Введение

В развитии современной медицины все чаще прослеживается тенденция к персонализации, особенно заметная в сфере клеточной терапии. В связи с этим большой интерес представляют мезенхимные стромальные клетки (МСК), которые прочно удерживают лидирующие позиции в регенеративной медицине и успешно используются в терапии реакции «трансплантат против хозяина», аутоиммунных заболеваний, травм спинного мозга и большого количества других патологических состояний. Вместе с тем появляется все больше новых данных, свидетельствующих, что основная роль трансплантированных МСК сводится к секреции цитокинов и ростовых факторов, регулирующих регенеративные и репаративные процессы [1]. МСК традиционно изучают в прикладном аспекте, в то время как их естественная роль в организме недостаточно исследована, хотя это ключевой аспект для эффективного развития клеточной терапии.

Считается, что МСК являются своего рода «часовыми», контролирующими локальную микросреду вокруг поврежденных или воспаленных кровеносных сосудов, защищая их от чрезмерной реакции иммунной системы [2]. Эти уникальные клетки реагируют на стресс и дисфункциональные и потенциально разрушительные локальные события, изменяя свой секретом и тем самым способствуя восстановлению нормального гомеостаза [3]. Предполагается, что МСК могут «обучать» моноциты и макрофаги, вызывая генерацию T-регуляторных клеток, которые остаются в тканях в течение многих лет [4]. Кроме того, в последнее время появляется все больше данных, свидетельствующих об участии мезенхимальных клеток в образовании третичных лимфоидных структур (ТЛС) — эктопических некапсулированных лимфоидных агрегатов, формирующихся в условиях длительного (хронического) воспаления [5], что может иметь место практически в любых органах, включая атеросклеротические бляшки, сердце, почки, легкие, костный мозг, кишечник и центральную нервную систему. В данной работе мы сфокусировали внимание на воздействии воспалительного цитокина — фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-α) — на продукты секреции МСК. Это позволяет раскрыть новые аспекты их роли в процессах воспаления и иммунной защиты, а также открывает перспективные направления для терапевтических вмешательств.

Цель работы — изучение влияния ФНО-α на секрецию МСК жировой ткани факторов, регулирующих взаимодействие с лимфоцитами и образование ТЛС.

Материал и методы

Выделение МСК жировой ткани

МСК жировой ткани были выделены из подкожной жировой ткани в целом здоровых доноров в возрасте 21—55 лет, подвергавшихся хирургическим операциям по поводу травмы. Все доноры дали информированное согласие на экспериментальные манипуляции с образцами ткани в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава России от 19.06.03 №266. Доноры с инфекционными, системными заболеваниями или злокачественными новообразованиями не были включены в исследование. Ткань подкожной жировой клетчатки измельчали до размера 1—2 мм и инкубировали в растворе коллагеназы I (200 ед/мл) («Sigma-Aldrich», США) и диспазы (30 ед/мл) («Thermo Fisher Scientific Inc.», США) в течение 1 ч при 37 °С, затем клетки осаждали центрифугированием при 200 g в течение 10 мин, ресуспендировали в среде роста (DMEM low glucose/10% ФБС («Gibco», США)), пропускали через нейлоновое сито («BD Bioscience», США) с диаметром пор 40 мкм и высаживали на культуральные чашки Петри. Далее клетки культивировали в стандартных условиях (5% CO₂, 37 ^○C). На следующий день отмывали неприкрепившиеся клетки и среду заменяли на свежую. Смену среды проводили каждые 2—3 дня. По достижении 70% конфлюента клетки рассаживали в соотношении 1:3 с использованием 0,05% раствора трипсина/0,02% ЭДТА («ПанЭко», Россия). В экспериментах использовались клетки не старше 4-го пассажа.

