Нарушения сердечного ритма — одна из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. В соответствии с данными Всемирной организации здравоохранения ежегодно в мире от сердечно-сосудистых заболеваний умирают более 17 млн человек [1]. Показатели смертности от сердечно-сосудистых заболеваний в российской популяции достаточно высокие, составляя 56% в структуре общей летальности [2, 3].
Для лечения нарушений ритма сердца и проводимости используется большое количество лекарственных средств. Современные антиаритмические препараты позволяют успешно купировать и предупреждать аритмии различного происхождения, однако их возможности для профилактики и лечения ограничены рядом побочных эффектов [4, 5]. Нередко препараты обладают узким терапевтическим диапазоном, высокой токсичностью, гипотензивным действием, проявляют проаритмогенный и другие нежелательные эффекты [6]. Сложность, многообразие и широкая распространенность нарушений сердечного ритма диктуют необходимость поиска новых высокоэффективных противоаритмических средств.
При поиске новых фармакологически активных веществ, перспективных для практического применения в качестве лекарственных средств, наиболее рациональным является синтезирование новых оригинальных химических веществ, изучение зависимости их активности от химического строения с последующим направленным синтезом соединений с наиболее выраженными фармакологическими свойства.
Настоящие исследования предусматривали проведение скрининга антиаритмической активности нового оригинального класса химических веществ, оценку зависимости действия от химического строения при нарушениях сердечного ритма, изучение фармакологических свойств, а также токсикологическую характеристику выявленного наиболее активного соединения.
Изучение проведено в рамках совместных исследований ФГБУ «НМИЦК им. акад. Е.И. Чазова» Минздрава России и Института тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова Российского технологического университета (МИРЭА).
Материал и методы
Все исследовательские работы по доклиническому токсикологическому изучению указанных оригинальных соединений проведены в соответствии с национальными и международными требованиями в сфере обращения лекарственных средств [7—11]. В качестве референс-препаратов использовали известные и широко применяемые в медицинской практике антиаритмические средства: амиодарон (Кордарон «Санофи-Авентис Франс»), пропранолол (Анаприлин «Татхимфармпрепараты»), верапамил (Алкалоид респ. Македония), новокаинамид («"Мосхимфармпрепараты" им. Н.А. Семашко»).
Эксперименты по изучению «острой токсичности» и антиаритмической активности соединений проведены на 380 мышах линии Balb/c (самцы и самки, масса тела 18—20 г), 760 крысах линии Wistar (самцы и самки, масса тела 180—240 г). Животные получены из филиала «Столбовая» ФГБУН «НЦБМТ ФМБА» России, были здоровы, имели ветеринарный сертификат качества и прошли 14-суточный карантин в биоклинике ФГБУ «НМИЦК им. акад. Е.И. Чазова» Минздрава России. Животных содержали в условиях естественного освещения в соответствии с нормами группового размещения с принудительной 16-кратной вентиляцией при температуре 18—20 °С и относительной влажности воздуха 40—70%, имели свободный доступ к питьевой воде и стандартному гранулированному корму ПК 120-1 (ООО «Лабораторснаб», Россия, ГОСТ Р50258—92). Все исследовательские научные работы выполнялись с общепринятыми нормами обращения с лабораторными животными, соответствующими правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей [12].
Исследования «острой токсичности» новых оригинальных соединений класса N-(2-(2-(диалкиламино)этокси)этил)карбоксамидов проведены по методу Deichman, Le Blanc [13] на мышах линии Balb/c (самцы и самки, масса тела 18—22 г) при однократном в/б введении с последующим установлением точных показателей токсометрии ЛД10, ЛД16, ЛД50±m, ЛД84, ЛД90 методом пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону [14, 15].
Исследование антиаритмических свойств. Первичный скрининг соединений и оценку антиаритмических свойств проводили на аконитиновой модели аритмии, которая вызывалась в/в введением крысам линии Wistar (самцы и самки массой 180—240 г, уретан в/б 1300 мг/кг) аконитина гидробромида в дозах 50,0 мкг/кг [16]. Перед началом эксперимента у животных регистрировали ЭКГ во II стандартном отведении (калибровочный сигнал 10 мм/мВ, скорость записи 25 мм/с) на ветеринарном кардиографе CARDIOVIT AT-1 VET Schiller (Швейцария). Исследуемые соединения в дозах 1/10—1/100 от ЛД50 (для мышей при в/б введении) и препараты сравнения вводили за 2 мин до введения аконитина. Регистрацию ЭКГ проводили через 3, 5, 10, 15 и 20 мин после введения аконитина.
