживаемых в легких при введении баклофена, является расстройство кровообращения, включая нарушения микроциркуляции [15], что было зафиксировано во всех экспериментальных группах животных.
Согласно данным литературы, баклофен не имеет прямого токсического воздействия на бронхи и легкие. Являясь агонистом ГАМКb-рецепторов, этот препарат действует на уровне спинного мозга и вызывает подавление моносинаптических и полисинаптических рефлексов, снижая активность гамма-мотонейронов. Этот препарат обусловливает снижение тонуса скелетных мышц, включая межреберные, чрезмерное расслабление которых приводит к затруднению дыхания и последующему развитию гипоксии.
Баклофен является селективным стимулятором ГАМКb-рецепторов, но в высоких дозах вызывает стимуляцию и ГАМКa-рецепторов, в результате чего происходит сокращение гладкой мускулатуры бронхов и бронхиол, развитие спазма и затруднения дыхания, что также приводит к увеличению сосудисто-тканевой проницаемости [15, 25].
Изменения бронхиол во всех экспериментальных группах характеризовались их деформацией. В легких отмечалось чередование участков ателектаза, дистелектаза и эмфиземы. Эти изменения усугубляют гипоксическое состояние и способствуют повышению проницаемости сосудов микроциркуляторного русла, развитию интерстициального и интраальвеолярного отека, что наблюдали во всех экспериментальных группах. Площадь, занятая отеком, после введения баклофена увеличивалась и через 24 ч была статистически значимо больше по сравнению с группой контроля.
Одним из ранних признаков повреждения легких является также увеличение содержания сегментоядерных лейкоцитов и макрофагов в капиллярах, венулах, периваскулярной соединительной ткани, а также на территории МАП. Рост гликогена в лейкоцитах (что можно выявить при проведении ШИК-реакции) объясняется ростом метаболической активности при любом виде лимфоидной пролиферации, что также наблюдалось во всех экспериментальных группах. Через 3; 4,5 и 24 ч после введения баклофена доля лейкоцитов, дающих ШИК-положительную реакцию, была статистически значимо больше, чем в группе контроля.
Заключение
При введении миорелаксанта баклофена экспериментальным животным развивается комплекс патологических реакций, включающих в себя расстройства кровообращения (венулярное и капиллярное полнокровие, кровоизлияния в МАП, альвеолы, сладж), появление участков эмфиземы (МАП в участках эмфиземы истончены), чередующихся с ателектазами и дистелектазами. В условиях нарастающей гипоксии увеличивается сосудисто-тканевая проницаемость и развивается отек. Возрастает число лейкоцитов, дающих ШИК-положительную реакцию.
Комплекс патологических изменений в легких, выявленный по результатам настоящего исследования, имел определенную динамику. Данные о морфологических изменениях в легких в совокупности с результатами химического исследования могут быть использованы для диагностики отравлений баклофеном и для установления времени, прошедшего с момента введения этого препарата.
Исследование было проведено на средства государственного задания №122032100086-3.
The study was carried out at the expense of the state task No. 122032100086-3.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.