Измерение концентрации цитокинов в кондиционированных средах МСК

Для изучения возможности влияния ФНО-α на профиль секреции клетки инкубировали в присутствии данного цитокина в концентрации 5 нг/мл в течение 18 ч (overnight), далее отмывали 3 раза средой культивирования и собирали кондиционированные среды через 24 ч. Определение концентрации цитокинов в кондиционированных средах клеток проводили с помощью набора MILLIPLEX MAP 41 Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel (HCYTMAG-60K-PX4141, «Merck», Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Предварительно готовили разведения смеси белковых стандартов и по 25 мкл каждого разведения стандарта, контрольных смесей (предоставлены производителем) и кондиционированных сред вносили в 96-луночный планшет в двух повторах. Затем в лунки вносили суспензию флюоресцентных магнитных микросфер, покрытых специфическими аналит-связывающими антителами. Планшет запечатывали фольгой и инкубировали в течение 18 ч при температуре +4 °C на орбитальном шейкере. После этого планшет промывали 3 раза, инкубировали с детектирующим конъюгированным с биотином антителом в течение 1 ч при комнатной температуре, затем промывали и инкубировали со стрептавидин-фикоэритрином еще 30 мин. Количественную оценку проводили с помощью флюоресцентного анализатора MAGPIX System («Luminex-Merck», Германия). Полученные данные оценивались с помощью программного обеспечения xPONENT 4.3.229.0. Концентрацию цитокинов (пг/мл) в кондиционированных средах определяли с помощью кривой зависимости средней интенсивности флюоресценции от концентрации стандарта.

Выделение внеклеточных везикул из кондиционированной среды МСК

Для начальной подготовки образцов кондиционированные среды очищали от остатков клеток и высокомолекулярных комплексов последовательным центрифугированием при +4 °С в течение 10 мин при 300 g, в течение 15 мин при 2000 g.

Далее для выделения внеклеточных везикул (ВВ) использовался коммерческий набор реактивов Exoquick TC («System Biosciences LLC», США, патент US20130337440A1). Режимы инкубации и центрифугирования осуществлялись согласно протоколам производителей.

Shotgun масс-спектрометрический анализ

К везикулам добавляли денатурирующий раствор (5 М мочевины, 15% ацетонитрила, 0,5% дезоксихолиевой кислоты натриевой соли, 300 мМ натрий-фосфатного буфера pH 6,0 и 5 мМ трихлорэтилфосфата). Смесь обрабатывали в ультразвуковой ванне (+45 °С, 30 мин), затем добавляли раствор 2% 4-винилпиридина в 30% пропан-2-оле (0,2%) и инкубировали при +22 °С 30 мин. Затем проводили трипсинолиз раствором трипсина (200 нг/мкл) в 30 мМ уксусной кислоты при соотношении трипсина к субстрату 1:50 (по массе) и инкубировали 4 ч при +38 °С. Реакцию останавливали добавлением муравьиной кислоты. После предварительного обогащения на колонке C-18 m-PrecolumnPepmap («Thermo Fisher Scientific Inc», США) проводили хроматографическое разделение пептидов на аналитической колонке C-18 AcclaimPepmap («Thermo Fisher Scientific Inc», США) в градиенте ацетонитрила. Масс-спектрометрический анализ проводили на гибридном орбитальном масс-спектрометре высокого разрешения с линейной ионной ловушкой OrbitrapFusion с системой высокоэффективной жидкостной хроматографии UltiMate 3000 Binarе RSLCnano, («Thermo Fisher Scientific Inc», США).

Идентификацию белков проводили с помощью программного обеспечения Search Gui 3.3 («Compomics», Бельгия) по поисковому алгоритму X!Tandem Vengeance 12.15.2. Количественный анализ проводился на основании показателя NSAF (нормированный показатель спектральной интенсивности) в выборке общих для группы проб белков после выравнивания по интенсивности опорных спектров. Анализ обнаруженных белков в терминах онтологии генов проводили с помощью Web-баз данных PANTHER version 11 и онлайн-платформы SRplot [6].

Результаты представлены как средние значения 3 независимых испытаний ± стандартные отклонения. Для расчета достоверности различий использовали двухвыборочный T-критерий с разной дисперсией выборок, принимая достоверными различия с вероятностью p<0,05.

Статистическая обработка данных

Результаты представлены как средние значения ± стандартные отклонения. Для расчета достоверности различий использовали критерий Уилкоксона, принимая достоверными различия с вероятностью p<0,05.