Антиаритмическое действие новых оригинальных соединений класса N-(2-(2-(диалкиламино)этокси)этил)карбоксамидов оценивали по величине латентного периода, по продолжительности аритмии или ее предотвращению. По окончании эксперимента методом пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону рассчитывали среднеэффективные дозы изучаемых соединений — ЭД50 и антиаритмический индекс (ЛД50/ЭД50). Последний позволяет более точно охарактеризовать фармакологическую активность препаратов, терапевтическую широту и перспективность создания на их основе лекарственных средств [17].
При оценке эффективности антиаритмического действия отобранных наиболее активных соединений класса N-(2-(2-(диалкиламино)этокси)этил)карбоксамидов использовали различные схемы дозирования, способы (в/в и в/ж) и режимы введения (профилактически или с лечебной целью) как на уже применявшейся аконитиновой модели аритмии у крыс, так и на моделях нарушений сердечного ритма, вызванных хлористым кальцием (200—250 мг/кг, крысы, в/в) и хлористым барием (25 мг/кг крысы, в/в).
Исследование фармакологических свойств. Оценка влияния отобранных наиболее активных соединений на центральную нервную систему была произведена с помощью средств, влияющих на тормозные процессы, а также угнетающие процессы возбуждения: этанол (14 мл/кг 40%, в/б) и уретан (1500 мг/кг, в/б). В качестве веществ, вызывающих судороги, были использованы: м-холиномиметик ареколин (25 мг/кг), (преимущественное возбуждающее действие на м-холинорецепторы мезенцефалического отдела ретикулярной формации) и психостимулирующее вещество гармин (10 мг/кг). При введении апоморфина (2 мг/кг, в/б) оценивалась выраженность и продолжительность стереотипии в сравнении с показателями контрольной группы. О влиянии на Н-холинорецепторы судили по изменению показателей в опытных группах после введения никотина (7 мг/кг, в/б).
Оценку анальгетической активности проводили методом Рэндалла-Селитто [18], влияние соединений на функциональное состояние почек изучали на крысах линии Wistar (масса тела 190—240 г) в условиях водной нагрузки [19]. Исследование влияния соединений на артериальное давление крыс выполнено методом неинвазивного измерения объема крови в хвостовой артерии бодрствующих крыс с помощью окклюзионной хвостовой манжеты на автоматическом мониторе артериального давления для грызунов CODA (Kent Scientific, США). При исследовании токсикокинетических параметров одного из наиболее активного соединения 12 применяли метод «элиминации токсического эффекта» [20]. На основании полученных результатов определяли период полувыведения Т1/2 и величины остаточных доз в разное время после их однократного в/б введения мышам.
Исследование субхронической токсичности активного соединения 12. Навески субстанции наиболее активного соединения 12 растворяли в 0,9% стерильном физиологическом растворе NaCl (ООО «Гротекс»), готовили 1,3 и 2,6% растворы в дозах 13 и 26 мг/кг (10- и 20-кратные, предполагаемые высшие терапевтические дозы для человека) и вводили ежедневно в/б попеременно в правую и левую стороны живота крыс (масса 180—200 г) на протяжении 1 мес. Контрольным животным в соответствующих объемах вводили ежедневно 0,9% стерильный физиологический раствор NaCl (контрольное вещество и растворитель препарата). Образцы изучаемого соединения 12 для введения подопытным животным готовили ежедневно утром ex tempore перед их введением.
При проведении исследований отмечали общее состояние и поведение животных (динамика массы тела, двигательная активность, состояние шерстного покрова, аппетит). Первоначальные данные (фоновые) были получены через 2 нед и через 1 мес субхронического эксперимента на основании исследований морфологического состава периферической крови (уровень гемоглобина, количество эритроцитов, гематокрит, средний объем эритроцитов, среднее содержание гемоглобина в эритроците; общее количество лейкоцитов, лимфоцитов, гранулоцитов и их процентное содержание; количество тромбоцитов, средний объем тромбоцитов). Биохимические данные определялись на анализаторе TARGA BT2000 (уровень общего белка, билирубина, мочевины, креатинина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов, активность ряда ферментов сыворотки крови.