Результаты

Секреция широкого спектра биологически активных факторов является основной характеристикой МСК, определяющей их роль в естественных процессах репарации. Для анализа мы собирали кондиционированные среды МСК через 24 ч после инкубации с ФНО-α (5 нг/мл) и далее проводили мультиплексный иммунный анализ MAGPIX («Luminex Corporation», США). На рис. 1 представлен анализ изменения концентрации 15 цитокинов, играющих важную роль в регуляции функций лимфоцитов. Как видно из представленных данных, воздействие ФНО приводило к достоверному увеличению секреции ИЛ-2, ИЛ-7, ИЛ-10, ИЛ-12 (p40), ИЛ-12(p70), ИЛ-13, ИЛ-15, sCD40L, ИФН-α и -γ, CCL5/RANTES, а также лимфотоксина-α. Большинство этих цитокинов позитивно регулирует функции лимфоцитов: ИЛ-2 — основной активатор пролиферации T-лимфоцитов; ИЛ-12 (p40), ИЛ-12 (p70) — субъединицы ИЛ-12, который критичен для дифференцировки Th1-лимфоцитов; sCD40 — растворимая форма CD40-лиганда играет критическую роль в пролиферации B-лимфоцитов; ИЛ-7 важен для развития и пролиферации «наивных» лимфоцитов [7], CCL5/RANTES играет активную роль в привлечении лимфоцитов в очаг воспаления [8].

Рис. 1. Изменение секретома МСК в ответ на ФНО-α.

Данные мультиплексного иммунного анализа представлены как среднее значение концентрации в кондиционированной среде (пг/мл) ± стандартная ошибка среднего. Точки обозначают индивидуальные экспериментальные значения. Различия между группами указаны согласно критерию Уилкоксона.

При этом повышается секреция и антивоспалительных цитокинов — ИЛ-13 и ИЛ-10, последний обладает даже иммуносупрессивными свойствами.

Таким образом, инкубация с ФНО-α оказывает значительное влияние на секреторную активность МСК, усиливая секрецию цитокинов, поддерживающих функции лимфоцитов и воспалительный ответ. При этом возможность секреции этими клетками антивоспалительных цитокинов подчеркивает потенциал МСК как регуляторов иммунной системы, способных модулировать воспалительные и антивоспалительные реакции.

Недавно было обнаружено, что, помимо растворимых факторов, важную роль в межклеточной коммуникации играют микровезикулы, высвобождаемые клетками. Это расширило наше понимание возможностей межклеточной паракринной коммуникации. Везикулы могут переносить факторы роста и их рецепторы, биоактивные липиды и нуклеиновые кислоты — мРНК и микроРНК [9]. Их основное преимущество заключается в том, что содержимое защищено от разрушения двухслойной липидной мембраной и может переноситься на значительные расстояния внутри организма.

Для анализа белкового содержимого ВВ, секретируемых МСК, мы использовали масс-спектрометрический протеомный анализ. Преимуществом скрининговых методов анализа является то, что в короткий промежуток времени можно проанализировать большое количество факторов и выявить «дифференциально экспрессирующиеся белки-гены», а также провести статистический анализ всей выборки белков. Кроме того, такие методы лишены условностей, которые привносит в эксперимент произвольный выбор анализируемых генов/белков исследователем. Поэтому для осуществления комплексной и независимой от ожиданий исследователя оценки изменения содержания белков использовался метод Shotgun Label-free протеомики, основанный на идентификации белков в сложных смесях с использованием сочетания высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией. Метод позволяет не только определить наличие тех или иных белков в клетке, но и оценить их количество относительно общего клеточного белка.

Протеомный анализ позволил оценить экспрессию около 900 разных белков и 160 ВВ (рис. 2, а). При этом важно подчеркнуть, что с помощью масс-спектрометрического анализа клеток не удастся детектировать все белки клетки, например секретируемые молекулы или белки с несколькими трансмембранными участками. Между тем секретом МСК опосредует большую часть их иммунномодулирующего и регенеративного влияния, поэтому мы проводили данный эксперимент в дополнение к анализу секретома. Как видно из рис. 2, а, инкубация с ФНО-α вызывает существенные изменения качественного состава белков как в клетках, так и во ВВ. Например, 160 белков были обнаружены только в клетках после обработки ФНО-α. ВВ отличаются между собой значительно меньше — только 32 белка обнаруживаются исключительно во ВВ от клеток, обработанных ФНО-α.

Рис. 2. Анализ белкового состава ВВ.

а — диаграмма Венна суммирует количество белков, которые различаются между ВВ из обработанных ФНО-α МСК по сравнению с ВВ от интактных клеток, а также между клетками; б — распределение всех обнаруженных во ВВ белков по классам, по данным PANTHER Protein Class ontology [11].