После окончания субхронического эксперимента проведена эвтаназия крыс путем их помещения в CO2-камеру для последующего патоморфологического исследования внутренних органов и тканей животных.
При взятии проб крови животных предварительно помещали в «домик» для фиксации, затем в термостат (t=37 °С) на 3—5 мин, после чего скальпелем от кончика хвоста отсекали 0,5—1 см и производили забор крови из хвостовой вены для гематологических исследований в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) и в пробирки с гелем для биохимических исследований, в объемах 0,5 и 2,5 мл соответственно. Кровь для биохимических исследований центрифугировали на центрифуге «Ева-20» (Hettich, Венгрия), при 3000 об/мин в течение 10 мин. Полученную сыворотку отбирали в сухие пробирки и анализировали.
Вскрытие животных проводили по полной патологоанатомической схеме сразу же после их гибели. На каждое животное оформляли полный протокол вскрытия с подробным описанием патологоанатомических признаков всех органов и систем организма.
Результаты
Проведенные исследования показали, что изучаемые оригинальные соединения класса N-(2-(2-(диалкиламино)этокси)этил)карбоксамидов оказались малотоксичными при однократном в/б введении мышам линии BALB/c. При этом показатели ЛД50 находились в пределах 104—822 мг/кг (табл. 1).
Таблица 1. Показатели токсичности и эффективности антиаритмического действия N-(2-(диалкиламино)этокси)этил)карбоксамидов и их гидрохлоридов и препаратов сравнения на различных моделях аритмии при внутривенном введении
| № соединения | Исследуемое вещество | ЛД50, мг/кг | Модель аритмии | |||||||
| Аконитина гидробромид, 50 мкг/кг | Хлористый кальций, 250 мкг/кг | Хлористый барий, 25 мкг/кг | ||||||||
| R | n | NR12 | ЭД50, мг/кг | ЛД50/ЭД50 | ЭД50, мг/кг | ЛД50/ЭД50 | ЭД50, мг/кг | ЛД50/ЭД50 | ||
| (6) | С6Н5 | 0 | NC5H10 | 266 | 3,3 | 80,6 | 11,5 | 23,13 | 99,0 | 2,7 |
| (7) | С6Н5 | 0 | NC4H8O | 822 | 67,9 | 12,1 | 36,0 | 24,06 | 134,0 | 6,1 |
| (11) | С6Н5OCH2 | 1 | NC4H8O | 140 | 4,0 | 35,0 | 5,8 | 24,0 | 5,0 | 28,0 |
| (12) | С6Н5OCH2 | 0 | NC5H10 | 336 | 0,25 | 1344,0 | 1,0 | 230 | 0,5 | 460,0 |
| (13) | С6Н5OCH2 | 0 | NC4H8O | 274 | 39,0 | 7,0 | 12,9 | 21,2 | 38,0 | 7,2 |
| (16) | 2,4-Cl2-C6H4OCH2 | 1 | NC5H10 | 104 | 5,0 | 21,0 | 5,25 | 19,8 | 6,3 | 16,5 |
| (17) | 2,4-Cl2-C6H4OCH2 | 1 | NC4H8O | 180 | 1,6 | 112,0 | 2,0 | 90,0 | 2,6 | 69,2 |
| (18) | 2,4-Cl2-C6H4OCH2 | 0 | NC5H10 | 147 | 1,5 | 86,5 | 8,9 | 16,52 | 16,3 | 9,0 |
| Амиодарон | — | — | 430 | 6,5 | 66,0 | 4,2 | 102,4 | 5,0 | 86,0 | |
| Верапамил | — | — | 97 | — | — | 1,9 | 51,0 | 1,6 | 28,0 | |
| Пропранолол | — | — | 85 | 3,0 | 28,0 | — | — | 4,5 | 19,0 | |
| Новокаинамид | — | — | 300 | 14,0 | 21,0 | — | — | 13,3 | 22,5 | |
Примечание. ЛД50 — средняя летальная доза; ЭД50 — средняя эффективная доза; ЛД50/ЭД50 — антиаритмический индекс.