Кроме того, во ВВ были обнаружены такие характерные белки ВВ, как 14-3-3 zeta/delta, пируваткиназа PKM (P11980), лактатдегидрогеназа LDHA (B5DEN4), фосфоглицерат киназа Pgk1 (P16617), енолаза Eno1 (P04764), аннексины 1, 2, 5, белки теплового шока HSP27 (HSPB1), HSP 90 и HSC70 (HSPA8), Rab ГТФазы 7A и 11A, моэзин и MHC class I HLA-A [10].

Суммарно во ВВ было обнаружено 150—160 разных белков, принадлежащих к 20 разным классам (рис. 2, б). При этом большинство (22%) относительно всех идентифицированных белков составили белки цитоскелета. Второе место (16%) заняли белки, которые в настоящем исследовании не удалось отнести к какому-то общему классу, на третьем месте — метаболические ферменты (13%).

Аннотация белков в терминах онтологии генов (GO) в разделе «Биологические процессы» показала, что большая часть белков ВВ, содержание которых увеличивается при инкубации с ФНО-α, попадает в смежные категории «организация актиновых филаментов» и «регуляция организации супрамолекулярных фибрилл» (TPM2/PLS3/SPTAN1/ACTG1/CAP1/ARPC3/CAPG/MYO1C/WDR1/RPS3/HSPA8). Также увеличивается содержание белков в категориях «ответ на окислительный стресс» (ANXA1/RPS3/EEF2/HSPB1/NONO/PDE8A), «биосинтез ДНК» (CCT2/HNRNPA2B1/TCP1/PPIA/CCT5/HNRNPC) и «фолдинг белков» (CCT2/TCP1/PPIA/CCT5/HSPA8/HSPB1/PPIB). При этом часть белков в этих категориях пересекается. Сильнее всего уменьшается содержание белков из категории «катаболизм мРНК» (RPS3A/RPL14/PSMA6/RPS15A/HNRNPM/RNH1/RPL12/RPS12).

Онтологический анализ по разделу «Молекулярные функции» показал, что при инкубации с ФНО-α происходят изменения белкового состава, при этом выделяются 2 большие группы, подвергшиеся изменению по сравнению с интактными МСК, — белки, связанные с цитоскелетом, и белки, связанные с фолдингом и процессингом белков.

Анализ содержания белков, связанных с тем или иным метаболическим путем, на основе базы данных KEGG выявил, что сильнее всего изменяется содержание белков внеклеточного матрикса и связанных с цитоскелетом (FN1/COL6A3/VCL/ACTG1/PARVA/PRKCB/ARPC3) и поэтому потенциально опосредующих такие функции, как «фокальная адгезия», «регуляция актинового цитоскелета», «трансэндотелиальная миграция» и др. (рис. 3). Стоит отметить, что именно содержание фибронектина и коллагена 6-го типа FN1/COL6A3 изменялось после инкубации с ФНО-α сильнее всех остальных белков в количественном отношении — в 9 и 3 раза соответственно. Наиболее выраженное снижение содержания во ВВ показали белки, участвующие в гликолизе (GAPDH/ALDOA/PGAM1/PGK1) и сборке рибосом (RPS3A/RPL14/RPS15A/RPL12/RPS12).

Рис. 3. Результаты анализа белков, обнаруженных в ВВ, в терминах онтологии генов GO.

Для анализа были отобраны белки, содержание которых во ВВ увеличивается более чем в 1,5 раза (оттенки красного) или уменьшается более чем в 0,6 раза (оттенки синего) после инкубации с ФНО-α. Аннотация в терминах онтологии генов была произведена с помощью алгоритма SRplot [6] по типам онтологий: а — GO_BiologicalProcess (биологический процесс); б — GO_MolecularFunction (молекулярная функция); в — KEGG Pathway (сигнальные пути). Размер точек на графике соответствует количеству белков в каждой категории.

Обсуждение

МСК активно реагируют на воспалительные процессы в тканях, играя решающую роль в их регенерации и поддержании гомеостаза. Они известны своими выраженными иммуномодулирующими свойствами, во многом зависящими от воспаления. МСК могут динамично реагировать на воспаление, усиливая или подавляя иммунный ответ в зависимости от контекста.

В большинстве органов ТЛС образуются в периваскулярных областях [12]. Периваскулярные области в разных органах могут служить нишей для нескольких типов клеток, участвующих в формировании и поддержании ТЛС, — фибробластов [13] и стромально-васкулярных PDGFRβ+ клеток [14].

Присутствие МСК при образовании ТЛС было показано на модели волчаночного гломерулонефрита мыши. Авторы предположили, что МСК могут играть решающую роль как клетки-организаторы лимфоидной ткани в запуске формирования ТЛС в условиях хронического воспаления [5].

Артериальные третичные лимфоидные органы — особый тип ТЛС, связанный с атеросклерозом — характеризуются разной степенью сложности и находятся в соединительной ткани, окружающей пораженные артерии, особенно в адвентиции. Работы D. Hu и соавт. [15] и S. Mohanta и соавт. [16] подчеркнули критическую роль третичных лимфоидных органов артерий в контроле иммунитета аорты и защите от атеросклероза.

Молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования артериальных третичных лимфоидных органов при атеросклерозе, пока не полностью поняты. Предполагается, что гладкомышечные клетки стенки сосудов могут принимать черты клеток, подобных организаторам лимфоидной ткани, и участвовать в организации ТЛС [17].

Мы предполагаем, что МСК периваскулярной ниши или стенки сосуда могут вносить вклад в формирование третичных лимфоидных органов в условиях атеросклероза. Эта гипотеза основана на многогранных функциях МСК в регуляции иммунной системы и восстановлении тканей, а также на их стратегическом расположении в сосудистых областях, которые являются ключевыми местами для формирования ТЛС при атеросклерозе. ФНО-α известен как цитокин, участвующий в развитии ТЛС, а также как регулятор функций МСК. Мы показали, что ФНО-α, но не липополисахарид, способен индуцировать в МСК секрецию лимфотоксина-α — другого члена семейства ФНО, который играет критическую роль в образовании и поддержании ТЛС [18].

Инкубация МСК в присутствии ФНО-α с приводит также к увеличению секреции двух других цитокинов, для которых показана важнейшая роль в организации ТЛС, — ИФН-γ и ИЛ-7 [19]. Кроме того, усиливается секреция ИЛ-2, обеспечивающего поддержание пролиферации лимфоцитов, что составляет основную функцию стромальных клеток в ТЛС. Таким образом, можно сделать вывод, что инкубация МСК с ФНО-α в достаточно большой концентрации повышает секрецию ими ряда цитокинов, регулирующих функции лимфоцитов, в том числе влияющих на образование ТЛС. Онтологический анализ другого важного компонента секретома — ВВ — выявил изменения содержания большого количества белков, связанных с цитоскелетом и смежными процессами — адгезией, регуляцией трансэндотелиальной миграции лейкоцитов, хемотаксисом. Можно сделать предположение, что захват ВВ лейкоцитами может оказать влияние на межклеточное взаимодействие с МСК, особенно учитывая тот факт, что ФНО-α значительно усиливает экспрессию молекулы межклеточной адгезии ICAM1 на самих МСК. Также интересно отметить увеличение содержания во ВВ белков, отвечающих за окислительный стресс и фолдинг белков, что теоретически может обеспечивать передачу защитных антистрессорных факторов. Кроме того, инкубация с ФНО-α приводит к снижению содержания RNH1 — ингибиторного компонента саморегулирующейся системы ангиогенин (ANG)-ингибитор рибонуклеазы (RNH1) и в клетках, и во ВВ. Ангиогенин известен как мощный индуктор ангиогенеза [20]. Дополнительно мы обнаружили увеличение содержания HSP27, который является проангиогенным фактором и участвует в сигналинге VEGF [21], и миоферлина (MYOF), который образует комплекс с рецептором VEGF VEGFR2 и защищает его от протеасомной деградации [22]. Таким образом, можно предположить, что ВВ от МСК после инкубации с ФНО-α могут обладать проангиогенным эффектом.

Заключение

Характеризуя в целом ответ МСК на стимуляцию ФНО, следует, прежде всего, отметить его комплексный характер. С одной стороны, он направлен на стимуляцию активности иммунных клеток, что облегчает формирование лимфоидных органоидов. С другой стороны, в процессе стимуляции активируются также механизмы, направленные на поддержание клеточного гомеостаза в условиях воспаления, необходимое как для клеток в составе ТЛС, так и для самих МСК. Дальнейшее выяснение этих механизмов должно способствовать разработке путей терапевтического воздействия на активность МСК в условиях нормы и патологии.

Финансирование. Финансирование исследования осуществлялось за счет средств гранта Российского научного фонда №23-25-00546.

Financing. The research was funded by the Russian Science Foundation grant No. 23-25-00546.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.