Аконитиновая модель аритмии на крысах линии Wistar. Первичная оценка антиаритмической активности новых оригинальных соединений класса N-(2-(2-(диалкиламино)этокси)этил)карбоксамидов выполнена на модели аконитиновой аритмии на наркотизированных уретаном (в/б, 1300 мг/кг) крысах линии Wistar (в/в 50 мкг/кг). Введение аконитина гидробромида вызывало желудочковую экстрасистолию, быстро переходящую в тахисистолию, трепетание, мерцание и фибрилляцию желудочков, приводящих более чем в 90% случаев к гибели животных, и продолжалось при отсутствии фибрилляции желудочков в среднем 49,3±10,4 мин [17]. Электрокардиограмма представлена на рис. 1, а.
Рис. 1. Электрокардиограммы (ЭКГ) крыс аконитиновой модели аритмии.
а — изменения ЭКГ у крысы после в/в введения аконитина гидробромида в дозе 50 мкг/кг; б — влияние соединения 12 в дозе 0,5 мг/кг на изменения показателей ЭКГ крысы после в/в введения аконитина в дозе 50 мкг/кг; в — влияние соединения 188 в дозе 2 мг/кг на изменения показателей ЭКГ крысы после в/в введения аконитина в дозе 50 мкг/кг.
Введение исследуемых соединений в диапазоне испытанных доз 1/100—1/10 от ЛД50 (для мышей при в/б введении) приводило к 30—100% выживаемости животных на модели аконитиновой аритмии. Изучаемые соединения в испытанных дозах увеличивали продолжительность латентного периода аритмии или полностью ее предотвращали ее развитие. ЭКГ представлены на рис. 1—3.
Рис. 2. ЭКГ крыс хлорид бариевой модели аритмии.
а — изменения ЭКГ у крысы после в/в введения BaCl2 в дозе 25 мг/кг; б — влияние Амиодарона в дозе 4 мг/кг на изменения показателей ЭКГ крысы после в/в введения BaCl2 в дозе 25 мг/кг; в — влияние соединения 12 в дозе 1 мг/кг на изменения показателей ЭКГ крысы после в/в введения BaCl2 в дозе 25 мг/кг.
Рис. 3. ЭКГ крыс хлорид кальциевой модели аритмии.
а — изменения ЭКГ у крысы после в/в введения CaCl2 в дозе 250 мг/кг; б — Влияние соединения 18 в дозе 1 мг/кг на изменения показателей ЭКГ крысы после в/в введения CaCl2 в дозе 250 мг/кг; в — влияние Верапамила в дозе 3 мг/кг на изменения показателей ЭКГ крысы после в/в введения CaCl2 в дозе 250 мг/кг; г — влияние соединения 12 в дозе 2 мг/кг на изменения показателей ЭКГ крысы после в/в введения CaCl2 в дозе 250 м.
На моделях аконитиновой аритмии у крыс ряд соединений в дозах до 6 мг/кг (соединения (12), (6), (18)) в 50—100% случаев снимает аритмии, вызванные введением аконитина гидробромида. Наименьшими средними эффективными дозами (ЭД50) характеризуются соединения (12), (17), (18).
Выявленные на модели аконитиновой аритмии антиаритмические свойства соединений были подтверждены также и на моделях хлоридбариевой и хлоридкальциевой аритмий. ЭКГ представлены на рис. 2, 3.
В связи с потенциальной перспективностью дальнейшей разработки лекарственных средств для лечения и профилактики нарушений сердечного ритма на основе отобранных при скрининге соединений представляло интерес изучение их токсикологических и некоторых фармакологических свойств. Для детального токсикологического изучения из класса N-(2-(диалкиламино)этокси)этил)карбоксамидов было отобрано одно из наиболее активных веществ по антиаритмическому действию — соединение 12.
Исследование фармакологических свойств соединений с выраженными антиаритмическими свойствами. При изучении действия отобранного соединения 12 на функциональное состояние ЦНС при воздействии анализаторов (этанол 40% 14 мл/кг и уретан 1500 мг/кг, мыши в/б) было установлено достоверное сокращение продолжительности наркотического сна (табл. 2).
Таблица 2. Фармакологическая активность соединения 12 класса N-(2-(диалкиламино)этокси)этил)карбоксамидов, обладающего наиболее выраженными антиаритмическими свойствами
| Фармакологический эффект | Соединение 12 |
| Влияние на параметры ЭКГ в дозах: | |
| ЭД50, 2ЭД50 | — |
| 5ЭД50 | — |
| 10ЭД50 | — |
| Влияние на ЦНС: | |
| Наркотическое действие: | |
| этанол 40% 14 мл/кг | ↓ |
| уретан 1500 мг/кг | ↓ |
| Противосудорожная активность: | |
| ареколин 0,1% 25 мг/кг | — |
| гармин 0,1% 10 мг/кг | — |
| Стереотипное поведение: | |
| апоморфин 2 мг/кг | — |
| никотин 7 мг/кг | — |
| анальгетическая активность | ↓ |
| влияние на функциональное состояние почек | — |
| влияние на артериальное давление | — |
Примечание. ЭКГ — электрокардиограмма; ЦНС — центральная нервная система; ЭД50 — средняя эффективная доза.
Результаты проведенных исследований показали, что активное соединение 12 не влияет на чувствительность М-холинорецепторов к ареколину, не изменяет длительность гиперкинезов, вызванных гармином. Также не приводит к изменению возникновения судорог под воздействием никотина, что может свидетельствовать об отсутствии влияния соединения на холинергическую нейропередачу. Введение исследуемого соединения не показало статистически значимого взаимодействия с апоморфином.
Также установлено, что исследуемое соединение 12 в испытанных дозах обладает слабо выраженной анальгетической активностью и не влияет на функциональное состояние почек у крыс в условиях водной нагрузки. Соединение 12 в антиаритмических дозах не оказывает заметного влияния на уровень артериального давления у ненаркотизированных крыс.
Полученные результаты с использованием метода элиминации токсического эффекта показали, что уровень остаточных доз активного соединения 12 класса N-(2-(диалкиламино)этокси)этил)карбоксамидов, соответствующие Т1/2, составляет 2,11 часа соответственно. К 5 ч наблюдения в организме мышей остается 0,4% соединения от введенной дозы.
В результате исследования субхронической токсичности активного соединения 12 установлено, что при введении крысам (в/б, масса тела 180,0—240,0 г.) в течение 1 мес в дозах 13 и 26 мг/кг (10- и 20-кратные предполагаемые высшие суточные дозы для человека) не установлено влияние на общее состояние и поведение животных, гематологические и биохимические показатели. Результаты макроскопического исследования в совокупности с результатами микроскопического анализа, установленные после окончания субхронического эксперимента, показали, что у животных не выявлено токсического поражения внутренних органов и признаков местноразражающего действия при длительном (1 месяц) в/б введении. При детальном токсикологическом изучении специфических видов токсичности соединения 12 не отмечено кумулятивных, мутагенных, иммунотоксичных и аллергизирующих свойств.
Заключение
Впервые синтезированные N-(2-(диалкиламино)этокси)этил)карбоксамиды обладают выраженными антиаритмическими свойствами, не уступающими по эффективности действия известным лекарственным средствам амиодарону, верапамилу и пропранололу. По сравнению с известными антиаритмиками они обладают меньшей токсичностью, большими терапевтическими индексами (ЛД50/ЭД50 и ЛД10/ЭД90) — важнейшими показателями, необходимыми для их дальнейшего изучения. На примере одного из выявленных наиболее эффективных по антиаритмическому действию веществ — соединению 12 — показана хорошая переносимость при в/б введении крысам в условиях одномесячного эксперимента в 10- и 20-кратных предполагаемых терапевтических дозах, отсутствие токсического повреждения внутренних органов и местнораздражающего действия. Соединение не обладает мутагенностью, иммунотоксичностью и аллергезирующими свойствами. Полученные данные о высокой антиаритмической активности и низкой токсичности впервые синтезированных N-(2-(диалкиламино)этокси)этил)карбоксамидов свидетельствуют о перспективности разработки на их основе лекарственных средств для профилактики и лечения нарушений сердечного ритма.
Результаты исследований подтверждены патентом на изобретение (№RU2712638), который был награжден Дипломом Федеральной службы по интеллектуальной собственности в номинации «100 лучших изобретений России за 2019 г. и первое полугодие 2020 г.».
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.